定量與常規(guī)的差別第一頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之如何定量？Ct值的概念Ct值的定義是PCR擴(kuò)增過(guò)程中，熒光信號(hào)開(kāi)始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的閾值所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。為什么要用Ct值定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法利用循環(huán)閾值（Ct）的概念，在指數(shù)擴(kuò)增的開(kāi)始階段進(jìn)行檢測(cè)，此時(shí)樣品間的細(xì)小誤差尚未放大，因此該Ct值具有極好的重復(fù)性。第二頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日定量原理初始DNA量越多,熒光達(dá)到某一值（域值）時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)越少Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)就可計(jì)算出樣品中所含的模板量確定初始模板的濃度Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之第三頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日SYBRGreen1MolecularBeacons

TaqMan熒光化學(xué)Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之第四頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日AmplifluorRoche熒光化學(xué)Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之陰陽(yáng)探針R1R2RQ第五頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日SYBRGreenI工作原理Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之SYBRGreen1

結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBRGreen1

染料只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA第六頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日GTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAATACCGGGGTTACGAACGGTAAT變性DNA未結(jié)合SYBRGreen1dye變性:無(wú)熒光信號(hào)SYBRGreenI工作原理Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之第七頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日SYBRGreenI應(yīng)用范圍起始模板濃度定量融解曲線分析---可區(qū)分單一產(chǎn)物、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物和（或）引物二聚體基因型分析Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之第八頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日SYBRGreenI優(yōu)點(diǎn)使用方便

---不必設(shè)計(jì)復(fù)雜的引物沒(méi)有序列特異性

---可以用于不同的模板便宜靈敏Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之第九頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日SYBRGreenI缺點(diǎn)與非特異性產(chǎn)物結(jié)合Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之第十頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日Molecular

BeaconsMolecularBeaconsOpticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之發(fā)夾型雜交探針第十一頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日MolecularBeacons原理：熒光諧振能量傳遞（FRET）

莖由互補(bǔ)配對(duì)的序列組成環(huán)與目標(biāo)序列完全配對(duì)莖Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之熒光素淬滅劑環(huán)第十二頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日變性:產(chǎn)生非特異性的熒光MolecularBeaconsOpticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之第十三頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日MolecularBeaconsSNPTACCGGGGGTTACGAACGGTAATTTTTGCCCCCAAAAQ熒光素目標(biāo)序列莖淬滅劑Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之第十四頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日延伸:沒(méi)有熒光MolecularBeaconsSNPOpticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之第十五頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日MolecularBeacons應(yīng)用范圍定量起始模板濃度基因型分析鑒定產(chǎn)物單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測(cè)Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之第十六頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日MolecularBeacons優(yōu)點(diǎn)對(duì)目標(biāo)序列有很高的特異性用于SNP檢測(cè)的最靈敏的試劑之一熒光背景低Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之第十七頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日MolecularBeacons缺點(diǎn)設(shè)計(jì)困難無(wú)終點(diǎn)分析功能只能用于一個(gè)特定的目標(biāo)價(jià)格較高Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之第十八頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日TaqMan探針熒光素淬滅劑Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之TaqMan水解型雜交探針第十九頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日TaqMan目標(biāo)特異性探針5’為熒光素，3’為淬滅劑5’熒光素3’淬滅劑與目標(biāo)序列互補(bǔ)Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之第二十頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日TaqMan工作原理Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之退火:無(wú)熒光信號(hào)3’3’5’5’模板和探針雜交第二十一頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日延伸:聚合反應(yīng)5’5’3’3’TaqMan工作原理Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之第二十二頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日3’3’5’5’延伸:Taq酶切下5’端熒光素出現(xiàn)熒光TaqMan工作原理Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之第二十三頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日TaqManSNP分析TACCGGGGGTTACGAACGGTAATGA

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CCOpticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之第二十四頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日TaqMan應(yīng)用范圍定量起始模板濃度基因型分析產(chǎn)物鑒定SNP分析Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之第二十五頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日TaqMan優(yōu)點(diǎn)對(duì)目標(biāo)序列有很高的特異性

---特別適合于SNP檢測(cè)與MolecularBeacons相比設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀之第二十六頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日兼容化學(xué)試劑總結(jié)結(jié)合于雙鏈DNA的小溝中發(fā)夾型雜交探針?biāo)庑碗s交探針