紫外可見分光光度法

1、紫外光譜與分子結構的關系2、紫外可見分光光度計3、定量測定基本原理4、定性與定量方法5、光電比色法吸收光譜的來源

所有原子和分子均能吸收電磁波，其對吸收的波長有選擇性。這種現象的產生主要是因為分子的能量具有量子化特征在正常狀態下的原子或分子處于一定能級即基態，經光激發后，隨激發光子能量的大小，其能級提高一級或數級，即分子由基態躍遷到激發態。分子的吸收光譜分為三類轉動：只涉及分子轉動能級的改變，能級間距離很小，吸收光子的波長長，頻率低。能級相差10-3~10-2kcal/mol，單純的轉動光譜發生在遠紅外區和微波區振動：振動光譜反映分子轉動和振動能級改變，引起這種改變的光子能量比第一種高，兩個振動能級相距0.1~10kcal/mol，產生于波長較短，頻率較高的近紅外區，主要在1~30μ的波長區。電子光譜：吸收光子后使電子躍遷，產生電子能級的改變，即為電子光譜。能量為20~300kcal/mol。紫外吸收光譜反映分子吸收能量后所產生的電子躍遷，反映分子的電子結構特征，為物質結構的研究提供重要信息，分子的紫外光譜吸收帶的波長和強度是化合物的常數之一。由于儀器和操作方法的限制，紫外光譜只適合于具有不飽和雙鍵系統的分子。電子躍遷受分子結構的影響，所以紫外光譜能部分反映分子中電子間的相互作用。紫外光譜與紅外光譜的區別紫外光譜圖形簡單，吸收峰寬且成帶狀，紅外光譜吸收峰較尖且數目多。紫外光譜主要反映分子中不飽和基團的性質，而不反映整個分子的結構；紅外光譜則不僅能反映分子中功能基團的存在，而且與整個分子的結構有關。特點紫外光譜不僅能識別分子中的不飽和系統，而且可以測定不飽和化合物的含量同一物質相同濃度的吸收曲線，應能相互重合，這是定性鑒定的依據之一。在定量分析中，可提供選擇測定的適宜波長。因所需樣品量少，通常為微克級或毫克級，所以對測定微量成分，尤其是生物體內的有機化合物更為有利。紫外光譜與分子結構的關系1.電子躍遷類型2.常用術語3.吸收帶4.溶劑效應電子躍遷類型紫外可見吸收光譜是討論分子中的價電子有處于σ軌道上的σ電子，π軌道上的π電子和未參與成鍵而仍處于原子軌道中的n電子（亦稱p電子）。電子圍繞分子或原子運動的幾率分布叫軌道。軌道不同電子所具有的能量不同。分子軌道可以認為是當兩個原子靠近而結合成分子時，兩個原子的原子軌道的s電子就可以線性組合生成兩個分子軌道。其中一個分子軌道具有低能量稱為成鍵軌道σ。另一個分子軌道具有高能量稱為反鍵軌道σ*。同樣兩個原子的p軌道平行地重疊起來，組成兩個分子軌道時，該分子軌道稱π軌道和π*反鍵軌道。π鍵的電子重疊比σ鍵的電子重疊少，鍵能弱，躍遷所需的能量低。分子中n電子的能級，基本上保持原來原子狀態的能級，稱非鍵軌道。比成鍵軌道所處能級高，比反鍵軌道能級低。分子中不同軌道的價電子具有不同能量，處于低能級的價電子吸收一定能量后，會躍遷到較高能級。分子中電子躍遷有以下幾種類型σ→σ*躍遷σ成鍵軌道上的電子吸收光能后躍遷到σ*反鍵軌道。需較大能量，吸收峰在遠紫外區，一般都小于150nm,在200nm―400nm范圍內沒有吸收。π→π*躍遷π成鍵軌道上的電子吸收光能后躍遷到π*反鍵軌道，所需的能量小于σ→σ*躍遷的能量。孤立的π→π*躍遷一般在200nm左右，特征是吸收系數值很大，一般ε>104,為強吸收。若具有共軛雙鍵化合物，相間的π鍵與π鍵相互作用形成離域鍵躍遷，電子容易激發，使π→π*躍遷所需能量減少，共軛鍵越長躍遷所需能量越小。n→π*躍遷含有雜原子不飽和基團，如C=O,C=S,-N=N-等化合物，其非鍵軌道中孤對電子吸收能量后，向π*反鍵軌道躍遷，這種躍遷一般在近紫外區（200400nm）,吸收強度弱，ε小，約在10100之間。n→σ*躍遷如含有-OH，-NH2，-X，-S等基團化合物，其雜原子中孤對電子吸收能量后向σ*反鍵軌道躍遷，這種躍遷所吸收的波長在200nm左右。上述4種類型的電子躍遷，按照所需能量大小其順序為：σ→σ*>n→σ*>π→π*>n→π*常用術語生色團（chromophore）有機化合物分子結構中含有π→π*或n→π*躍遷的基團，如C=C，C=O，-N=N-，-NO2，-C=S等，能在紫外可見光范圍內產生吸收的原子團。助色團（auxochrome）是指含有非鍵電子的雜原子飽和基團，如-OH，-NH2，-OR，-SH，-SR，-Cl，-Br,-I等當它們與生色團或飽和烴相連時，能使該生色團的吸收峰向長波方向移動，并使吸收強度增加的基團。3．紅移(redshift)也稱長移，由于化合物結構改變，如發生共軛作用，引入助色團以及溶劑改變等，使吸收峰向長波方向移動。4．藍（紫）移(blueshift)也稱短移。當化合物的結構改變時或受溶劑影響使吸收峰向短波方向移動。增色效應(hyperchromiceffect)由于化合物結構改變或其他原因，使吸收強度增加。減色效應(hypochromiceffect)使吸收強度減弱。強帶和弱帶(strongbandandweakband)化合物的紫外可見吸收光譜中，凡摩爾吸收系數εmax值大于104的吸收峰稱為強帶；凡εmax值小于103的吸收峰稱為弱帶。吸收帶（absorption）

R帶由n→π*躍遷引起的吸收帶。是雜原子的不飽和基團，如C=O，-NO，-NO2，-N=N-等這一類發色團的特征。特點：1處于較長波長范圍（300nm）弱吸收，一般小于1002溶劑極性增加，R帶發生短移。3當有強吸收峰在其附近時，R帶有時出現長移，有時被掩蓋。因此，若測定n→π*躍遷要用較濃溶液；在非極性溶劑中吸收峰在較長波長處，若改用極性溶劑時，吸收峰短移，說明R帶存在。K帶相當于共軛雙鍵π→π*躍遷所產生的吸收峰。特點：值一般大于104，為強吸收帶。B帶芳香族（包括雜芳香族）化合物的特征吸收帶。E帶也是芳香族化合物特征吸收，認為是由苯環結構中三個乙烯的環狀共軛體系的π→π*躍遷所產生，分為E1和E2。E1帶的吸收峰約在180nm，為4.7104;E2帶的吸收峰約在200nm,為7000。溶劑效應化合物在溶劑中的紫外吸收光譜受溶劑影響較大，所以一般應注明所用溶劑。溶劑的極性不同，對n→π*躍遷和π→π*躍遷所產生的吸收峰位置向不同方向移動，改用極性較大的溶劑，一般使π→π*躍遷吸收峰向長波方向移動；而使n→π*躍遷吸收峰藍移，后者的移動一般比前者移動大。溶劑要求不能與樣品反應樣品溶液中能達到一定濃度在所測定的波長范圍內，溶劑沒有吸收常用溶劑的極限吸收波長溶劑波長（nm）乙腈190環己烷198水200甲醇202乙醇205異丙醇203三氯甲烷245乙酸乙酯254DMSO265吡啶305吸收強度當光經過均勻的透明介質時，一部分在介質的表面分散或反射，一部分為介質所吸收，只有一部分可透過介質，故透過光的強度減弱。反射光在測定中可用空白校正而忽略不計。一個透明介質所吸收的能量和照射光的強度無關，吸收光子的物質的濃度和介質的厚度有關。吸收帶的強度分子的紫外光譜有兩個特征：吸收帶的波長決定于分子激發態和基態的能級。若兩個能級相距小，則躍遷所需的能量低，吸收帶的波長長。但能級相差大時，躍遷能高，吸收帶波長短。吸收強度，一般認為吸收強度決定于從基態躍遷到某一能級的幾率或吸光分子的多少。分子吸光系數可以表示為ε=kpαk為一常數，其級數為1020，p為幾率α為分子橫切面積。分子中吸收光子的有關電子躍遷部分的面積。面積大，容易被擊中，強度大。紫外可見分光光度計紫外可見分光光度計是在紫外可見光可任意選擇不同波長的光測定吸光度的儀器。光路示意圖光源→單色器→吸收池→檢測器→訊號處理及顯示器光源

要求發射強度足夠且穩定的具有連續光譜且發光面積小的光源。對分子吸收測定來說，通常希望能連續改變測量波長進行掃描的測定，故分光光度計要求具有連續光譜的光源。鎢燈或鹵鎢燈固體熾熱發光，用于可見區光源。要求供電電壓穩定。氫燈或氘燈氣體放電發光，發射自150nm至約400nm的連續光譜，用于紫外區光源。單色器

單色器的作用是將來自光源的連續光譜按波長順序色散，并從中分離出一定寬度的譜帶。單色器由進口狹縫、準直鏡、色散元件、聚焦透鏡、出口狹縫組成。1.色散元件使各種不同波長的平行光有互不相同的投射方向（或偏轉角），是單色器中最重要的。棱鏡光柵

棱鏡棱鏡的色散作用由于棱鏡材料對不同波長的光有不同的折光路率，因此可從混合光中所包含的各個波長從長波長到短波長依次分散成為一個連續光譜。棱鏡分光得到的光譜按波長排列是疏密不均的長波長密，短波長疏，即光距與各條波長是非線形的。棱鏡材料有玻璃和石英兩種，玻璃對可見區的色散率比石英大，石英對紫外光有很好的色散作用，但在可見區不如玻璃。

光柵是一高度拋光的表面上刻出大量平行等距離的槽。射到每一條槽上的光被衍射或散開成一定的角度，在其中的某些方向產生干涉作用，使不同波長的光有不同方向，出現各級明暗條紋形成光柵的各級衍射光譜。光柵色散后的光譜與棱鏡不同，光柵的光譜是由紫到紅，各譜線間距離相等，是均勻分布的連續光譜。光柵光譜是多級光譜，各級重疊，相互干擾，需用濾光片濾去高級序光譜。2.準直鏡以狹縫為焦點的聚光鏡。將進入單色器的發散光變成平行光，又用作聚光鏡，將色散后的平行單色光聚集于出口狹縫。一般用鍍鋁的拋物柱面反射鏡作為準直鏡。3.狹縫狹縫寬度直接影響分光質量，狹縫過寬，單色光不純，可使吸光度變值;狹縫過窄，光通量小，降低靈敏度，若增大放大器放大倍數而使噪音增大，影響準確度。吸收池用光學玻璃制成的吸收池，只能用于可見光區。用熔融石英（氧化硅）制的吸收池，適用于紫外光區，也可用于可見光區。空白溶液的吸收池與樣品溶液的吸收池應相互匹配，即有相同的厚度與相同的透光性。檢測器

一般常用光電效應檢測器（光電池和光電管），將接收到的輻射功率變成電流的轉換器。光電池光電管光電倍增管光二極管陣列檢測器

光電池是一種光敏半導體，當光照時就產生電流，在一定范圍內光電流大小與照射光強成正比，可直接用微電流計測量。光電池有硒光電池和硅光電池。硒光電池只能用于可見光區，硅光電池同時適用于紫外區和可見區。

光電管

光電管是由一個陽極和一個光敏陰極組成的真空（或充少量惰性氣體）二極管，陰極表面鍍有堿金屬或堿金屬氧化物等光敏材料，當它被有足夠能量的光照射時，能夠發射出電子。當兩極間有電位差時，發射出的電子向陽極移動而產生電流，電流大小決定于照射光強度。

光電倍增管原理與光電管相似，結構的差別是在涂有光敏金屬的陰極和陽極之間還有幾個倍增級（一般是9個）。

儀器靈敏度大大提高。

光二極管陣列檢測器在晶體硅上緊密排列一系列光電二極管檢測管，每一個二極管相當于一個單色儀的出口狹縫。訊號處理及顯示器

光電管輸出的電訊號很弱，須經放大才能以某種方式將測量結果顯示出來。顯示器的顯示方式一般都有透光率與吸收度，有的還可以轉換成濃度，吸光系數等顯示定量測定基本原理

Beer-Lambert定律

A=lgT=ElC說明物質對單色光吸收強弱與吸光的濃度和厚度間關系的定律.

吸光系數:單位濃度及單位厚度時的吸光度稱為吸光系數(absorptivity)。吸光度與濃度或厚度之間是簡單的正比關系,其中E是比例常數。吸光系數有兩種常見的表示方式

摩爾吸光系數是指在一定波長時,溶液濃度為1mol/L,厚度為1cm的吸光度,用或EM標記.

百分吸光系數是指在一定波長時,溶液濃度為1%,厚度為1cm的吸光度,或稱為比吸光系數，是指在一定波長時,溶液濃度為1%(W/V),厚度為1cm的吸光度,用E1%

1cm表示。吸光系數兩種表示方式之間的關系是：

=M/10E1%

1cm

2．影響測定的因素A=lgT=ElC化學因素：光學因素

化學因素：溶液中溶質可因濃度改變，有離解，締合與溶劑間作用等因素。2）光學因素：

非單色光：Beer定律的前提是單色光，主要原因是由于物質對不同波長的光有不同的吸收系數。事實上真正的單色光難以得到。

雜散光：從分光器得到的單色光中，有一些不在譜帶寬范圍內的與所需波長相隔較遠的光。一般來源于儀器制造過程中的瑕疵，儀器保養不善，光學元件受到塵染或霉蝕是雜散光增多的常見原因。散射光和反射光：吸光質點對入射光有散射作用，入射光在吸收池內外界面之間通過時又有反射作用。散射光和反射光都是入射光譜帶寬度內的光，對透射光強度有直接影響。非平行光：斜光通過吸收池的光程比平行光的光程長。定性與定量方法1、定性鑒別2、純度檢驗3、定量測定一．定性鑒別主要依據多數有機化合物具有吸收光譜特征，如形狀，吸收峰數目，吸收峰波長位置，強度和吸收系數值等。利用紫外可見分光光度法進行化合物的定性鑒別，一般采用將樣品化合物的吸收光譜特征與標準化合物的吸收光譜特征對照比較，兩者完全相同，則可能是同一化合物，兩者有明顯差別，則肯定不是同一種化合物。1、對比吸收光譜特征數據最常用于鑒別的吸收光譜特征數據是吸收峰所在的波長。若一個化合物有幾個吸收峰，并存在谷及肩峰，應同時作為鑒定依據。具有相同或不同的吸收基團的不同化合物，可有相同的吸收峰值，但它們的分子量一般不同，因此其E值有明顯不同，所以，吸光系數常用于化合物定性鑒別。2、對比吸光度（或吸收系數）的比值

吸收峰多于一個的化合物，可用在不同吸收峰處（或峰與谷）測得吸光度的比值作為鑒別的依據。A1E1ClE1——=———=——A2E2ClE23、對比吸收光譜的一致性將試樣與已知標準品配制成相同濃度的溶液，在同一條件下分別描繪吸收光譜，核對其一致性。用紫外吸收光譜數據或曲線進行定性鑒別，有一定的局限性。因為紫外吸收光譜一般只有1個或幾個寬吸收帶，曲線的形狀變化不多；在眾多化合物中，不相同的化合物可以有很類似甚至雷同的吸收光譜。所以在得到相同的吸收光譜時，應考慮到有并非同一物質的可能性。而兩種純化合物的吸收光譜有明顯差別時，卻可以肯定不是同一化合物。二．純度檢驗1、雜質檢查如果化合物在紫外可見區無明顯吸收，雜質有較強吸收，那么雜質可用光譜檢查出來。如果化合物有較強的吸收峰，而雜質在此波長處無吸收，或吸收很弱，雜質的存在使化合物的吸光系數值降低；若雜質在此波長處有比化合物更強的吸收，將使化合物的吸光系數值增大；有吸收的雜質也將使化合物的吸收光譜變形；這些都可作為檢查雜質是否存在的方法。2、雜質的限量檢查藥物中的雜質，須制定一個容許其存在的限量。利用雜質和化合物吸收峰的不同，測定雜質量。利用峰谷吸收度比值控制雜質限量。三．單組分的定量方法根據Beer定律，物質在一定波長處的吸收度與濃度之間有線形關系。選擇一定的波長測定溶液的吸光度，即可求出濃度。

波長選擇：1）光譜的最大吸收峰處；2）被測物如有幾個吸收峰，選不易有其它物質干擾的較高的吸收峰；3）一般不選末端的吸收峰。

溶劑選擇：不干擾被測組分的測定。1吸光系數法吸光系數法根據Beer定律，A=ElC，若l,E知，可根據測得的A求出被測物的濃度。2標準曲線法先配制一系列濃度不同的標準溶液，在測定條件相同下，分別測定其吸收度然后以標準溶液的濃度為橫坐標，以相應的吸收度為縱坐標，繪制A―C關系圖，如果符合Beer定律，可獲得一條通過原點的直線。在相同條件下測出樣品的吸光度，就可以從標準曲線上查出樣品溶液的濃度。也可用回歸方程計算樣品溶液的濃度。3.對照法在同樣條件下配制標準溶液，在選定波長處，分別測定吸光度，根據定律：A標=EC標lA樣=EC樣l因是同種物質，同臺儀器及同一波長測定，故E，l相等，所以，A標C標=A樣C樣

A樣·C標C樣(%)=——————A標4．多組分的測定方法有兩種或多種組分共存時，可根據各組分吸收光譜相互重疊的程度分別考慮測定方法。最簡單的情況是各組分沒有吸收峰重疊，則可按單組分的測定方法分別在各組分的最大波長處測定。1.解線性方程組法2.雙波長分光光度法等吸收雙波長消去法系數倍率法3三波長法4.導數光譜法五．光電比色法可見分光光度法是對于能吸收可見光的有色溶液的測定方法，通常稱為光電比色法。許多不吸收可見光的無色物質可以用顯色反應變成有色物質，用光電比色法測定，提高測定靈敏度和選擇性。顯色反應類型：絡合反應，氧化還原反應，縮合反應等。應用最廣的是絡合反應。1.顯色反應及其條件金屬離子與配位體可形成穩定的有色絡合物或絡離子，吸收系數值可高達105，靈敏度高，有較好的選擇性，適用于微量比色分析。1)顯色反應需符合