基因工程常規(guī)技術聚合酶鏈式反應第一頁，共二十三頁，2022年，8月28日(polymerasechainreaction,PCR)聚合酶鏈反應SectionFour第二頁，共二十三頁，2022年，8月28日一、什么是PCR?是體外核酸擴增技術。1985年美國PE-Cetus公司的K.B.

Mullis等發(fā)明的。DNA是由四種堿基按互補配對原則組成的螺旋雙鏈。在細胞內(nèi)，DNA復制時，解螺旋酶首先解開雙鏈讓它變成單鏈做為模板，然后，RNA聚合酶合成一小段引物（primer）結(jié)合到DNA模板上，最后，DNA合成酶以這段引物為起點，合成與DNA模板配對的新鏈PCR就是在體外模擬DNA復制的過程，它用加熱的辦法讓DNA片段變性變成兩條單鏈，讓人工合成兩個引物結(jié)合到DNA模板兩端，DNA聚合酶即可以大量復制該模板。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優(yōu)點第三頁，共二十三頁，2022年，8月28日AGAACTTTCTTGAAAGAACTTTCTTGAATCTTGAAAGAACTT親代DNA子代DNA二、PCR的基本原理DNA的復制(replication)

由親代DNA合成兩個相同的子代DNA的過程第四頁，共二十三頁，2022年，8月28日（一）原理

在模板、引物、4種dNTP和耐熱DNA聚合酶存在的條件下，特異擴增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段的酶促合成反應

PCR反應擴增的是一對引物之間的DNA片段第五頁，共二十三頁，2022年，8月28日（二）基本過程變性：加熱使雙鏈DNA變?yōu)閱捂溚嘶穑航禍厥挂锖突パa模板在局部形成雜交鏈延伸：耐熱DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物為起始點的延伸反應第六頁，共二十三頁，2022年，8月28日第七頁，共二十三頁，2022年，8月28日第八頁，共二十三頁，2022年，8月28日第九頁，共二十三頁，2022年，8月28日（三）PCR基本反應以DNA為模板的反應反應體積：50~100μLbuffer引物一對底物：4種dNTP模板：102~105拷貝耐熱DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）礦物油模板DNA的用量可根據(jù)其分子量的大小調(diào)整第十頁，共二十三頁，2022年，8月28日PCR緩沖液在PCR體系中Buffer通常采用10mmol/LTris-HCl（），其中的二價陽離子（通常為Mg2+）可以激活DNA聚合酶的活性中心，Mg2+的濃度可影響PCR擴增產(chǎn)物的特異性。K+（50mmol/L）利于引物與模板的退火明膠或血清白蛋白及去污劑（Tween20）起到對TaqDNA聚合酶的穩(wěn)定作用第十一頁，共二十三頁，2022年，8月28日第十二頁，共二十三頁，2022年，8月28日循環(huán)參數(shù)變性溫度和時間：按模板DNA復雜程度來調(diào)整變性溫度和時間。94℃，1min；95℃，30s；97℃，15s；退火溫度和時間：45~55℃，30s~1min延伸溫度和時間：72℃，時間因擴增片段的長度而異：1kb，1min；3~4kb,3~4min循環(huán)次數(shù)：25~35次，視最初靶分子濃度而定第十三頁，共二十三頁，2022年，8月28日（一）PCR引物設計PCR效率和特異性取決于兩個方面：一是引物與模板的特異結(jié)合，二是聚合酶對引物的有效延伸。三、PCR相關知識第十四頁，共二十三頁，2022年，8月28日PCR引物設計原則1.引物長度一般15~30個核苷酸。引物過短會使PCR的特異性降低，過長會提高相應的退火溫度，并使延伸溫度超過TaqDNA聚合酶的最適溫度74℃,亦會影響產(chǎn)物的生成，且合成引物成本增加2.引物中的堿基盡可能隨機分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶的堆積現(xiàn)象。尤其是引物的3′端不應有連續(xù)3個G和C。否則會使引物在模板的G+C富集序列區(qū)錯誤配對。引物中G+C的含量在45~55%左右。設計引物時要考慮3′端和5′端引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物長度要確保解鏈溫度不低于54℃3.引物自身內(nèi)部不應存在互補序列以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構。一般引物自身存在的連續(xù)互補序列，不超過3bp4.兩引物之間不應存在互補序列，尤其是3′端第十五頁，共二十三頁，2022年，8月28日5.引物的堿基序列不應與非擴增區(qū)域有同源性。尤其是引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。6.引物3′端堿基是引發(fā)延伸的起點，因此一定要與模板DNA配對。引物3′端的最佳堿基選擇是G和C。因為它們形成的堿基配對比較穩(wěn)定。7.引物的5′端可以修飾，如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素，熒光物質(zhì)，地高辛標記，加入其它短序列包括起始密碼子等。在PCR的起始反應中，引物5′端游離的堿基并不影響引導新生鏈DNA合成的能力。但在后續(xù)的擴增循環(huán)中，這些與初始模板不配對的序列被帶到PCR產(chǎn)物的雙鏈中去，所以如此引物參與的PCR產(chǎn)物，既含有目的擴增片段又含有兩側(cè)引入的核苷酸序列第十六頁，共二十三頁，2022年，8月28日（二）模板的取材病原體標本：病毒、細菌、真菌、螺旋體、立克次體、支原體等病理生理標本：細胞、血液、絨毛、尿液等法醫(yī)學標本：血斑、精斑、毛發(fā)考古標本第十七頁，共二十三頁，2022年，8月28日（三）TaqDNA聚合酶

TaqDNA聚合酶在75~80℃具有最高的聚合酶活性。75~80℃每個酶分子每秒可延伸約150個核苷酸，

70℃時60個核苷酸/秒以上。

55℃時22個核苷酸/秒；

37℃1.5個核苷酸/秒

22℃時0.25個核苷酸/秒。溫度超過80℃時，合成速度明顯下降，可能與引物和模板結(jié)合穩(wěn)定性遭到破壞有關，72℃最適溫度。第十八頁，共二十三頁，2022年，8月28日TaqDNA聚合酶沒有3′→5′外切酶活性。沒有校正功能。對于30次循環(huán)的PCR擴增反應。此酶的錯配率為0.1%～0.25%。TaqDNA聚合酶具有類似未端轉(zhuǎn)移酶的功能，能催化dNTP加到DNA的3′-OH端。但對4種dNTP聚合到3′-未端的能力不同，對dATP的聚合能力高于其他3種核苷酸，因此PCR產(chǎn)物的末端總是帶有兩個A第十九頁，共二十三頁，2022年，8月28日附：PfuDNA聚合酶此酶來自激烈熱球菌（Pyrococcusfariosus），耐熱性極好，在97.5℃半衰期大于3小時，具有35外切酶活性，催化DNA合成的忠實性比TaqDNA聚合酶高12倍，是目前使用最廣泛的具有35外切酶活性的耐高溫聚合酶第二十頁，共二十三頁，2022年，8月28日上海閃晶分子生物科技有限公司

來自嗜熱細菌（Thermusthermophilus）74℃溫度下進行擴增，在95℃的半衰期只有20min。在Mg2+存在下以DNA為模板合成DNA，而在Mn2+存在下以RNA為模板合成cDNA。催化RT-PCR、反轉(zhuǎn)錄編號規(guī)格售價￥ZP00401100U400ZP00402500U1600ZP004031000U3000

TthDNA聚合酶第二十一頁，共二十三頁，2022年，8月28日VentDNA聚合酶VentDNA聚合酶來自嗜熱高溫球菌（Thermococcuslitoralis）是一種高保真的耐熱DNA聚合酶，其保真度比TaqDNA聚合酶高5倍。該酶具有高保真性的其中一個原因是自身具有3‘→5’核酸外切酶校讀活性。在95℃溫育1小時后，仍具有90%以上的聚合酶活性，耐熱。VentR?（exo-）DNA聚合酶是VentDNA聚合酶經(jīng)基因工程改造而得