DNA重組實驗中常用的技術一、質粒DNA的提取及鑒定（一）質粒DNA的提取及鑒定1．收獲細菌（1）將2ml含相應抗生素的LB液體培養基加入到通氣良好的15ml的試管中，接入一單菌落，于37℃劇烈振蕩培養過夜。（2）將1.5ml培養物倒入1.5ml離心管中，用臺式離心機于4℃以12000g離心5min，將剩余的培養物貯存于4℃。（3）吸盡培養液，使細菌沉淀盡可能干燥。2．堿裂解法小量抽提質粒（1）將細菌沉淀[上述步驟（3）所得]重懸于100μl預冷的溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/lTris–HClpH8.0,10mmol/LEDTA）中，劇烈振蕩。（2）加200μl新配制的溶液Ⅱ（0.2mol/lNaOH,1%SDS），緩和振蕩，水浴5min。（3）加150μl預冷溶液Ⅲ（50mol/LKAC60ml,冰乙酸11.5ml,水28.5ml），緩和振蕩，冰浴5min。（4）4℃以12000g離心5min，將上清轉移到另一離心管中。（5）可作不可作：加等量飽和酚，氯仿，振蕩混勻，重復2，（4）。（6）用2倍體積無水乙醇室溫沉淀雙鏈DNA，振蕩混合，于室溫放置2min。（7）4℃以12000g離心5min。（8）小心吸盡上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，再將附于管壁的液滴除盡。（9）用75%乙醇于4℃洗滌DNA，同上離心去上清真空抽干。（10）加50μl的1×TE（含20μg/ml無DNA酶的胰RNA酶），振蕩，貯存于-20℃。（二）質粒DNA的大量制備（1）同上1.（1）（2）將1ml含菌液倒入含相應抗生素的Lb100ml中，37℃振蕩培養至A590=1.0(5～6h)。（3）加氯霉素（170μg/ml）擴增，37℃溫箱中培養過夜。（4）收集菌液于離心管中，冰浴10min。3000rpm,離心10min，去上清。（5）加溶液Ⅰ5ml懸浮菌體，將懸液倒入高速離心管中，搖勻，冰浴5min。（6）加溶液Ⅱ10ml輕輕混勻，室溫下5min。（7）加溶液Ⅲ7.5ml輕輕混勻，冰浴30min。15000rpm，4℃離心20min。（8）取上清液于高速離心管中，加2倍體積的無水乙醇，混勻，入-20℃3～5h。（9）15000rpm4℃離心20min。（10）棄上清，將離心管倒放入真空泵中抽干（10～15min）。（11）用5ml1×TE溶解，加入RNaseA15～20μl，42℃水浴4h于過夜。（12）加入5ml飽和酚，混勻，4000～5000rpm離心5min，取上清液入5ml離心管內。（13）分別加入2.5ml飽和酚，2.5ml氯仿，混勻后同樣離心收集上清。（14）加等體積氯仿/異戊醇（24：1）混勻，同樣離心收集上清。（15）加入1/10體積的3mol/lNaAc及2倍體積的無水乙醇于-20℃3～5h。（16）10000rpm4℃離心20min。（17）棄上清，加入75%乙醇洗滌2次。（18）離心棄上清，真空抽干，加入適量1×TE溶解質粒DNA。（三）質粒DNA的鑒定1．酶切反應（1）在0.5mlEppendorf管中加重蒸水6μl，10×Buffer1μl，DNA2μl，酶1μl，混勻，37℃水浴1h以上。（2）取反應物點樣，觀察酶切效果。（3）酶切完全后，70℃5min終止反應。2．瓊脂糖電泳（1）配制所需濃度瓊脂糖凝膠。（2）在待測的DNA樣品中加1/5體積的溴酚藍指示劑，混勻后點樣。（3）打開電源開關，5V/cm電泳。（4）在UV燈下觀察電泳結果。二、DNA的重組（一）DNA的酶切與連接（1）酶切反應同質粒DNA的鑒定，只不過是質粒DNA換為載體DNA。若大量酶切，則成比例增加。（2）加2倍體積的預冷無水乙醇和1/10體積的3mol/lNaAc混勻，-20℃2h以上。（3）15000rpm離心15min，棄上清。（4）加入75%乙醇洗滌2次，離心棄上清，真空抽干。（5）加入適量1×TE溶解。如此可得線性化載體DNA。（6）測定DNA的含量。（7）加入線性載體DNA和含量3～4倍于載體的待插入DNA片段，連接緩沖液及T4連接酶適量至總體積為20μl，在12～14℃反應12～16h。（8）連接反應液可置-20℃保存，供轉化用。（9）關于待插入DNA片段的獲得參見附注。（二）大腸桿菌感受態的制備及重組DNA的轉化1．感受態的制備（1）接種單菌落于2mlLB培養液中，37℃過夜。（2）取0.25ml過夜菌入25mlLB培養液中，37℃振搖4～6h至A590=0.4～0.6。（3）倒入50ml管內，水浴10min，以2500～3000rpm離心5min，棄上清。（4）緩慢加入75mmol/L預冷CaCl25ml懸浮菌體，冰浴20min，同上離心棄上清。（5）緩慢加入75mmol/L預冷CaCl21.0ml輕輕混勻后分裝在1.5mlEppendorf管中，每管200μl，冰浴1～2h。2．重組DNA的轉化（1）將3只Eppendorf管按下列轉化項目作好標記，然后按下述進行：轉化項目受體菌DNA總體積DNA對照組010μl200μl受體菌對照組200μl0200μl轉化組190μl10μl200μl（2）冰浴30min至1h。中間搖動3次，以防受體菌沉底。（3）42℃90s。（4）37℃水浴5min。（5）加入無相應抗生素的Lb200μl，混勻后，37℃水浴30～60min。（6）分別取3組反應物各50μl在含相應抗生素的固體LB培養基平皿上涂布，室溫下干燥，然后倒置于37℃溫箱中培養過夜。（三）轉化子DNA的快速鑒定－快速細胞破碎法（1）挑取轉化平板上的單菌接種于含相應抗生素的2mlLB中，37℃振蕩培養至A590值為0.6～0.8。（2）取1ml菌液至1.5mlEppendorf管中，9000rpm離心9min，去盡上清。（3）加入70μlCrackingGel緩沖液[1mol/LTris–HCl(pH6.8)10ml,20%SDS10ml,250mmol/LEDTA1.6ml,蔗糖27.2g,1.2%溴酚藍1.67ml，加雙蒸水至200ml]，混勻后，37℃水浴30min以上。（4）15000rpm離心15min。（5）吸取上清點樣電泳，觀察。（四）轉化子DNA的酶切鑒定1．轉化子DNA的快速少量抽提（1）同本節二.（三）.1.（2）菌液移至5mlEppendorf管中，9000rpm,離心9min，去上清。（3）加溶液Ⅰ100μl，溶液Ⅱ200μl，溶液Ⅲ150μl，混勻，冰浴10min。（4）15000rpm離心15min。（5）吸取上清，加入異丙醇1ml混勻，置室溫15～30min。（6）15000rpm離心15min，棄上清，加入75%乙醇洗滌2次。（7）離心棄上清，真空抽干，加入適量1×TE溶解DNA。（8）取少量DNA電泳，觀察濃度。2．轉化子DNA的小量酶切鑒定同質粒DNA的小量酶切鑒定，見本節一（三）。（五）重組子DNA的進一步鑒定可用Southern印跡雜交法或斑點雜交法等進一步鑒定，詳見本節四。[附]電泳洗脫法回收酶切DNA片段（1）用合適的酶切割DNA并電泳。（2）于紫外燈下從凝膠上切下所要的DNA帶，裝入含1×TBE緩沖液的透析代內，用夾子封好袋口，并檢查有無漏孔。（3）將透析袋（縱長）與兩極間的邊線垂直放于電泳槽內電泳，4～5V/cm電泳至DNA貼緊袋壁。（4）取出透析袋，擠出凝膠塊，吸出袋內液體放入1.5ml的離心管內，10000rpm離心5min。（5）吸出上清放入離心管內，加入等體積的飽和酚和等體積的氯仿，振蕩混勻，10000rpm離心5min，吸出上清放入新的離心管內。（6）加入1/10體積的3mol/LAaAc,2倍體積預冷的無水乙醇，于-20℃放置4～5h。（7）于4℃，10000rpm離心15min，棄上清。（8）用75%的酒精洗滌2次，每次均于4℃，10000rpm離心5min，棄上清。（9）真空抽干，并用適量1×TE溶解沉淀。如此即得所需DNA片段。三、地高辛配基隨機標記DNA探針法（一）概述基因診斷是以核酸分子雜交技術為基礎，在核酸水平檢測人類遺傳性疾病的基因缺陷和一些傳染病病原體的方法。其基本過程是：制備DNA探針，標記探針，檢測樣本。開展這項工作的關鍵是要得到高靈敏度、高特異性的探針。以往人們是用放射性同位素來標記探針DNA。近年來，非同位素標記方法發展很快，已有取代同位素標記法的趨勢。地高辛配基隨機標記DNA探針法，是較為成功的一種非同位素標記方法。其原理是：用化學方法把類固醇類半抗原地高辛分子連接在dUTP上（Dig-dUTP）。用隨機引物及DNA多聚酶，以探針DNA為模板，合成互補DNA，化學修飾過的dUTP同時摻入到標記的DNA探針中。雜交后用堿性磷酸酶標記的抗地高辛單抗與標記探針DNA中的Dig-dUTP結合，加入顯色底物，在堿性磷酸酶作用下，轉變成深棕色或藍色的化合物。1．標記本試劑盒采用隨機引物標記方法，可標記少至10ng，多至3μg的DNA。能在新合成的DNA鏈每20～25個核苷酸，摻入一個Dig-dUTP，反應時間約為1h。2．雜交按標準雜交方法進行?？梢圆捎媚猃埬せ蛳跛崂w維素膜。用過的雜交液可凍存于-20℃，重復使用。3．免疫學檢測封阻后，檢測反應的第一步，抗體結合物與標記DNA結合，出現雜交的半抗原-標記DNA，顯色反應起始是在堿性pH條件下加入無色的顯色劑X-磷酸鹽和NBT，在幾分鐘內便開始出現藍色，顯色反應的過程持續3d。典型的例子是在24h后終止顯色反應。用二甲基甲酰胺洗掉尼龍膜上的顏色后，尼龍膜可重新用于雜交。4．應用地高辛配基標記DNA探針及檢測試劑盒，能檢測0.1pg的同源DNA，能檢測1μg哺乳動物DAN中的單拷貝基因，與放射性標記系統比較，此試劑盒能快速得到實驗結果（從DNA的標記和雜交至見到檢測結果24h內能完成），而且消除了放射性的不安全問題。這試劑的靈敏度與特異性使它適用于所有的雜交技術（包括DNA-印跡轉移，菌落雜交，噬菌斑雜交及原位雜交）以替代同位素標記和放射自顯影術。（二）試劑盒成份1．無標記對照DNA1此管內有20μlpBR328DNA100μg/ml,pBR328分別用BamHⅠ,BglⅠtHinfⅠ消化，它們的混合比例為2：3：3，共有16個Pbr328片段，這些片段的大小分別為：4907，2176，1766，1230，1033，653，517，453，298，234，234，220和154×2bp。2．無標記對照DNA2此管內有20μlpBR328DNA200μg/ml，已用EcoRⅠ線性化。3．DNA稀釋緩沖液有兩管，每管1ml[成分為：Tris-HCl(10mmol/L),EDTA(1mmol/L),pH8.0(20℃)]內含鮭魚精DNA（50μg/ml）。4．標記對照DNA此管內有50μl線性化pBR328DNA，按標記方法已標記有地高辛配基dUTP,含20μg模板DNA，每毫升含5μg合成的標記DNA。5．六聚核苷酸混合物6．標記用混合底物此管內有50μl10倍濃度的dNTP標記用混合底物，含dATP（1mmol/L）dCTP(1mmol/L),dGTP(1mmol/L),dTTP(0.65mmol/L)和Dig-dUTP(0.35mmol/L),pH6.5(20℃)。7．DNA聚合酶Ⅰ大片段（標記級）此管內有25μlDNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow），2U/μl。8．（Dig）AP結合物此管內有200μl多克隆羊抗地高辛配基Fab-片段，結合有堿性磷酸酶750U/ml。9．NBT有兩管，每管1.25ml，是溶于70%（V/V）二甲基甲酰胺的硝基藍四唑鹽溶液（75mg/ml）。10．X-磷酸鹽有兩管，每管0.9ml，是溶于二甲基甲酰胺的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽的甲苯胺溶液（50mg/ml）。11．封阻試劑有兩瓶，每瓶有50g粉劑。（三）需配制的溶液EDTA（0.2mol/L）,pH8.0(20℃);LiCl(4mol/L);70%(V/V)乙醇；Tris-HCl(10mmol/L);ED－TA(1mmol/L),pH8.0(20℃);10%(V/V)N-十二烷基肌氨酸鈉鹽；10%（V/V）SDS；20×SSC：3mol/lNaCl;0.3mol/L檸檬酸三鈉；pH7.0Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L);pH7.5Tris–HCl(100mmol/L);NaCl(100mmol/L);MgCl2(50mmol/L)pH9.5(20℃)。（四）操作方法1．標記DNA探針每次標準的反應可標記10ng至3μg線性的DNA，也可標記更大量的DNA，但所有的成分和體積要相應增加。（1）DNA探針熱變性，煮沸10min，迅速冷卻于冰/乙醇中5min以上，待用。（2）取Eppendorf管（1.5ml）置于冰上，加下列及試劑：新鮮變性的DNA1-3μg六聚核苷酸混合物2μl（管5）dNTP標記用混合底物2μl（管6）加無菌重蒸水至19μlDNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow）1μl（管7）（3）在37℃保溫至少60min，可到20h。（4）煮沸5min，終止反應。（5）15000rpm離心30s，置于冰上待用。2．預雜交按100cm2膜用20～40ml預雜交溶液，預雜交時使溶液處于流動狀態。預雜交液組成：5×SSC0.5%（W/V）封阻試劑（管11）0.1%（W/V）N-十二烷酰肌氨酸鈉0.02%（W/V）SDS膜放入塑料袋，灌入預雜交液，排除氣體后密封，在65℃預雜交過夜。3．雜交按100cm2膜用2.5ml雜交液，雜交時偶爾搖動雜交袋，使里面的溶液重新分配。雜交液組成：50%甲酰胺（V/V）5%（W/V）封阻試劑5×SSC0.1（W/V）N-十二烷酰肌氨酸鈉0．02%(W/V)SDS新變性標記DNA（150ng/ml）雜交液取代預雜交液，替換間膜不能干，成功地替換應是膜與塑料袋間形成一層雜交液膜。于42℃雜交過夜（16～20h）。4．洗膜按100cm2膜用250ml洗膜液計算。（1）在室溫下用2×SSC/0.1%（W/V）SDS溶液漂洗，5min，2次。（2）在65℃條件下用0.1×SSC/0.1%SDS溶液漂洗，10min，2次。（3）在室溫下用2×SSC溶液漂洗1次。5．免疫測定（1）配制溶液緩沖液1：Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L)pH7.5(20℃）緩沖液2：0.5%(W/V)封阻試劑(管11),配制于緩沖液1中(封阻試劑不會快速溶解,因此應預早1h前配制此溶液,將試劑溶于50～70℃,此溶液保持混濁)。緩沖液3：Tris-HCI(100mmol/L);NaCI(100mmol/L);MgCI2(500mmol/L)pH9.5(20℃)。緩沖液4：Tris-HCl(10mmol/l);EDTA(1mmol/L);pH8.0(20℃)顯色溶液：新鮮配制，在10ml緩沖液3中，加45μlNBT溶液（管9）和35μlX-磷酸鹽緩沖液（管10）。2．顯色過程A．膜在緩沖液1中短暫洗滌（1min）。B．在100ml緩沖2中保溫30min。C．再用緩沖液1短暫洗滌。D.用緩沖液1稀釋的抗體結合物(管8)至150U/L(1:5000);稀釋后的抗體結合物在4℃只能穩定12h。E.膜在20ml稀釋的抗體結合物溶液中保溫30min。F.用100ml緩沖液1洗膜,以除去未結合的抗體結合物,15min,2次。G.膜在緩沖液3中平衡2min。H.在黑暗條件下,膜與10ml顯色溶液放入塑料袋內密封或放入合適的盒子內,幾分鐘內開始出現顏色,一般顯色反應在1天后全部完成。當顏色顯影時，不可振蕩或攪拌。I．當要求的點或帶已被檢測時，可用50ml緩沖液4洗膜5min終止反應。J．攝相。說明：上述各反應均在室溫下進行，除了顯色反應外，均需振蕩或攪拌。（五）排除實驗中問題的方法1．DNA不能有效地被標記時考慮（1）用酚/氯仿抽提和/或乙醇沉淀，重新純化DNA。（2）標記反應的保溫時間延長（增至20h）。（3）DNA變性或許不完全，這時對大片段DNA特別重要。2．不能達到預期的靈敏度時考慮（1）DNA標記率。（2）增加標記DNA的濃度或增加雜交時間。（3）顯色反應的時間可延長至3d。3．若顯色時背景過深，可采取（1）在雜交溶液中減少標記DNA量。（2）增加雜交溶液的體積，使膜隨意漂浮在溶液中。（3）某些類型的尼龍膜可能產生深色背景，因此可采用其它類型的尼龍膜或改用硝酸纖維素膜。（4）在雜交和檢測過程中增加封阻試劑的濃度。四、核酸的分子雜交核酸分子的固相雜交是將待測核酸樣品結合在某種固相支持物上，然后與溶液中的標記探針進行雜交。目前使用最多的固相支持物是硝酸纖維膜。這里重點介紹直接點樣技術，轉移技術及其它常用的雜交技術。（一）斑點雜交的直接點樣法斑點雜交或叫打點雜交（dot-blothybridization），其主要特點是事先不用限制內切酶消化或用凝膠電泳分離核酸樣品，操作簡便，靈敏度高。一個點樣品只含0.25～1pg的DNA也能檢測到。但不知道雜交片段的大?。▔A基對數）。1．DNA的打點法（DNaDotBlot）（1）膜的處理：戴上干凈手套，取出硝酸纖維膜，按需要剪成一定大小，量好各樣點間距離，用軟鉛筆標記。（2）DNA變性：將DNA溶液于1×TE（pH8.0）緩沖液中或蒸餾水中，取一定量DNA樣品加于小塑料管中，在100℃沸水中煮10min，迅速入冰水中。（3）點樣：用塑料或硅化玻璃或微量加樣器取1～5μl變性DNA，將滴管放在硝酸纖維膜上，使DNA慢慢吸在濾膜上，點樣完后涼干。（4）固定：將涼干的濾膜夾在濾紙中，于80℃干烤2～3h，然后進行雜交。2．RNA的打點法（RNaDotBlot）（1）膜的處理：同DNA的打點法。（2）RNA變性：將提取的RNA與50μl20×SSC/甲醛（30μl20×SSC加20μl甲醛）混合，65℃水浴15min。（3）點樣：同DNA的打點法。（4）固定：同DNA的打點法。（二）DNA的吸印轉移法（SouthernBlot）DNA經過限制性內切酶消化和凝膠電泳后，放入堿性溶液中使其變性，將變性后的單鏈DNA從凝膠中按原來位置和順序用濾紙吸印轉移到硝酸纖維膜上，然后再與標記探針雜交。此方法比較準確地保持了特異DNA序列在電泳圖譜中的位置，而且能測定分子量。試劑：變性液：0.5mol/LNaOH,1.5mol/LNaCl中和液：1mol/lTris-HCl,1.5mol/LNaClpH8.020×SSC:0.3mol/L檸檬酸鈉，3mol/lNaCl1．電泳取DNA約5μg加限制性內切酶進行酶切，電泳鑒定酶切完全后，取酶消化后的DNA點樣于0.8%～1.2%的凝膠上，以0.8～1V/cm電壓電泳過夜，在溴酚藍離凝膠前緣0.5cm處停止電泳。將電泳后的凝膠翻轉，紫外燈照射10～20min后拍照。2．變性與中和將電泳后的凝膠放入變性液中25℃振蕩60min。蒸餾水洗膠1min，將凝膠放入中和液中25℃振蕩60min。3．轉移取托盤一只，放入10×SSC溶液約500～1000ml，托盤上搭一塊比凝膠稍寬的長方形玻璃，取一長方形Watemanpaper（濾紙）搭在橋上，兩邊浸入10×SSC溶液中，仔細去掉玻璃與濾紙之間的氣泡（用玻棒在濾紙上滾動）。將凝膠放在濾紙上，去掉凝膠與濾紙之間的氣泡。將硝酸纖維膜放入2×SSC溶液中浸濕后放在凝膠上（如NC膜浸濕不均勻，則考慮更換NC膜，操作時手切勿觸及NC膜），去掉凝膠與NC膜之間的氣泡。將一張濾紙（長和寬均比NC膜小1mm）放在NC膜上，仔細去掉氣泡。將吸水紙切成與濾紙大小，重疊放在濾紙上，再壓一重物約500～1000g。轉膜24h，中間更換吸水紙。圖23-7Southern轉膜示意圖4．固定用2×SSC溶液洗膜5min去掉殘余凝膠，讓膜自然涼干。將凝膠放入EB液中30min，取出在UV燈下觀察是否有DNA殘余。80℃烤膜2h，然后將膜封入塑料袋進行雜交。（三）RNA的吸印轉移法（Northernblot）在RNA凝膠電泳之前，先用乙二醛等變性劑處理RNA，再在適宜條件下電泳使充分變性的RNA直接吸印到硝酸纖維膜上。固定后除去變性劑，然后進行雜交。試劑：乙二醛：4mol/L（約為30%），經過陰陽離子交換樹脂純化，使pH為5.5～6.0磷酸緩沖液：80mmol/LpH6.5～7.0磷酸緩沖液：10mmol/LpH6.5～7.0Tris-HCl:20mmol/LpH7.8二甲基亞砜：分析純20×SSC：0.3mol/L檸檬酸鈉，3mol/lNaCl1.RNA變性吸取1μl80mmol/L磷酸緩沖液，1μlRNA樣品（最多100μg），2μl，4mol/l乙二醇，4μl二甲基亞砜。混勻后，50℃水浴1h，然后放入冰中。2．電泳變性結束后，加入含有50%甘油的10mmol/L磷酸緩沖液2μl和少量溴酚藍，混勻后點樣于1.0%的凝膠上，以4～5V/cm電壓電泳。凝膠電泳液為10mmol/L磷酸緩沖液，pH6.5～7.0。3．轉移變性處理后的RNA可以轉移并結合到硝酸纖維膜上，轉移過程和轉移變性與DNA相同。4．固定用20×SSC轉移RNA。膜夾在兩層干凈濾紙中涼干后，80℃烤膜2h5．乙二醛附加物消除RNA膜固定后，放入20mmol/lTris-HCl中，100℃處理5～10min，去除乙二醛，然后進行雜交。（四）硝酸纖維膜固相雜交核酸樣品經過直接點樣或轉移到硝酸纖維膜上，固定后，可以進行雜交反應。在雜交溶液中，硝酸纖維膜上變性的核酸樣品和變性后的探針在一定的條件下形成雙鏈雜交核酸分子。然后進行酶標顯色。試劑及操作方法見本節三。五、真核細胞基因組DNA的制備從不同組織細胞或血細胞中提取DNA是進行基因診斷的先決條件。制備DNA的原則是既要將蛋白質、脂類、糖類等物質分離干凈，又要保持DNA分子的完整。蛋白酶K的應用使這兩個原則得到了保證。在提取DNA的反應體系中，SDS是離子型表面活性劑，主要作用是：（1）溶解膜蛋白而不破壞細胞膜；（2）解聚細胞中的核蛋白；（3）與蛋白質結合，使蛋白質變性而沉淀下來。蛋白酶K可將蛋白降解成小的多肽和氨基酸，使DNA分子盡量完整地分離出來。具體方法如下：（一）白細胞DNA的制備（1）采集外周靜脈血10ml，加1.7mlACD（檸檬酸0.48g、檸檬酸鈉1.32g、葡萄糖1.47g、加水至100ml,0.6kg/cm2滅菌30min）抗凝。（2）將血液放入已滅菌的50ml塑料離心管內，加30mlSTMT[0.32mol/L蔗糖、10mmol/lTris-HCl(pH7.5)、5mmol/LMgCl2、1%Triton–X100]，輕輕上下振蕩至透明，紅細胞完全溶解。（3）冰浴10min，離心，3000rpm，10min。棄上清，STMT重復處理1～3次。（4）棄上清，白色沉淀物加10mlSTE[0.1mol/LNaCl、10mmol/lTris-HCl(pH8.0)、1mmol/LEDTA(pH8.0)]，先少量，充分混勻，然后加10mg/ml蛋白酶K100μl，20%SDS30μl，搖勻，置37℃水浴15～20h。（5）用等體積飽和酚抽提，3000rpm離心5min。（6）用大口鈍緣吸管小心吸取上層水相，加飽和酚和氯仿-異戊醇（24：1）抽提，3000rpm離心5min。（7）小心吸取上層水相，用等體積氯仿-異戊醇（24：1），抽提，3000rpm離心5min。（8）小心吸取上層水相，加入1/10體積3mol/lNaAc,2.5體積預冷無水乙醇混勻，-20℃過夜。（9）將白色絮狀沉淀物用玻璃棒挑出，放入Eppendorf管內，加1ml75%乙醇4℃靜置1h，離心，10000rpm10min。（10）棄上清，用蠟膜將管口封好，針刺數個小孔，真空抽提（10～15min）。（11）加200μl1×TE溶解，置4℃保存。（12）對所提DNA用紫外分光光度計進行定量和純度檢測。（13）取2～4μlDNA樣品，經瓊脂糖凝膠（Agarose）電泳，檢查所提DNA的質量及降解情況。（二）組織DNA的制備（1）將200mg組織在冰浴條件下用消毒剪刀充分剪碎，加4ml1×RSB緩沖液（10mmol/LTris,pH7.4;10mmol/lNaCl;25mmol/LEDTA,pH7.4）放入10ml帶蓋的塑料管中。（2）加SDS至濃度為1%（可加0.4ml10%SDS），混勻。由于DNA從核中釋放出來，樣品變得粘稠。（3）加10mg/ml蛋白酶k44μl，終濃度為100μl/ml，37℃保溫1～3d，直到組織完全解體。中間可振動樣品管幾次。加0.4ml5mol/LNaCl。（4）用等體積飽和酚、1/2體積飽和酚和1/2體積氯仿-異戊醇及等體積氯仿-異戊醇（24：1）各抽提一次，3000rpm離心5min，用大口鈍緣吸管小心吸取上層水相。（5）加2.5倍體積預冷無水乙醇沉淀DNA。用一玻璃棒收集白色纖維絲狀的大片段DNA，并移入一新管，吸干DNA中的無水乙醇。（6）DNA溶于4ml0.1×SSC中，4℃過夜可作進一步純化。（7）加20μlRNaseA(10mg/ml),37℃保溫5h。加0.4ml5mol/LNaCl。（8）同上法用飽和酚、氯仿-異戊醇抽提，乙醇沉淀離心，棄上清。（9）75%乙醇洗滌2次，離心，棄上清，真空抽干。適量1×TE溶解，保存在4℃。六、轉移基因最常用的將克隆重組的DNA片段導入哺乳動物細胞的方法是用磷酸鈣介導的轉染。轉染的DNA可能是通過吞飲作用進入細胞質，然后進行細胞核。（1）配制下列溶液①2×HEPES-緩沖鹽溶液（HBS）②2mol/LCaCl2③0.1×TE(pH8.0)用0.22μm濾器過濾除菌，分裝貯存于4℃。④DNA：將DNA（約20μg/106細胞）溶于0.1×TE（pH8.0），使用濃度為40μg/ml。為使轉化效率達到最高，質粒DNA應用CsCl-溴化乙錠密度梯度平衡離心法純化。如果所用DNA量較少，應加入載體DNA將DNA濃度調至40μg/ml。實驗室制備的真核載體DNA轉染效率通常要比商品化的牛胸腺DNA、鮭魚精DNA高。載體DNA用前應通過乙醇沉淀或氯仿抽提進行滅菌。（2）轉染前24h用胰蛋白酶進行消化以獲得對數生長期的細胞，以1～2×105細胞/cm2的密度重新種入60mm組織培養皿中。在37℃、5%～7%CO2及一定濕度的培養箱中培養20～24h。（3）每轉染一個60mm培養皿中的單層細胞，須依如下方法制備磷酸鈣-DNA共沉淀物：取步驟一所制備的DNA[40μg/ml，溶于0.1×TE(pH8.0)]220μl,2×HBs250μl,放入一次性使用的滅菌5ml塑料管中，緩慢加入31μl2mol/l氯化鈣（溫和混合30s左右）。于室溫育20～30min，其間將形成細小沉淀。溫育結束時，用吸管將混合液吹打一次，使沉淀物懸浮。通常采用的另一方案是將氯化鈣和DNA的稀釋混合液加入2×HBS溶液中，逐滴加入并小心混合250μl按步驟一制備并溶于氯化鈣（250mmol/L）的DNA。按照前述方法溫育之。如果需要轉染更為大量的細胞，上述兩種反應混合液的體積均可翻一番或翻兩番。如果體積翻兩番，則須使用更大的塑料管，一般在25cm2細胞培養瓶或60mm細胞培養皿上，可將0.5ml磷酸鈣-DNA共沉淀物加入5ml培養液中，而在90mm細胞培養皿上，一般將1ml沉淀物加入10ml培養液中。已經發表的方案中，混合各組分的方式與速率大不相同。其中有一些認為除了溫和振搖之外，其它措施均無濟于事，并建議用電動移液裝置吹出的空氣來混合溶液。其它一些方案則規勸在加入DNA溶液時連續而緩慢地混勻，然后再溫和振蕩。其目的是為了避免急速形成粗沉淀物，以致降低轉化效率。實際上，除了混合的速度之外，還有其它若干因素包括DNA的濃度和大小（讓高分子量DNA從細針頭中通過，可將之剪切變?。⒕彌_液的精確pH（有些工作者配制了幾批pH范圍從6.95至7.1不等的HBS緩沖液，逐批試驗沉淀物的質量及轉染效率）。如果必須使轉染效率達到最高，就要花時間針對特定的系統優化上述幾種因素。一旦得到一批靈驗的試劑，只需依照前面方法進行配制和貯存，即可在長期內獲得可重復的結果。（4）將磷酸鈣-DNA懸液轉移至細胞單層上的培養液中[在60mm培養皿中，可將0.5ml懸液加入5ml培養液中]，輕輕左右晃動一下培養皿使培養液得以混合，此時可見培養液成黃橙色渾濁狀。另一方法是吸出培養液，直接把沉淀物加到細胞上，將細胞置于室溫溫育15min，然后再將培養液加回到培養皿中，此時細胞上有許多細小顆粒。采用以上兩種方法，都要在37℃、5%～7%CO2及一定濕度的培養箱中將轉染細胞培養長達24h[時間的長短取決于后續處理步驟的不同，見步驟（5）]。（5）然后，轉染細胞可依以下任一種方法處理：①如果不進行其它處理（如用氯喹、甘油或丁酸鈉等試劑處理，見后），可在細胞培養16～24h后，吸出培養液和沉淀物，用PBS將單層細胞再洗一次。然后按下述③d操作。②在許多情況下，同時用氯喹處理細胞，可提高DNA攝入率。氯喹可能是通過抑制溶酶體水解酶類對DNA的降解而起作