分子細胞遺傳學診斷技術簡介

熒光原位雜交技術（FISH)快速產前診斷常見非整倍體熒光原位雜交技術(FISH)診斷DiGeorge/VCFS綜合征光譜核型分析技術（SKY)檢測染色體異常aCGH快速檢測間期細胞全基因組拷貝數熒光原位雜交技術快速產前診斷常見非整倍體項目概述

出生缺陷是影響人口素質的重大問題，每年估計有80～100萬出生缺陷兒誕生，給家庭和社會帶來沉重的負擔。70%的出生缺陷是遺傳因素所致，染色體非整倍體異常最常見，如常染色體異常13、18、21三體等及性染色體異常Turner綜合征、Klinefelter綜合征等。其中最常見的是21三體綜合征又稱唐氏綜合征(DS)，新生兒的發病率高達1/800。項目概述

產前診斷是避免異常患兒出生的的重要技術手段。傳統的核型分析方法是國內外公認診斷染色體病的金標準。然而,標準的核型分析必須對細胞經過數天培養，耗時過長，操作復雜。FISH解除了傳統細胞學的限制，能夠在短至24小時的時間排除占活嬰染色體異常的95%的五種常見異常，對于檢查者無疑是一大福音。適應癥（1）孕婦年齡大于等于35歲。（2）孕婦曾經生育過染色體異常患者史。（3）夫婦一方有染色體結構異常者。（4）母血清生化篩查高風險。（5）超生檢查發現胎兒異常。技術原理

熒光原位雜交技術（flourescenceinsituhybridizationFISH）為分子生物學（探針）與細胞遺傳學（染色體）的結合。FISH技術是指將熒光標記的染色體區帶特異性的DNA作為探針，與分裂期或間期細胞原位雜交于熒光顯微鏡下觀察染色體畸變的技術。技術優勢

重復性好、穩定；高靈敏性及特異性；可用于間期細胞，不需要細胞培養；目前，FISH已成為一種常見檢測手段，國外廣泛地用于產前、產后遺傳病診斷及血液腫瘤、實體瘤等方面的檢測。在歐美發達國家應用FISH產前診斷檢測染色體異常占30-40%。技術原理與方法

產前診斷檢測非整倍體需要21、13、18、X和Y染色體上的五種探針。其中21號和13號染色體檢測探針列為一組，為位點特異探針，分別用Rhodamine(紅色和FITC(綠色)標記。18號、X和Y染色體探針列為一組，為染色體著絲粒特異性重復序列探針,分別用DEAC(藍色)FITC(綠色)和Rhodamine(紅色)標記。檢測正常結果

異常結果21三體18三體技術難點

試劑的離子成分和PH值對雜交的好壞有直接的影響。因而在實驗的試劑配置準備過程中要注意使用超純水進行配置，同時配好的試劑要使用PH試紙或PH儀校準。細胞質較多時也會引起雜交率低下，信號弱，因而在實驗操作時應特別注意消化時間的掌握。熒光原位雜交技術檢測DiGeorge/VCFS綜合征

臨床指征（包括兒童及胎兒）圓錐動脈干畸形,如法洛四聯癥,肺動脈閉鎖/室間隔缺損,右室雙出口,永存主動脈干,以及B型主動脈弓離斷；異常面容；胸腺發育不良；腭裂；低鈣血癥；DiGeorge/VCFS綜合征DiGeorge/VCFS綜合征臨床特征包括心臟畸形（錐干部畸形為主）、T細胞功能缺陷、腭裂、異常面容和低鈣血癥。該綜合征涉及多個基因的缺失,而TBX1基因可能是主要致病基因。這些基因的丟失影響了胚胎期心臟神經嵴細胞的正常功能,從而造成出生后神經嵴相關組織(胸腺,腭,圓錐動脈干)的畸形。DiGeorge/VCFS綜合征

DiGeorge綜合征或Velocardiofacial（VCFS)綜合征，是由于22號染色體長臂近著絲粒端微片段缺失引起的遺傳綜合征。在活產胎兒兒中發生率約1/4000，是造成小兒先天性心臟病最常見的單一基因因素。群體檢測證實近90％DiGeorge綜合癥病人和約85％VCFS綜合癥病人存在22q11微缺失。

項目概述

目前世界上唯一有效的方法就是手術治療。DiGeorge/VCFS綜合征綜合征除了先心病（CHD）最容易早期發現外，其他異常(如低鈣血癥、細胞免疫功能缺陷、氣管支氣管畸形等)則相對隱匿。此類CHD患者如不能早期診斷與適當干預，手術時則可能發生難以預測的感染、心臟停搏、呼吸衰竭等，手術風險大大增加，預后不良。因此，如能通過本項目確診早期干預，其社會和經濟效益是顯而易見的。

項目概述

此外，該綜合征還經常合并智力障礙及認知功能障礙和精神行為異常，嚴重影響生活質量，給社會和家庭造成的經濟和精神損失是巨大的。為此常推薦終止妊娠。進行22q11微缺失檢測，可以幫助準確產前咨詢，為孕婦決定終止妊娠提供全面充分的證據。目前國外此項檢查常規開展，國內也有部分單位已經開展。技術方法

檢測DiGeorge/VCFS綜合征需要22號長臂上的一組探針，分別為GLPTUPLE1和GLPARSA。該方法只能檢測出DiGeorge/VCFS綜合征最常見的缺失，對于少數患者發生其他缺失或易位不能檢出。應用范圍及意義通過羊水檢測判斷胎兒發生先心病的情況。檢測患有先心病的新生兒及兒童，明確病因。生育過先天性心臟病患兒父母進行檢測，可以預測下一胎兒患先心病的可能性。光譜核型分析技術檢測染色體異常

項目概述

染色體畸變80%為染色體數目異常，其次為染色體結構重排、丟失、重復、平衡或非平衡易位、嵌合體、標記染色體等。染色體病患者大多有嚴重的智力障礙、生長發育遲緩和某些組織器官畸形等，同時染色體畸變也是導致妊娠早期自然流產和不孕不育的重要原因，且目前尚無有效地治療方案。準確地對染色體病進行診斷和產前診斷，有利于控制出生缺陷，指導遺傳咨詢和評估預后。項目概述傳統的染色體畸變診斷方法為G顯帶染色體核型分析，可以觀察染色體的數目和整套染色體的主要帶形，其分辨率約為350—450個染色體條帶。但對于標記染色體（來源不明的染色體）、復雜的染色體易位或重排，以及微小的染色體結構畸變則難以進行準確的分析。項目概述光譜核型分析技術（spectralkaryotyping,SKY）是1996年發展起來的一種將光譜干涉成像技術與FISH相結合的細胞遺傳學檢查的新技術；使24種染色體同時以不同的顏色顯示出來，染色體之間的易位可以很直接地觀察到；SKY的分辨率較高，可達1.5MbDNA；而常規的G顯帶核型分析技術對小于5-10MbDNA則難以分辨了。

項目概述SKY在診斷標記染色體、復雜的染色體易位或重排，以及微小的染色體結構畸變等方面有較大的優勢，逐漸在臨床疑難染色體病的診斷和產前診斷、植入前遺傳學診斷以及腫瘤遺傳學領域得到了廣泛應用,為臨床染色體病的診斷、處理、預后評估和遺傳咨詢提供依據。適應癥常規G顯帶染色體檢查顯示復雜染色體易位、標記染色體、衍生染色體；具有臨床表現而常規核型分析技術未發現異常的病例禁忌癥對于一條染色體中發生的倒位、重復、缺失，因無色彩的變化，SKY不能直接檢出；不能精確判斷染色體畸變的斷裂點（即區帶）；光譜核型分析技術

（spectralkaryotyping,SKY）基本原理用5種不同的熒光素或其組合標記出不同的24種人類染色體涂染探針，然后將不同標記的24種探針同時與中期染色體進行原位抑制雜交。通過Fourier分光鏡、CCD成像和光學顯微鏡捕捉和測量所有染料被激發后產生的發射光譜，按照一種光譜分類算法將一特定的分類色（假顏色）分配到所有的人類染色體上，然后通過計算機成像軟件分析，使不同的染色體顯示出不同的假顏色，從而進行核型分析。t(9;11)G-bandSKY技術難點

玻片標本質量的好壞和玻片變性時間的控制是SKY實驗成功的關鍵。制備本底干凈、核型分布好、沒有胞漿的標本，選擇較好的變性時間。技術局限

對微小的標記染色體進行檢測時，由于熒光閃爍可能會出現顏色混雜現象，需要相應的FISH進行進一步鑒定，以明確診斷。試劑及設備成本高。aCGH快速檢測間期細胞全基因組拷貝數21世紀細胞遺傳學的革命–aCGH簡稱：aCGH英文名：array-comparativegenomichybridization；MicroarraybasedComparativeGenomicHybridization）中文名：微陣列-比較基因組雜交aCGH適用范圍aCGH將作為染色體分析的一種選擇方法，替代FISH和許多標準染色體組型分析，其也可用于檢測各種樣本上的拷貝數變化。aCGH是一種高尖端技術，廣泛應用于產前和產后診斷、植入前診斷、癌癥診斷和預后、個體化治療、干細胞和細胞系研究、藥物發現等領域。aCGH革命主觀的G-Banding“低”分辨率全基因組=+=高分辨率FISH=+靶基因=勞動強度大，耗時客觀的全基因組

高分辨率aCGH=+=aCGH工作流程

步驟1：從質控和實驗組織上提取基因組DNA。必要時擴增。步驟2：使用青色素-3dCTP和青色素-5dCTP以區分標記檢測DNA和參考DNA。步驟3：將標記DNA與芯片R雜交。步驟4：使用掃描儀和軟件對芯片信號進行掃描和分析。

試驗方案要求時間為小于兩個工作日。結果可在36hr內收到。不需要細胞培養，也不需要在載玻片上進行冗長的中期染色體制備。工作原理示意圖直接比較兩個經過不同標記基因組之間DNA拷貝數的差異。

aCGH提供客觀和定量的結果SpectralWare?softwareprovidesavisualrepresentationofthedatageneratedfromthemicroarray

PerkinelmeraCGH技術----靶陣列或全基因組陣列設計，您的選擇！

TargetedaCGH

對已知病癥提供清晰的信號避免實驗室反復用FISH方法來進行實驗診斷結果易懂將錯失不覆蓋區域的基因缺失和增加如果病人有明顯的綜合病癥，染色體分析或FISH可能更適合WholegenomeaCGH廣泛覆蓋基因，1MB分辨率發現新易感基因更多的噪信號數據難以解釋和理解靶向芯片的臨床應用在實際的臨床分子細胞遺傳學領域中，靶向微陣列最受歡迎，因為它基本涵蓋基因組中所有已知的重大臨床意義的特定區域，在應用中可以達到最佳的平衡：最大限度地檢測與臨床有關的染色體不平衡異常，又能夠盡可能地減少涵蓋人類基因組中多態性拷貝數變異（CNVs）的數量。靶向芯片可檢測40幾種微缺失綜合征1p36先天性腎上腺發育不良癥Alagille綜合征安琪兒綜合征無精子因子A無精子因子B無精子因子CBruton酪氨酸激酶巨大舌-臍膨出綜合征1A型腓骨肌萎縮癥貓鳴癥侯群DiGeorge1/VCF綜合征DiGeorge2=10p13唐氏綜合征Duchenne肌肉萎縮癥甘油激酶缺乏癥Greig綜合征[GLI3]遺傳性壓迫易感性神經病甲狀旁腺功能不全、感音神經性聾和腎發育不良卡爾曼綜合征Langer-Giedion綜合征[EXT1andTRPSI]敏-迪綜合征Potocki-Shaffer癥侯群[包括多發性外生軟骨瘤2]神經纖維瘤病1佩-梅病I型多囊腎疾病Prader-Willi綜合征視網膜母細胞瘤1Rubinstein-Taybi氏癥侯群Saethre-Chotzen綜合征Y染色體性別決定區Smith-Magenis綜合征Sotos綜合征固醇硫酸酶缺乏癥毛發-鼻-指（趾）綜合征結節性硬化癥1威廉斯綜合征腎母細胞瘤威爾姆氏腫瘤Wolf-Hirschhorn癥侯群aCGH優越性：

一種極高的分辨率的染色體分析方法，提供G-