發酵工程碩士論文申請學位學科專業：發酵工程摘要谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽化合物，具有去除自由基、解毒、抑制衰老、預防糖尿病和癌癥、抑制艾滋病毒、提高人體免疫力等重要生理功能，在醫學、食品、化裝品等領域具有廣泛的市場前景。現有GSH生產能力遠不能滿足市場需求，所以采用GSH高產菌株發酵廉價原料轉化為GSH，建立適合工業化別離純化GSH的方法會帶來巨大的社會和經濟效益。本文以富含GSH的啤酒酵母Y-14為材料，分別從以下四個方面進行研究：(1)利用Plackett-Burman試驗設計、Box-Behnken試驗設計法對啤酒酵母Y-14產GSH培養基進行優化，得到的最適培養基配方為:葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO48g/L，KH2PO43g/L，MgSO40.15g/L。對優化結果進行驗證(2)利用單因素試驗對啤酒酵母Y-14產GSH發酵條件進行研究，結果得到搖瓶最適發酵條件為培養溫度30℃、初始pH6.0、搖床轉速180rpm、搖瓶裝液量30mL/300mL、補料培養基添加時間20h。在此條件下，菌體胞內GSH含量到達31.56mg/g，GSH的產量可達249.2mg/L，較原來提高了102%。(3)利用10L自動發酵罐補料培養啤酒酵母Y-14，①采用恒速流加單一葡萄糖培養基，20h時添加前體氨基酸和ATP的方法，測得GSH的產量在52h時，到達最大值243mg/L。②采用恒速流加全營養培養基，36h時添加補料培養基的方法，測得GSH產量在52h到達最大值520.742mg/L。比擬發現，第二批發酵罐培養菌體干重、GSH產量較第一批分別提高了122.5%、114.2%。(4)采用D001大孔樹脂粗別離GSH，得到最正確別離條件為：上樣pH3.0，濃度為61.4mg/100mL，流速為0.5mL/min，洗雜質用液為無水乙醇，洗脫液為1.5%HCl+0.3mol/LNaCl，流速為3mL/min。GSH的平均收得率為69.11%，蛋白質去除率為64.8%。然后通過SephadexG-10脫鹽純化GSH，得到最適條件：Φ1.6cm×25cm玻璃層析柱，上樣濃度為116.66mg/100mL，上樣體積為20mL。結果GSH的平均收得率為96.21%。最后SephadexG-10分級別離純化GSH，采用Φ1.6cm×50cm玻璃層析柱，最適上樣體積為2mL，GSH的平均收得率為99.26%，蛋白質去除率為56.5%。GSH濃縮倍數平均為9.07倍，純化倍數為8.67倍。關鍵詞：啤酒酵母Y-14，谷胱甘肽，發酵罐，D001大孔樹脂，SephadexG-10

AbstractGlutathione(GSH)isatripeptideformedbyglutamicacid,cysteineandglycin,ithasimportantphysiologicalfunctionssuchasremovingfreeradical,detoxification,anti-aging,diabetesandcancerprevention,inhibitionofHIVandimprovetheeffectivenessofthehumanimmunesystem,andhasawiderangeofmarketprospectsinthefieldsofmedical,foodandcosmetics.ButtheexistingproductioncapacityofGSHisfarfromthemarketdemand.UsemicrobialfermentationtotranslatecheaprawmaterialsintohighyieldedGSH,andestablishsuitableindustrializationseparationandpurificationofGSHwillbringenormoussocialandeconomicbenefits.Inthispaper,themainresearchcontentandresultsareasfollows:(1)UsingPlackett-BurmanandBox-BehnkenexperimentaldesignoptimizedmediumofSaccharomycescerevisiaeY-14whichproducingGSH.Theoptimummediumwasglucose20g/mL,yeastextract10g/mL,(NH4)2SO48g/mL,KH2PO43g/mL,MgSO40.15g/mL.TheoptimumexperimentshowedthatGSHyieldreachedto124.77mg/L.(2)UsingsinglefactorteststudiedthefermentationconditionsofyeastY-14producingGSH.Theoptimumshake-flaskfermentationconditionswasculturetemperature30℃,initialpH6.0,shakespeed180rpm,liquidvolume30mL/300mL,mediumbatchaddtime20h.GSHcontentreachedto31.56mg/g,GSHyieldreachedto249.2mg/L,increased102%comparetotheoriginal.(3)Using10Lautomatedfermentor,①usingsingleconstantspeedfedglucosemedium,addedprecursorsofaminoacidsandATPat20h,andtheGSHyieldreachedtomaximum243mg/Lat52h.②usingconstantflowincreasestotalnutrientmedium,addedfedmediumat36h,GSHyieldmaximumreachedto520.742mg/L.ItshowedthatdrycellweightandGSHyieldincreased122.5%and114.2%respectivelycomparedtothefirstfermentorcultivation.

(4)UsingD001macroporousresinroughtoseparateGSH,theoptimumseparationconditionswas:samplepH3.0,sampleconcentrationwas61.4mg/100mL,sampleflowrateof0.5mL/min,impuritieswashingliquidwasabsolutealcohol,eluatewas1.5%HCland0.3mol/LNaCl,elutionflowratewas3mL/min,theaverageyieldofGSHwas69.11%,proteinremovalratewas64.8%.ThenusingSephadexG-10todesaltandpurifyGSH,theoptimumconditionswas:Φ1.6cm×25cmchromatographycolumns,sampleconcentrationwas116.66mg/100mL,samplevolumewas20mL.TheaverageyieldofGSHwas96.21%.Intheend,usingSephadexG-10topurifyGSH,usingΦ1.6cm×50cmchromatographycolumns,theoptimumsamplevolumewas2mL,theaverageyieldofGSHwas99.26%,proteinremovalratewas56.5%.Theaverageofconcentrationmultipleandpurificationmultiplewas9.07and8.67respectively.Keywords：SaccharomycescerevisiaeY-14,Glutathione,Fermentor,D001macroporousresin,SephadexG-10

目錄摘要 IAbstract II目錄 III第1章引言 11.1谷胱甘肽概述 11.1.1谷胱甘肽結構和性質 11.1.2谷胱甘肽的生理功能及其應用 31.2發酵法生產谷胱甘肽的國內外研究動態 41.3本研究的意義、目的及內容 91.3.1意義 91.3.2目的 91.3.3研究內容 101.4常用研究指標的說明 10第2章啤酒酵母Y-14發酵GSH培養基的優化 112.1材料 112.1.1菌種： 112.1.2培養基： 112.1.3主要試劑 122.1.4主要儀器 122.2方法 122.2.1菌株活化 132.2.2種子搖瓶培養 132.2.3搖瓶發酵培養 132.2.4菌種的保藏 132.2.5DTNB法檢測GSH含量 132.2.6試驗設計方法 132.3結果與分析 142.3.1顯著影響因素的篩選結果 142.3.2Box-Behnken設計進一步優化培養基試驗結果 162.4結論 19第3章啤酒酵母Y-14產GSH發酵條件的優化 203.1材料 203.1.1菌種： 203.1.2培養基： 203.1.3主要試劑 213.1.4主要儀器 213.2方法 213.2.1啤酒酵母Y-14生長曲線的測定 213.2.2發酵周期的優選試驗 213.2.3發酵溫度的優選試驗 213.2.4發酵初始pH的優選試驗 223.2.5發酵搖床轉速的優選試驗 223.2.6發酵搖瓶裝液量的優選試驗 223.2.7搖瓶發酵產GSH的進程試驗 223.3結果與分析 223.3.1啤酒酵母Y-14生長曲線的繪制 223.3.2發酵周期的優選試驗結果 233.3.3發酵溫度的優選試驗結果 243.3.4發酵初始pH值的優選試驗結果 243.3.5發酵搖床轉速的優選試驗結果 253.3.6發酵搖瓶裝液量的優選試驗結果 263.3.7搖瓶發酵產GSH進程曲線的繪制 273.4結論 28第4章10L自動發酵罐擴大發酵的初探 294.1材料 294.1.1菌種： 294.1.2培養基 294.1.3主要試劑 304.1.4主要儀器 304.2方法 304.2.1斜面種子培養 304.2.2一級種子搖瓶培養 314.2.3二級種子搖瓶培養 31發酵罐流加培養試驗 314.2.5分析方法 314.3結果與討論 324.3.1第一批發酵罐補料培養 324.3.2第二批發酵罐補料培養 364.4結論 40第5章啤酒酵母Y-14中復原型GSH的別離純化 415.1材料 415.1.1菌種 415.1.2主要材料 425.1.3主要設備 425.2方法 425.2.1GSH提取液的制備 425.2.2檢測方法 425.2.3相關數據的計算公式 425.2.4D001大孔樹脂離子交換柱的試驗流程 435.2.5D001大孔樹脂別離GSH的研究 435.2.6SephadexG-10凝膠柱的試驗流程 445.2.7SephadexG-10純化GSH的研究 455.3結果與分析 465.3.1D001大孔樹脂別離GSH的研究結果 465.3.2SephadexG-10脫鹽純化GSH的研究結果 505.3.3SephadexG-10分級別離純化GSH的研究結果 535.4結論 56第6章總結與展望 576.1總結 576.2創新點 586.3展望 58參考文獻 59致謝 64第1章引言據報道，人體內有一種神奇的物質，它和人的健康狀況有直接的關系。這種神奇的物質，科學上稱之為谷胱甘肽(GSH)。GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通過肽鍵縮合而成，具有較高的營養價值，具有保肝、抗氧化的作用，含有豐富的氨基酸、肽類物質、維生素、微量元素。近日，據有關病毒學家介紹：每天補充50毫克GSH，可快速產生復原性免疫細胞，增強人體免疫力。如果人體免疫能力強，就算被感染上病毒，也會將病毒的侵害降低到最低限度。美國著名的醫學專家古特曼博士這樣預測：“谷胱甘肽很快就會像膽固醇一樣，成為人們衡量健康指標之一。1.1谷胱甘肽概述谷胱甘肽結構和性質谷胱甘肽，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸組成的生物活性三肽化合物[1]，廣泛存在于生物體內的最豐富的非蛋白硫醇化合物[2]。其化學名為γ-L-谷氨酰-半胱氨酸-甘氨酸[3](英文名：γ-L-glutamyl-cysteinyl-glycine，簡寫為GSH)，其結構式如圖1所示：圖1.1GSH的化學結構式圖Fig1.1Chemicalstructuralofglutathione1888年Pailbode首先發現GSH，1921年Hopkins[4]從酵母抽提物和動物肝臟中首先別離得到GSH結晶并命名，1929年Hopkins、Kendall等提出GSH為三肽并初步提出它的結構，1935年由Harington和Mead說明其化學結構并加以化學合成[5]，隨后在1936年被DuVigneaud和Miller驗證[6]，1938年利用酵母制備GSH的最早專利發表。Bloch最早在肝臟中研究了GSH的生物合成，并證實了細胞內的GSH是由L-Glu、L-Cys和Gly在ATP的存在下，經過γ-L-谷氨酰半胱氨酸合成酶和GSH合成酶催化的序貫反響合成的。如圖1-2所示[7]：圖1.2GSH細胞內合成途徑Fig1.2IntracellularsynthesispathwaysofGSHGSH的相對分子量為307.33，熔點189～193℃，等電點為5.93，晶體呈無色透明細長柱狀。比旋光度[α]EQ\S(20,D)為+17.60°(C=0.05，H2O)，它易溶于水、稀醇、液氨和N,N'-二甲基甲酰胺，但微溶于醇、醚和丙酮等有機溶劑。GSH在高水分活性下不易保存，只有將水分活性控制在0.3以下才能長期穩定保存。早在1921年，Hopkins首先發現GSH，它分為復原型GSH和氧化型GSSH兩類[8]。通常人們所指的谷胱甘肽是復原型谷胱甘肽，GSH固體較為穩定，但其水溶液在空氣中極易被氧化成GSSH。GSSH是由兩分子GSH經氧化脫氫而形成的以二硫鍵連接的二聚體，一般以水合物的形式存在。它可以由谷胱甘肽復原酶利用NADPH作為電子供體復原成GSH，如圖1.3所示[9]:GSSH+NADPH+H+2GSH+NADP+圖1.3GSH與GSSG之間的相互轉換方程式Fig1.3TheinterconversionformulaofGSHandGSSG酵母細胞中氧化型和復原型谷胱甘肽之間的相互轉化過程，如圖1.4所示：圖1.4GSH與GSSG之間的相互轉換過程圖Fig1.4TheinterconversionprocessofGSHandGSSG谷胱甘肽的生理功能及其應用單態氧、超氧化物陰離子、羥基離子、過氧化氫等物質統稱為活性氧簇，(Reactiveoxygenspecies簡稱為ROS)[10]，即自由基。機體內新陳代謝產生的許多自由基會損傷細胞膜，侵襲大分子，促進機體衰老，并誘發疾病的產生。GSH可作為抗氧化劑通過氧化復原反響系統去除自由基[11]，被稱為長壽因子和抗衰老因子。GSH分子中含有一個特異的γ-肽鍵，由谷氨酸的γ-羧基與半胱氨酸的α-氨基縮合而成，并且半胱氨酸側鏈基團上連有一個活潑巰基，是GSH許多重要生理功能的結構根底。GSH這個積極的多肽化合物擁有著多功能的特性，被稱為最重要的可自我產生的防衛分子[12]，主要表現在三個方面：抗氧化劑[13]、提高免疫力[14]、高等真核生物有機體的解毒劑[15]等。GSH在臨床應用上具體表現為：(1)保護肝臟，治療各種肝類疾病[16]。GSH強大的復原作用使肝細胞膜對氧自由基的耐受性增加，從而使GSH具有促進肝功能，保護肝細胞膜，提高肝臟酶的活性，加快黃疸的消退，增強肝臟解毒等功能，可用于輔助治療重型病毒性肝炎、肝硬化、非酒精性脂肪肝，對藥物性腎和肝損害也有保護作用[17]。(2)治療腫瘤，減輕化療和放療的副作用[18]。GSH能激活多種酶(如巰基-SH酶)，從而促進糖、脂肪和蛋白質代謝，并影響細胞的代謝過程，同時通過巰基與體內自由基結合，可以轉化成容易代謝的酸類物質，從而加速了放化療產生的自由基的排泄。(3)解除中毒，減輕空氣污染和食物中的有毒成分對人體造成的傷害。GSH能與進入機體的有毒化合物(如：丙烯腈、氟化物、CO)、重金屬離子等直接結合，并促其排出體外，起到中和解毒的作用[19]。(4)可以防止皮膚黑色素沉積，防止新的黑色素形成并減少其氧化[20]。(5)治療眼科疾病，特別是應用于白內障的治療[21]。GSH高濃度存在于眼組織的水晶體、角膜、視神經、視網膜及睫狀體內，有益于角膜或水晶體透明性的維持以及組織再生與修復。(6)其他功能。人體中如缺乏GSH可以引起肺部疾病、胃腸疾病、胰臟炎癥、神經變性疾病、加速衰老等病癥[22]，近年來發現，GSH的缺乏還會導致小兒惡性營養不良癥、癲癇發作、帕金森綜合癥、囊性纖維化、鐮狀細胞性貧血、人體免疫缺損病毒入侵、艾滋病、癌癥、心臟病、中風、糖尿病等疾病[23]。因此GSH正代表著一個巨大的潛在價值在臨床治療戰略中發揮舉足輕重的作用[24]。1.2發酵法生產谷胱甘肽的國內外研究動態由于GSH具有重要的生理功能和廣泛的市場前景，因此GSH的工業化生產越來越受到關注。GSH的生產方法主要有萃取法、化學合成法、酶法和發酵法。其中發酵法是最具潛力的方法。利用特定微生物的代謝將廉價原料轉化為GSH的方法。即構建GSH合成能力強和胞內含量高的微生物，篩選和優化培養組分，改良提取工藝，最終提高GSH的產率和質量。自1938年實現了由酵母制備GSH以來，發酵法生產GSH的工藝及方法不斷得到改良，且發酵使用的細菌或酵母容易培養，原料容易獲得，條件容易控制，因此發酵法已成為目前生產GSH最普遍的方法。目前實現GSH規模生產的國家是日本。世界主要的氨基酸制造商Kyowa、Aji-nomoto和Deguss等都相繼投巨資于氨基酸的研究與開發，僅Kyowa1998年氨基酸的研究與開發就消耗達1.9億美元，而GSH是其重點之一，Kyowa目前是GSH主要的供給商(中國發酵網〕。GSH市場需求較大，但由于酵母細胞的GSH含量較低(僅為細胞干重的0.5%～1.0%)、酵母用量大、收率低等缺點，現有生產能力不能滿足市場需求，所以加緊對發酵法生產GSH的研究已成為國內當務之急。下面著重對發酵法生產GSH的關鍵技術環節：富含GSH菌種的選育、發酵過程的優化與放大及GSH的別離提取工藝等詳述。一、菌種選育普通酵母菌體中GSH的含量一般不超過細胞干重的1.0%，但有一些酵母菌，如Saccharomycesglyoxalphilus、熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)和Saccharomycescystinovolens、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，其菌體內GSH含量較高，且能長時間保持合成GSH的能力[17]。Kimura等[25]采用亞硝基胍和紫外線誘變大腸桿菌B355，獲得高產GSH的優良突變株，GSH的含量到達2.43mg/g。浙江工業大學賈建萍、裘娟萍[26]以編號為346的釀酒酵母為出發菌株，通過紫外線和60Co射線誘變處理，選育到1株抗氯化鋅和乙硫氨酸的突變株0.5Eth400-5，該菌株經搖瓶發酵GSH產量到達165.96mg/L，較出發菌株提高350%，GSH的含量19.76mg/g，較出發菌株提高318.6%。陜西省微生物研究所詹谷宇等[27]在酵母菌的誘變育種中用GSH的代謝類似物乙硫氨酸作為抗性篩選物，篩得抗代謝類似物突變株KllUE126，其胞內累計GSH的含量到達26.9mg/g，比出發菌株高出49.7%，這是我國目前通過常規誘變方法獲得的GSH含量最高的菌株。Kono等[28]用產朊假絲酵母經紫外線、x射線或亞硝基胍作用，得到的蛋氨酸耐性突變株，再經同樣處理，得到同時耐亞硫酸鹽和乙硫氨酸的變異株，其胞內GSH含量可達4.0%，而出發菌株僅為0.52%。這是目前國外文獻報道中GSH含量最高的。二、發酵過程的優化及放大①培養基碳源日本學者Sakato[29]研究說明，葡萄糖添加是工業化生產GSH的關鍵因素之一。通過在線監測發酵液中溶氧和乙醇的濃度，運用前饋/反響控制系統控制葡萄糖的流加速率，GSH產量到達2360mg/L，細胞內GSH含量到達37mg/g，這是所查文獻報道中GSH產量最高的。Chi-Hsien等[30]認為葡萄糖是啤酒酵母()生長的最正確碳源，蛋白胨是最正確氮源。衛功元，李寅等[31]針對假絲酵母的生長特征以及GSH生物合成的要求，選擇葡萄糖、蔗糖、乙酸、乙醇、麥芽糖、果糖和可溶性淀粉等物質進行考察，結果顯示C.utilisWSH02～08根本上不能利用乙酸和可溶性淀粉，葡萄糖更有利于促進GSH的合成，且可以將胞內GSH含量一直保持在較高水平。由于葡萄糖是速效碳源,它的初始濃度對GSH的積累非常重要，時麗萍，郭學武等[32]考察不同的葡萄糖初始濃度對酵母中GSH積累的影響，結果顯示，當初糖濃度逐漸升高時，生物量在增加，但GSH的含量卻在降低。GSH的產量和含量在葡萄糖初始濃度為30g/L時到達最高。饒志明，艾麗靜等[33]分別選擇葡萄糖、甘油、蔗糖、可溶性淀粉、玉米粉作為碳源，結果發現，在以甘油為碳源的培養基上，重組畢赤氏酵母的生物量及GSH含量均達最高值。經培養基成分和培養條件優化后，重組酵母的GSH產量是98.5mg/L，為優化前的2.33倍，生物量最大值到達19.6g/L。在5L發酵罐上進行放大實驗，發酵結束后GSH產量、重組菌的生物量分別為97.9mg/L，18.7g/L與搖瓶發酵結果根本吻合。江南大學陳堅等[34]考察了葡萄糖濃度對面包酵母(Saccharomycescerevisiae)WSH-J發酵生產GSH的影響，結果說明，當葡萄糖起始濃度超過12g/L時，胞內GSH含量減少，葡萄糖總濃度為30g/L的發酵液中，GSH總量達90.2mg/L，而葡萄糖總濃度為10g/L時，發酵液中GSH總量僅為65.6mg/L。應用計算得出的一種以控制比生長速率為目的的搖瓶補糖策略，在總糖濃度為26.2g/L下發酵12h，最終細胞胞內GSH含量到達13.6mg/g，發酵罐內GSH總產量到達119.4mg氮源氮源是構成微生物細胞和代謝產物中的氮素的營養物質。GSH是一種含氮量(13.68%)較高的物質，因此在生物合成GSH的過程中，適宜的氮源供給是非常必要的。時麗萍，郭學武等[32]分別考察了有機和無機氮源對酵母積累GSH的影響，結果顯示，酵母粉為最適宜的有機氮源，可能是因為酵母粉中含有多種生長因子和氨基酸，能夠促進細胞的生長和GSH的合成。酵母粉的添加對酵母的生長和GSH的積累均有利。當酵母粉的濃度超過9g/L時，對GSH的積累產生了一定的抑制作用。因此，最適的酵母粉添加濃度為9g/L。硫酸銨為最適的無機氮源，硫酸銨濃度為9g/L時，GSH的產量和含量明顯高于其他濃度，故此濃度為最適濃度。經培養基成分和發酵條件優化后GSH的產量為96.72mg/L，GSH含量為18.85mg/g，為初始含量的1.33倍。江南大學陳堅等[34]考察了氨基酸和酵母膏的添加對面包酵母(S.cerevisiae)WSH-J發酵生產GSH的影響，結果說明培養基中添加L-半胱氨酸、蛋氨酸能提高細胞內GSH的含量；L-半胱氨酸的效果更顯著，但對細胞生長有一定的抑制作用；添加由L-半胱氨酸、谷氨酸與甘氨酸組成的混合物也能提高細胞胞內GSH的含量。賀小賢，趙少欣等[35]通過正交試驗，對啤酒酵母搖瓶發酵生產GSH的培養基的組成進行研究，研究結果說明，在蔗糖濃度2%、酵母膏濃度1%、(NH4)2SO4濃度0.6%、半胱氨酸濃度為4mmol/L時，優化發酵條件，GSH產量可達248mg/L，比發酵條件優化前提高了37%。Alfafara[36]等研究了半胱氨酸的補加策略，實驗結果說明，連續流加后期，細胞比生長速率和GSH比生產速率皆下降，整個發酵過程中GSH含量與不加半胱氨酸相比，無顯著提高；而一次性補加半胱氨酸可以很大程度上提高GSH的比生產速率。北京化工大學譚天偉等[37]在S.cerevisiaeT65發酵生產GSH過程中，采取先參加半胱氨酸再參加谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸混合物的策略，含量到達1875mg/L，比不加谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸混合物的產量提高了55.2%。②培養條件時麗萍，郭學武等[38]對面包酵母BY-14產GSH的搖瓶發酵條件進行了優化，其最適的培養條件為：轉速160r/min，發酵時間22h，溫度28℃，接種量10%，裝液量50mL。在優化的條件下，GSH的含量到達16.04mg/g，為初始條件下的1.48倍。衛功元，李寅等[39]在7L發酵罐中研究了溶氧和pH對產朊假絲酵母分批發酵生產GSH的影響。結果說明，當葡萄糖濃度為30g/L且通氣量控制在5L/min時，攪拌轉速到達300r/min，即可滿足細胞生長和GSH合成對溶解氧的需求。不同pH控制方式對GSH分批發酵的影響有較大差異。研究了將pH控制在4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和6.5的GSH分批發酵過程，發現在pH5.5時GSH總產量最高。同時研究了24～32℃范圍內產朊假絲酵母生產GSH的分批發酵過程，發現較高溫度(30℃)對細胞生長有促進作用，而較低溫度(26℃)那么更有利于GSH產量的提高。采用兩階段溫度培養方式，用較高溫度(30℃)促進細胞生長，較低溫度(26℃)促進GSH形成，GSH產量較26℃培養提高5%，較30℃培養提高了23%，GSH含量也上升到2.5%。③培養方式衛功元，李寅等[40]考察了重復補料、恒速流加和指數流加等不同培養方式對產朊假絲酵母中GSH發酵生產的影響。結果發現，這幾種培養方式都可以實現酵母細胞和GSH的高產。綜合比擬，無論是從細胞還是從GSH的產量、得率和生產強度的角度來看，指數流加都是較為理想的選擇。經過48h的指數流加培養，細胞干重到達40.9g/L，GSH產量和胞內GSH含量分別到達857.2mg/L和2.25%。三、GSH的別離純化工藝GSH的粗提物進一步別離純化的方法主要有4種：(1)銅鹽法，具有使用價值，但污染較大。(2)離子交換樹脂法Kimura等[41]發表的專利中報道了從大腸桿菌發酵液中提取GSH的方法，發酵液離心取菌體，破碎細胞，離心取上清液，用硫酸調節pH3.0，上陽離子交換樹脂如DiaionPK-228H.sup+，用0.5mol/l的氨水洗脫，洗脫液用硫酸調節pH到4.5，上陰離子交換樹脂如DuoliteA2CH3COO.sup-，用0.5mol/l的硫酸洗脫，參加50%的乙醇到洗脫液中得到GSH晶體。蔡俊，邱雁臨[42]對使用732陽離子交換樹脂法提取GSH時的提取條件進行了研究，確定最正確提取工藝條件上柱pH3.0，洗脫用氫氧化鈉濃度0.25mol/L，洗脫流速30cm/min，此條件下GSH的平均回收率為53.06%，產品GSH含量為2.953%。可以制得GSH淡黃色晶體。邱雁臨，胡靜等[43]對大孔樹脂D001別離啤酒廢酵母中的GSH進行了研究。其最正確試驗條件為：pH4.5的0.02mol/L磷酸緩沖液平衡，pH7.5的0.02mol/L磷酸緩沖液洗脫，洗脫流速為2.0mL/min。在最正確別離條件下，大孔樹脂D001別離GSH的平均收得率為20.03%，產品中GSH的含量為28.47%，產品顏色為白色。趙睿，王滿意等[44]利用大孔苯乙烯樹脂改性合成含硫樹脂，考察了修飾條件對GSH吸附的影響，并對其在GSH別離中的應用進行了研究。結果說明采用pH3.0的緩沖液進行吸附，自制的含硫樹脂最大吸附容量可達22mg/g濕樹脂。選擇質量濃度為0.5%的NaOH溶液洗脫GSH，解吸率可達70%以上。采用真實發酵液進行別離純化，收率為35%。蘇曉晉，王淼等[45]確定了GSH最正確的洗脫條件：先用pH3.0的去離子水洗滌柱子，直到洗滌液中無GSH和蛋白質流出。再采用濃度為1.5%HCl溶液進行洗脫，速度為0.5mL/min，最終的GSH回收率到達80.2%，蛋白質去除率60%，GSH濃縮倍數達2.5倍(頂峰時到達8.3倍)，純化倍數為3.9倍，獲得了良好的別離效果。(3)電滲析法TakeshiGotoh[46]等用電滲析法從酵母提取液中別離GSH，由于GSH在堿性條件下易于被氧化，電滲析是在pH值3～6進行，克服了GSH的不穩定性。(4)雙水相分配結合溫度誘導相別離可以省去細胞破碎后的固液別離操作，并且利用溫度誘導相別離能實現聚合物的循環利用。梅樂和等選用環氧乙烷-環氧丙烷無規共聚物(EOPO)/羥丙基淀粉(PES)雙水相系統，在EOPO400013%，PES10010%，pH10.5的條件下，結合溫度誘導相別離技術從酵母細胞中提取GSH，GSH的總萃取率達80%以上，但因雙水相組成系統一般比擬昂貴，此法目前還處于實驗室研究階段。1.3本研究的意義、目的及內容意義GSH具有去除自由基、維持DNA生物合成、促進鐵質吸收、維持細胞正常生長、維持紅細胞的完整性、細胞免疫等生理功能。在臨床應用上，主要表現在肝炎治療、減輕化療副作用、有機物及重金屬的解毒、抗過敏、眼疾病的改善等作用。在化裝品領域中，它有抗衰老、增白、祛斑等作用。在食品加工領域，GSH具有防褐變、使食品增鮮、營養增強等成效。日本早在1985年就取得了中國衛生部的原料藥進口許可證號，根本壟斷中國市場。目前GSH的主要生產廠家有美國的Sigma、JTBaker、Fluka等公司，日本有協和公司、和光純藥公司等，德國有默克和BDH公司等。實現GSH的國產化，不僅可以改變我國GSH原料藥依賴進口的局面，而且對我國醫藥工業、臨床醫學和食品工業均具有重大的社會意義和經濟效益。目的研究目的：在本實驗室前期研究的根底上，用實驗室現有的富含GSH的啤酒酵母Y-14進行發酵生產GSH工藝的優化及放大試驗、采用離子交換法及凝膠雙柱精制GSH的方法，最終到達提高GSH的回收率及產品質量的目的。

研究內容1、利用Plackett-Burman設計和Box-Behnken設計對富含GSH啤酒酵母Y-14搖瓶發酵GSH工藝進行優化，并利用SAS軟件進行回歸分析確定發酵培養基最正確組成成分。2、利用單因素試驗對啤酒酵母Y-14生產GSH發酵條件進行優化，確定搖瓶發酵溫度、初始pH、搖床轉速及裝液量的最優值。3、將上述最正確試驗條件運用到10L發酵罐發酵生產GSH的擴大重復試驗當中，以確定最有利于工業生產的試驗方案。4、以GSH吸附率、GSH回收率、蛋白質去除率、濃縮倍數、純化倍數為主要指標，研究確定大孔樹脂D001別離GSH的最適上樣濃度、上樣pH、上樣流速、洗雜質用液種類、洗脫液種類與濃度及洗脫流速。后采用SephadexG-10凝膠雙柱精制GSH，研究最適的脫鹽上樣體積與濃度，分級別離上樣體積，到達較理想的GSH純化效果。1.4常用研究指標的說明為了防止重復，在此對本論文所用到的各項研究指標進行簡要說明。菌體胞內GSH的含量：表示每克干菌體胞內GSH的含量，簡稱GSH含量，單位為mg/g；GSH的產量：表示每升發酵液中總干菌體胞內GSH的含量，簡稱GSH產量，單位為mg/L；生物量：表示每升發酵液中菌體烘干后的重量，單位為g/L。GSH產量〔mg/L〕=GSH含量〔mg/g〕×生物量〔g/L〕

第2章啤酒酵母Y-14發酵GSH培養基的優化生產GSH的酵母大都是工業常用菌株，這些菌株能在寬松的培養條件下生長并積累GSH，但產量往往很低。在實際的發酵生產中，選育性能優良的菌種僅僅是一個開始，還需要對發酵過程進行優化控制，最大限度地發揮其生產目標產物的能力。要想進一步提高菌株的生物量和胞內合成GSH能力，必須對培養基中各種營養成分進行優化，確定適合菌株生長最適培養基。一些試驗設計(如正交試驗設計、因次分析設計、中心復合試驗設計等)及數據處理方法(如Plackett-Burman試驗設計、響應面分析、神經網絡模型)的應用可以減少工作量并且使試驗結果具有更高的可信度和實際應用價值。Udeh和Achremowics考察了培養基中的主要成分(葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、生物素和半胱氨酸)濃度的變化對酵母S.cerevisiaeS-8H細胞形成和胞內GSH含量的影響，采用中心復合試驗設計(CentralCompositionExperimentalDesign)方法對發酵培養基進行優化，得到GSH產量為160.1mg/L，胞內GSH含量到達1.7%，與優化前的情況相比提高近一倍[47]。李寅[48]等采用正交試驗獲得的試驗數據，通過網絡模型(NeuralNetworkModel)進行分析預測，對C.utilisWSH02～08發酵生產GSH的培養基進行優化，搖瓶條件下GSH胞內含量達2.5%，GSH產量和細胞干重也有大幅度的提高。本章以啤酒酵母Y-14獲得GSH的產量為指標，采用Plackett-Burman設計對影響GSH生產的14個營養因素進行考察，再用Box-Behnken設計對培養基成分進一步優化，對所得的實驗數據與響應面模型進行擬合，利用SAS(version9.0,SASInstituteIne,Cary,NC,USA)處理分析，確定最后的優化結果。2.1材料2.1.1菌種：啤酒酵母Y-14，由XXXX大學工業微生物湖北省重點實驗室再生資源微生物轉化研究室提供。2.1.2培養基：.1斜面培養基(g/L)葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏5，瓊脂20，pH6.0，0.115MPa滅菌15min。.2種子培養基(g/L)葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏5，pH6.0，0.115MPa滅菌15min。.3原始發酵培養基(g/L)葡萄糖20，酵母膏5，(NH4)2SO47.5，KH2PO43，MgSO40.15，水1000mL，pH6.0，0.115MPa滅菌15min。2.1.3主要試劑葡萄糖AR廣州化學試劑廠蛋白胨BR國藥集團化學試劑牛肉浸膏BR上海長陽生化制藥廠(NH4)2SO4AR北京益利精細化學品MgSO4·7H2OAR金山縣興塔化工廠KH2PO4AR湖州化學試劑廠DTNBARSigma，武漢新銳生物分裝98%GSHARSigma，武漢新銳生物分裝2.1.4主要儀器GW-722型可見分光光度計上海精密儀器303-2電熱培養箱上海崇明實驗儀器廠HS80A恒溫搖床中國科學院武漢科學儀器廠320-SpH計梅特勒-托利多(上海)電子分析天平奧豪斯國際貿易(上海)15W紫外燈順德市展達電器廠CS101-2電熱鼓風枯燥箱中華人民共和國重慶試驗儀器設備廠珍珠牌凈化工作臺中華人民共和國蚌埠汽化設備廠2.2方法2.2.1菌株活化從保藏斜面中取一環菌種劃線于新鮮斜面培養基上，置于30℃培養箱中培養。種子搖瓶培養用接種環取一滿環已活化的菌種于種子培養基中，在溫度為30℃，搖床轉速150rpm，搖瓶裝量50mL/250mL條件下培養18h。搖瓶發酵培養用無菌的5mL移液管按10%的接種量吸取種子液3mL，接入發酵培養基中，在溫度為30℃，搖床轉速150rpm，搖瓶裝量30mL/300mL條件下發酵48h。菌種的保藏菌種接于斜面培養基上4℃冰箱保藏。DTNB法檢測GSH含量[49]取樣液2mL，參加0.4mol/L，pH7.0的磷酸緩沖液2.5mL，1.0mmol/LDTNB顯色劑0.5mL，反響數分鐘后顯色穩定后于412nm處用分光光度計測定OD值。2.2.6試驗設計方法1)Plackett-Burman設計[50]對影響GSH生產的14個營養因素進行考察,每個因素取2個水平，各因素及其水平見表1，試驗設計見表2，表2中每行代表1個試驗，每列代表1個獨立的變量，符號“+〞和“-〞分別代表高和低2個不同的水平。2)Box-Behnken設計對培養基成分的進一步優化[51]對Plackett-Burman設計試驗篩選出的有較大影響因素，利用Box-Behnken設計對培養基進一步的優化。每個因素取3個水平，在中心點上有3個重復。試驗數據經多項式回歸分析得到一個關于響應值與自變量關系的二階模型，該方程即為描述響應量(應變量)和自變量(操作條件)關系的經驗模型。3)對優化試驗所得的實驗數據與響應面模型進行擬合，便可以得到模型中的各個系數。再對該多元函數進行分析便可確定出其極值點以及取得極值的相應的自變量的取值。最后按照計算所得到的參數進行試驗驗證模型的可靠性，確定最后的優化結果。試驗數據均用SAS(version9.0,SASInstituteIne,Cary,NC,USA)處理分析。2.3結果與分析2.3.1顯著影響因素的篩選結果根據啤酒酵母生長所需營養要素并結合相關的文獻報道，試驗選取的影響因素(變量)共14個，表2.1列出了14個營養因素的編號及水平，A-N編碼了14個因素，表2.2列出了Plackett-burman設計的不同培養基，標號為1-16，每行代表1個試驗，按照設計的培養基進行發酵試驗，每組重復3次，結果見表2.2。表2.1Plackett-Burman試驗因素與水平Tab2.1ThefactorsandlevelsofvariablesusedinthePlackett-Burmandesign試驗因素代碼-(-)低水平〔g/L〕(+)高水平〔g/L〕酵母膏X139蔗糖X2010蛋白胨X3010K2HPO4X426酪蛋白X5010葡萄糖X6010MgSO4X70.10.3麥芽糖X8010NaClX926(NH4)2SO4X10412乳糖X11010可溶性淀粉X12010Cacl2X1303尿素X14010表2.2Plackett-Burman試驗設計和結果Tab2.2ExperimentaldesignandresultsofPlackett-BurmanX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14Y**1-1-1-1-11-1-11-111-11130.8721-1-1-1-1-11111-111-168.583-11-1-1-11-111-111-1150.25411-1-11111-1-1-1-1-1-182.085-1-11-1-111-1-1111-1-177.6461-11-111-1-111-1-1-1190.67-111-11-11-11-11-11-125.548111-1-1-1-1-1-1-1-111149.879-1-1-11-111-11-1-1-11155.07101-1-1111-1-1-1-1111-170.4911-11-111-11-1-11-11-1168.751211-11-1-1-1-1111-1-1-170.8313-1-1111-1-111-1-11-1-140.46141-111-1-111-1-11-1-1175.3815-1111-11-11-11-1-11-190.871611111111111111121.2注：Y**表示GSH產量，單位為mg/L。表2.3Plackett-Burman設計試驗的的回歸系數及其顯著性檢驗Tab2.3RegressioncoefficientsandtheirsignificancetestofPlackett-BurmandesignEffectEstimateStdErrortRatioPValueX123.7041.548715.3050.0415X26.29831.54874.06380.1536X39.33631.54876.02820.1047X414.7091.54879.49720.0668X5-1.05621.5487-0.6820.6190X625.9661.548716.7850.0379X710.0061.54876.46090.0978X86.36881.54874.11220.1519X9-2.92131.5487-1.88620.3103X1021.2811.548713.7410.0462X11-3.00371.5487-1.93950.3031X123.25621.54872.10250.2826X13-5.43131.5487-3.50690.1768X141.94371.54871.2550.4283利用SAS軟件對Plackett-Burman試驗結果進行方差分析，結果見表2.3，Pr>F值(P值)的大小說明模型及各個考察因素的顯著水平。Pr>F值小于0.05說明模型或各因素有顯著影響，Pr>F值小于0.01表示影響高度顯著。其中X1，X6，X10是有意義的模型參數，因為Pr>F值均小于0.05。所以對應的因素葡萄糖，酵母膏和(NH4)2SO4對GSH的產量具有顯著性的影響，而其它的因素顯著性較小。2.3.2Box-Behnken設計進一步優化培養基試驗結果以主要影響GSH產量的葡萄糖、酵母膏和(NH4)2SO4的濃度(g/L)為自變量，各因素編碼水平如表2.4所示。Box-Behnken試驗設計和試驗結果如表2.5所示。表2.4Box-Behnken試驗因素與水平Tab2.4ThefactorsandlevelsofvariablesusedinBox-Behnkendesign試驗因素代碼編碼水平/(g/L)-10+1葡萄糖X1102030酵母膏X251015(NH4)2SO4X34810表2.5Box-Behnken試驗設計和試驗結果Tab2.5ExperimentaldesignandresultsofBox-Behnken試驗編號X1X2X3Y**1-1-1078.652-11085.0331-1089.58411095.8150-1-176.3160-1172.83701-197.78801187.929-10-180.151010-190.0511-10173.231210189.5613000123.2914000123.5815000124.77采用國際權威的SAS軟件回歸擬合表試驗數據，可以得到二階經驗模型為Y=123.6267+5.9925×X1+6.14625×X2-2.59375×X3-18.41083×X1×X1-17.94833×X2×X2-21.96833×X3×X3式中，Y代表GSH產量，X1、X2、X3分別代表培養基中葡萄糖、酵母膏和(NH4)2SO4的濃度(g/L)。通過SAS軟件進行方差分析來驗證回歸模型及各參數的顯著度，結果見表2.6，模型Pr>F值為0.000763，說明該模型是高度顯著的。經F檢驗，模型中的參數X1，X2，X1X1，X2X2，X3X3都是顯著的(Pr>F值小于0.05)。同時，軟件分析得到模型的決定系數R2為98.21%，大于90%，修正決定系數Adj.R2為94.99%，能對試驗數據進行較好的擬和，說明模型相關度很好。變異系數(CV)反映模型的置信度，CV值越低模型的置信度越高,本試驗的CV值為4.293957%，說明模型方程能夠很好地反映真實的試驗值。表2.6回歸方程的方差分析Tab2.6Varianceanalysisoftheregressionequation方差來源自由度平方和均方F值Pr>FX11287.2804287.280418.202540.007966X21302.2111302.211119.148570.007182X3153.8203153.820313.4101390.124081X1×X111251.541251.5479.299540.000297X1×X210.0056250.0056250.0003560.985668X1×X3110.3362310.336230.6549190.455129X2×X211189.451189.4575.36540.000335X2×X3110.176110.17610.6447740.458441X3×X311781.9361781.936112.90630.000128Model94331.44481.271230.494090.000763一次項3643.3119214.437313.587080.007718二次項33667.6111222.53777.461850.00013交叉項320.517956.8393170.433350.738594殘差項578.9121915.78244失擬項378.6497326.21658199.77070.004985誤差20.2624670.131233和144410.353R-square98.21%Adj.R-square94.99%RMSE3.972712%CV4.293957%在保持1個因素為零水平下，其它2個因素與響應值關系用三維坐標圖2.1表示，直觀地反響了各因素對響應值的影響關系。在最優條件下：葡萄糖、酵母膏和(NH4)2SO4分別為20g/L、10g/L、8g/L時，預測GSH最大產量為124.80mg/L。為驗證模型準確性和有效性，在預測最優發酵條件下進行發酵試驗(重復3次)，得到GSH產量分別為123.58mg/L、121.65mg/L、124.77mg/L。可見該模型能較好預測發酵所產GSH產量。因此，最優發酵培養基的組成為葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO48g/L，KH2PO43g/L，MgSO40.15Fixedlevels：X1=0Fixedlevels：X2=0Fixedlevels：X3=0圖2.1GSH產量的響應面分析圖Fig2.1ResponsesurfaceanalysisofGSHyield2.4結論Plackett-Burman設計法是一種經濟且有效的試驗設計方法，它能快速、有效地從眾多因子中篩選出能促進啤酒酵母Y-14高產GSH的因子；響應面法(RSM)能快速對主要影響因子進行優化與評價，并能得到各因素最正確組合和響應值的最優值。通過Plackett-Burman試驗篩選出葡萄糖、酵母膏和(NH4)2SO4是影響啤酒酵母Y-14高產GSH的關鍵因子，進而用響應面法優化發酵培養基,得到的最適培養基配方為：葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，(NH4)2SO48g/L，KH2PO43g/L，MgSO40.15g/L。對優化配方進行驗證試驗

第3章啤酒酵母Y-14產GSH發酵條件的優化為了使菌株進一步提高GSH的合成能力，僅確定最正確培養基成分是遠遠不夠的，還必須對發酵條件進行優化，為最終的工業化生產提供了實驗依據。影響發酵產量的環境參數主要有溫度、pH、溶解氧等。溫度對菌體生長、酶活性都有直接的影響。pH影響細胞對營養成分的吸收及代謝途徑，從而影響細胞生長及GSH積累。GSH發酵過程中氧的供給是個關鍵因素，溶氧濃度是微生物生長和GSH形成率的重要參數之一。國內對面包酵母和重組大腸桿菌發酵過程中的溫度、pH值、搖瓶裝液量等環境條件的影響已有較多研究，但GSH的產量均值仍不理想。另據研究說明，添加L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸等三種前體氨基酸及其混合物能提高細胞內GSH的含量，其中以L-半胱氨酸的效果更為顯著。Miyamoto等[52]在利用甲醇作為碳源培養S.cerevisiaeIAM4207進行GSH發酵生產時發現，向培養基中添加L-半胱氨酸可以使胞內GSH含量大幅度提高，Watanabe等[53]發現，在S.cerevisiae生長穩定期之前添加混合氨基酸有利于GSH的積累。Alfafara[54]考察了S.cerevisiae搖瓶發酵生產GSH過程中這三種前體氨基酸對GSH合成的影響，結果說明，一次性補加半胱氨酸可以很大程度上提高GSH的比生產速率。本章在前一章發酵培養基優選試驗的根底上，利用單因素試驗分別研究了啤酒酵母Y-14發酵最適溫度、初始pH、搖床轉速、搖瓶裝液量及添加前體氨基酸和ATP對GSH產量的影響，并確定其最優發酵條件。3.1材料3.1.1菌種：啤酒酵母Y-14，由XXXX大學工業微生物湖北省重點實驗室再生資源微生物轉化研究室提供。3.1.2培養基：.1斜面培養基(g/L)葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏5，瓊脂20，pH6.0，0.115MPa滅菌15min。.2種子培養基(g/L)葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏5，pH6.0，0.115MPa滅菌15min。.3發酵培養基〔g/L〕葡萄糖20，酵母膏10，(NH4)2SO48，KH2PO43，MgSO40.15，水1000mL，0.115MPa滅菌15min。.4補料培養基L-谷氨酸10mmol/L，甘氨酸6mmol/L，L-半胱氨酸10mmol/L，ATP1.67μg/mL。主要試劑L-谷氨酸BR中國醫藥集團上海化學試劑公司L-半胱氨酸AR武漢市華順生物技術甘氨酸BR中國醫藥集團上海化學試劑公司ATPBR上海源聚生物科技3.1.4主要儀器同第2章。3.2方法3.2.1啤酒酵母Y-14生長曲線的測定采用種子培養基培養菌體，利用分光光度計在波長560nm波長下，每隔2小時測定一次菌懸液的OD值，以時間為橫軸，OD值為縱軸繪制其生長曲線。3.2.2發酵周期的優選試驗啤酒酵母Y-14連續培養12小時，后每隔8小時取樣測量生物量及GSH產量。3.2.3發酵溫度的優選試驗在其他發酵條件不變時，考察了當溫度分別為25℃、28℃、30℃、32℃、35℃時，發酵60h時，啤酒酵母Y-14產GSH所得到的細胞干重、胞內GSH含量、發酵液中GSH產量。3.2.4發酵初始pH的優選試驗在其他發酵條件不變時，考察了當pH值分別為4.5、5、5.5、6、6.5、7時，啤酒酵母Y-14產GSH所得到的細胞干重、胞內GSH含量、發酵液中GSH產量。3.2.5發酵搖床轉速的優選試驗在其他發酵條件不變時，考察了當搖床轉速分別為120rpm、150