第八章

機體免疫功能的檢測技術

第一節 免疫細胞的分離與純化第二節 體液免疫功能的檢測第三節 細胞免疫功能的檢測第四節 細胞因子及其受體的檢測技術第八章機體免疫功能的檢測技術

第一節免疫細胞的分離與純化一、細胞密度差異分離法二、細胞粘附與吞噬能力差異分離法三、細胞滲透壓敏感差異分離法四、細胞表面標志分離法五、其他細胞的分離和收集

根據不同細胞存在的密度差異即比重不同而分類。人外周血細胞的密度為：紅細胞1.093，粒細胞1.092，單個核細胞1.075～1.090，血小板1.030～1.035。

1．自然沉降分離法

2．密度梯度離心法一、細胞密度差異分離法上層：淡黃色血漿底層：紅細胞灰白層：白細胞1．自然沉降分離法（1）Ficoll密度梯度離心法（2）Percoll密度梯度離心法2．密度梯度離心法（1）Ficoll密度梯度離心法

即聚蔗糖－泛影葡胺密度梯度離心法（ficoll-hypaquedensitygradientcentrifugation)Ficoll分層液的密度為：1.077±0.001

用于從外周血中分離單個核細胞用Ficoll分離外周血單個核細胞95%2000rpm20min血漿單個核細胞淋巴細胞分離液紅細胞粒細胞（2）Percoll密度梯度離心法

Percoll即聚乙烯吡咯烷酮包被的硅膠混懸液的商品名，為一種無細胞毒無刺激的新型連續密度梯度分層液。

Percoll原液密度1.135

用于從單個核細胞中分離單核細胞、淋巴細胞用Percoll分離單核細胞和淋巴細胞75%98%第一節免疫細胞的分離與純化一、細胞密度差異分離法二、細胞粘附與吞噬能力差異分離法三、細胞滲透壓敏感差異分離法四、細胞表面標志分離法五、其他細胞的分離和收集

單核/巨噬細胞具有較強的粘附能力，在37℃和Ca2+存在條件下，能主動粘附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維或葡聚糖凝膠的表面，據此可建立許多從單個核細胞懸液中去除單核/巨噬細胞的方法，藉以獲得高純度的淋巴細胞。

1．細胞粘附力差異分離法

2．細胞吞噬能力差異分離法二、細胞粘附與吞噬能力差異分離法

單核/巨噬細胞具有較強的粘附能力，在37℃和Ca2+存在條件下，能主動粘附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維或葡聚糖凝膠的表面，據此可從單個核細胞懸液中去除單核/巨噬細胞，獲得高純度的淋巴細胞。

Ｂ細胞也有一定的粘附能力，能粘附于尼龍纖維表面，可以將Ｔ細胞與Ｂ細胞分開。1．細胞粘附力差異分離法（1）粘附貼壁法：單個核細胞放在玻璃或塑料平皿中于37℃溫箱靜置1h，收集游離的淋巴細胞。（2）吸附柱過濾法：單個核細胞加入玻璃纖維或葡聚糖凝膠（Sephadex-G10），收集未吸附的淋巴細胞。

淋巴細胞放入尼龍纖維，可以吸附B細胞，游離細胞為T細胞。磁鐵吸引法：單核/巨噬細胞具有吞噬特性，可加入直徑為3um的羰基鐵顆粒或乳膠顆粒，待單核/巨噬細胞充分吞噬顆粒后，再用磁場吸附或通過密度梯度離心，獲得較純的淋巴細胞。2．細胞吞噬能力差異分離法第一節免疫細胞的分離與純化一、細胞密度差異分離法二、細胞粘附與吞噬能力差異分離法三、細胞滲透壓敏感差異分離法四、細胞表面標志分離法五、其他細胞的分離和收集三、細胞滲透壓敏感差異分離法

紅細胞對低滲的敏感性要高于白細胞，故可用不損傷白細胞的溫和低滲液處理以除去紅細胞。

1.低滲裂解法：蒸餾水

2.氯化銨處理法：0.83%氯化銨第一節免疫細胞的分離與純化一、細胞密度差異分離法二、細胞粘附與吞噬能力差異分離法三、細胞滲透壓敏感差異分離法四、細胞表面標志分離法

五、其他細胞的分離和收集四、細胞表面標志分離法

1.E-玫瑰花環沉降法

2.親和分離法

3.補體介導的特異性細胞毒分離法

4.免疫磁珠分離法

5.流式細胞儀分離法1.E-玫瑰花環沉降法2.親和分離法3.補體介導的特異性細胞毒分離法

是在補體的作用下裂解與抗體結合的細胞，從而分離出不能與此抗體結合的細胞亞群。這是一種負選性分離法，簡稱細胞毒法。4.免疫磁珠分離法

在磁珠表面包被了特異性抗體的免疫磁珠（immunomagneticmicrobeads，IMB），可與目標細胞表面的抗原結合而與特定細胞粘附，在磁場中可以分離IMB結合細胞與IMB非結合細胞。本方法快速、特異、高效，分離效果可與FACS法媲美，對儀器的要求卻低得多。

5.流式細胞儀分離法第一節免疫細胞的分離與純化一、細胞密度差異分離法二、細胞粘附與吞噬能力差異分離法三、細胞滲透壓敏感差異分離法四、細胞表面標志分離法五、其他細胞的分離和收集五、其他細胞的分離和收集

1.吞噬細胞的分離和收集

2.NK細胞和LAK前體細胞的分離1.吞噬細胞的分離和收集（1）人：組織液（斑蝥敷貼法）（2）小動物：腹腔巨噬細胞2.NK細胞和LAK前體細胞的分離單核細胞去除法:粘附法B淋巴細胞去除法:尼侖棉纖維T淋巴細胞去除法:E-玫瑰花環沉降法第一節 免疫細胞的分離與純化第二節 體液免疫功能的檢測第三節 細胞免疫功能的檢測第四節 細胞因子及其受體的檢測技術第八章機體免疫功能的檢測技術

第二節體液免疫功能的檢測一、免疫球蛋白的定量檢測二、外周血B細胞數目的檢測三、外周血B細胞功能的檢測一、免疫球蛋白的定量檢測

1.單向免疫擴散試驗

2.免疫比濁法

3.ELISA單相免疫擴散試驗第二節體液免疫功能的檢測一、免疫球蛋白的定量檢測二、外周血B細胞數目的檢測三、外周血B細胞功能的檢測二、外周血B細胞數目的檢測1.免疫熒光技術

2.花環試驗

3.流式細胞術

B細胞EA、EAC花環試驗

第二節體液免疫功能的檢測一、免疫球蛋白的定量檢測二、外周血B細胞數目的檢測三、外周血B細胞功能的檢測三、外周血B細胞功能的檢測1.B細胞增殖試驗

2.溶血空斑試驗

3.ELISPOT1.B細胞增殖試驗非特異性刺激物（美洲商陸）特異性刺激物（抗原）3H-TdR摻入法MTT法形態學計數法溶血空斑試驗第一節 免疫細胞的分離與純化第二節 體液免疫功能的檢測第三節 細胞免疫功能的檢測

第四節 細胞因子及其受體的檢測技術第八章機體免疫功能的檢測技術

第三節細胞免疫功能的檢測一、T細胞亞群和數目的檢測二、T細胞功能的檢測三、其他免疫細胞功能的檢測一、T細胞亞群和數目的檢測1.免疫熒光技術

2.花環試驗

3.流式細胞術第三節細胞免疫功能的檢測一、T細胞亞群和數目的檢測二、T細胞功能的檢測三、其他免疫細胞功能的檢測二、T細胞功能的檢測1.體外功能實驗

2.體內功能實驗1.體外功能實驗（1）T細胞增殖試驗（2）細胞毒試驗（3）ELISPOT（1）T細胞增殖試驗非特異性刺激物（PHA、ConA、PWM）特異性刺激物（抗原）3H-TdR摻入法MTT法形態學計數法（2）細胞毒試驗（2）細胞毒試驗2.體內功能實驗第三節細胞免疫功能的檢測一、T細胞亞群和數目的檢測二、T細胞功能的檢測三、其他免疫細胞功能的檢測三、其他免疫細胞功能的檢測1.巨噬細胞功能的檢測

2.NK細胞和LAK細胞功能的檢測1.巨噬細胞功能的檢測2.NK細胞和LAK細胞功能的檢測NK細胞靶細胞（K562）LAK細胞靶細胞（LiBr)第一節 免疫細胞的分離與純化第二節 體液免疫功能的檢測第三節 細胞免疫功能的檢測第四節 細胞因子及其受體的檢測技術

第八章機體免疫功能的檢測技術

第四節細胞因子及其受體的檢測技術一、細胞因子的檢測方法二、細胞因子受體的檢測方法一、細胞因子的檢測方法

1.生物活性檢測技術（依賴性細胞株、功能測定等）

2.免疫學檢測技術（ELISA、RIA）

3.分子生物學技術（分子雜交技術、PCR）

4.