實驗五

稠環芳烴的高效液相色譜法分析及柱效能評價實驗講解要點一、高效液相色譜法特點和優點二、高效液相色譜法按分離機制分類三、反相色譜法及分離原理四、HPLC和GC法的比較五、高效液相色譜儀的基本組成與作用六、高效液相色譜的定性與定量七、使用高效液相色譜儀注意事項八、實驗部分

HPLC有以下特點：

高壓-壓力可達150~300Kg/cm2。

高速-流速為0.1~10.0ml/min。

高效-可達5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達100種。

高靈敏度-紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。HPLC與經典液相色譜相比有以下優點：速度快-通常分析一個樣品在15~30min，有些樣品甚至在5min內即可完成。分辨率高-可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。靈敏度高-紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學檢測器可達0.1pg。柱子可反復使用-用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣品量少，容易回收-樣品經過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。

一、HPLC的特點和優點二、高效液相色譜法按分離機制的不同分為：液固吸附色譜法

液液分配色譜法（正相與反相）離子交換色譜法離子對色譜法分子排阻色譜法液液色譜法現在多采用的是化學鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。

四、反相色譜法及分離原理

正相色譜法采用固定相為極性的，流動相為相對非極性的疏水性溶劑反相色譜法及分離原理一般用非極性的十八烷基鍵合相（ODS）為固定相，極性的水或緩沖液中加入甲醇、乙腈、丙酮等有機溶劑（有機溶劑以調節保留時間）為流動相，在反相色譜法分離中極性大的化合物先留出，碳原子數少的樣品先流出。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。反相色譜法在現代液相色譜中占整個HPLC應用的80%左右。高效液相色譜與氣相色譜峰異同點

HPLC

流動相：液體液體粘度大，擴散系數小流動相可廣泛選擇，并可配成多元體系，因此分辨率高高效液相色譜采用5～10um細顆粒固定相，流動相通透性小，必須用高壓輸送。應用更廣，有機物75～85%可采用

高效液相色譜法進行分離。適應于高沸點難揮發，熱穩定性差的物質高靈敏度，可檢測ng/ml樣品。

GC流動相：載氣氣體粘度小，擴散系數大，流動相選擇余地小不用高壓泵輸送只有25%只有有機物能用GC進行分離適應于易揮發、較低沸點，熱穩定性好的物質靈敏度高，可檢測ng/ml樣品高效液相色譜儀的基本組成一、高壓輸送系統二、進樣系統三、分離系統四、檢測系統五、數據處理系統色譜柱恒溫器連接管高效液相色譜儀結構

色譜軟件，HPLC輸出接口與色譜系統聯用檢測器進樣口注射器進樣閥溶液儲存器高壓輸液泵梯度洗脫系統高壓輸液系統進樣系統分離系統檢測系統數據處理系統

高效液相色譜流程示意圖一、高壓輸送系統二、進樣系統三、分離系統四、檢測系統五、數據處理系統高壓泵工作原理（單向閥）六通閥工作原理（流路切換）六通閥工作原理（流路切換）高壓泵工作原理（單向閥）六通閥工作原理（流路切換）

高效液相色譜的定性與定量定性的方法：采用保留值定性，在實驗條件相同（如溫度、流動相比例等）的條件下，將未知物的保留時間與已知純物質的保留時間對比而進行定性分析定量的方法：采用峰面積的歸一化法，內標法(內標校正因子法，內標工作曲線法和內標對比法)，外標法和（工作曲線法和外標一點法）標準加入法定量。外標法進行定量時不需要考慮校正因子，可根據試樣的峰面積(Ai)和已知含量的標樣中組分的峰面積(As)，求得樣品的含量。XsAiXi(%)=×100%As歸一化法所有組分必須在一個分析組分里面均流出色譜柱，但簡便，定量結果與進樣量無關，操作條件變化對結果影響較小。AifiWi（%）=×100%A1f1+A2f2+…+Anfn六、實驗部分色譜實驗條件HPLC儀Waters515型Waters2487紫外檢測器色譜柱：WatersC18(4.6×250mm,)流動相：CH3OH-H2O(85/15,v/v)流速：1mL/min檢測波長：254nm進樣體積：20ul1流動相的配制、過濾和除氣

2標準曲線制備三組分混標液：每mL溶液分別約含0.5mg苯、萘和聯苯。取2μL、5μL、10μL、20μL混標進樣，以峰面積對進樣量作標曲（要求相關系數大于0.99）。3樣品分析:20uL未知樣品進樣,外標法和歸一化法定量實驗內容與主要步驟1更換流動相。2開動儀器，讓色譜柱平衡。3設置色譜工作站參數。4進樣、采集色譜圖。1）三組分混標液2）標準溶液系列3）未知樣品5色譜數據分析，打印色譜圖及分析報告。6更換甲醇流動相，清洗色譜柱。7關閉儀器。數據及處理1、記錄實驗條件：色譜柱與固定相，流動相與流量，進樣量2、測量各色譜峰中苯、萘、聯苯等的保留時間tR及相應色譜峰寬W,計算各對應的理論塔板數n、分離度R等（也可用軟件直接操作）3、將不同含量混標液為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標作圖求標準曲線方程，測定未知樣品的峰面積代入標準曲線方程，求樣品的濃度。4、用步驟2中一個實驗點結果，以苯為基準物，求出其組分的相對校正因子，用歸一化法定量計算。使用高效液相色譜儀的注意事項1HPLC的日常操作條件工作溫度10～30℃；相對濕度<80％；最好是恒溫、恒濕，遠離高電干擾、高振動設備。2泵的保養流動相要清潔；進液處過濾頭要經常清洗；流動相交換時要防止沉淀；避免泵內堵塞或有氣泡。3進樣器的保養每次分析結束后，要反復沖洗進樣口，防止樣品的交叉污染。4柱的保養柱