第一章

蛋白質化學1一、蛋白質的化學組成

有些蛋白質是生物體的結構物質，有些蛋白質是生物體的功能物質。

近年來的研究還指出蛋白質在遺傳信息的控制，細胞膜的通透性以及高等動物的記憶等方面起了重要作用。

總而言之，一切重要的生理活動都離不開蛋白質，蛋白質是生命現象的最基本的物質基礎。

第一節蛋白質簡介2化學組成

元素組成：所有蛋白質都含有C、H、O、N四種元素，大多數蛋白質還含有少量的S，有些蛋白質還含有一些其它元素，如P、Fe、Cu、Mo、I等。各種蛋白質的含氮量都很接近，都在16%左右，因此可通過測定生物樣品中的含氮量計算出樣品中蛋白質的含量，1克氮就相當于6.25克蛋白質。

3蛋白質水解：用H+，OH-或酶將蛋白質徹底水解，可以得到許多種氨基酸的混合物，說明氨基酸是蛋白質的基本結構單位。4酸水解：H2SO4或HCl進行水解。不引起消旋作用，得到L－氨基酸。色氨酸完全被破壞，羥基氨基酸有一小部分被分解，酰胺基被水解。堿水解：NaOH水解。多數氨基酸被不同程度的破壞，產生消旋。精氨酸脫氨，生成鳥氨酸和尿素。色氨酸在堿性條件下穩定。酶水解：不產生消旋，也不破壞氨基酸。但往往水解不徹底，部分水解。胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）、以及胃蛋白酶。5二、蛋白質的分類

（一）根據蛋白質分子的形狀和大小1．球狀蛋白質（globularprotein）2．纖維狀蛋白質（fibrousprotein）3．膜蛋白（membraneprotein）單體蛋白質：一條多肽鏈寡聚或多聚蛋白質：由兩條或多條多肽鏈構成，其中每條多肽鏈稱為亞基或亞單位，亞基之間通過非共價鍵相互締合。6（二）根據組成和溶解度1．單純蛋白質（simpleprotein）:也稱簡單蛋白質，完全由氨基酸組成的蛋白質。單純蛋白質的分類（根據溶解度的不同）(1)清蛋白（albumin）：溶于水及稀鹽、稀酸或稀堿溶液。如血清清蛋白。(2)球蛋白（globulin）：不溶于水而溶于稀鹽溶液，如血清球蛋白。(3)谷蛋白（glutelin）：不溶于水、醇及中性鹽溶液，但溶于稀酸、稀堿，如米谷蛋白。(4)谷醇溶蛋白（prolamine）：不溶于水，但溶于70%～80%乙醇，如玉米醇溶蛋白。7(5)組蛋白（histone）：溶于水及稀酸溶液，分子中含Arg、Lys較多，呈（弱）堿性，如小牛胸腺組蛋白。(6)魚精蛋白（protamine）：溶于水及稀酸溶液，分子中含堿性氨基酸特別多，呈（強）堿性，如鮭精蛋白。(7)硬蛋白（scleroprotein）：不溶于水、鹽、稀酸、稀堿溶液。如膠原蛋白、角蛋白、絲心蛋白、彈性蛋白等。82．綴合蛋白質（conjugatedprotein）：也稱結合蛋白質，由蛋白質和非蛋白質兩部分組成。

綴合蛋白質的分類（根據非蛋白質即輔基的不同）(1)糖蛋白（glycoprotein）：含糖類，如膠原蛋白。(2)脂蛋白（lipoprotein）：含脂類，如血漿脂蛋白。(3)核蛋白（nucleoprotein）：含核酸，如核糖體。(4)磷蛋白（phosphoprotein）：含磷酸，如酪蛋白。(5)金屬蛋白（metalloprotein）：含金屬，如鐵蛋白含Fe。(6)血紅素蛋白（hemoprotein）：輔基為血紅素，如血紅蛋白。(7)黃素蛋白（flavoprotein）：輔基為黃素（FAD或FMN），如琥珀酸脫氫酶（含FAD）。9名稱代表物質酶（enzyme）核糖核酸酶、胰蛋白酶、果糖磷酸激酶、乙醇脫氫酶、過氧化氫酶、蘋果酸酶調節蛋白（regulatoryprotein）胰島素、促生長素、促甲狀腺素、乳糖阻抑物、核轉錄因子1（NF1）分解代謝物激活劑蛋白（CAP）轉運蛋白（transport

protein）血紅蛋白、血清清蛋白、葡糖轉運蛋白儲存蛋白（storageprotein）卵清蛋白、酪蛋白、菜豆蛋白、鐵蛋白收縮和游動蛋白（contractileandmotileprotein）肌動蛋白、肌球蛋白、微管蛋白、動力蛋白、驅動蛋白結構蛋白（structuralprotein）α—角蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白、絲蛋白、蛋白聚糖支架蛋白（scaffoldprotein）胰島素受體底物—1（IRS—1）、A激酶錨定蛋白（AKAP）、信號傳遞轉錄激活劑（STAT）保護和防御蛋白（protectiveandexploitiveprotein）免疫球蛋白、凝血酶、血纖蛋白原、抗凍蛋白、蛇和蜂毒蛋白、白喉毒素、蓖麻毒蛋白異常蛋白（exoticprotein）應樂果甜蛋白、節肢彈性蛋白、膠質蛋白（三）根據生物學功能分類101.活性蛋白質（activeprotein）

包括生命活動過程中一切有活性的蛋白質以及它們的前體分子，絕大多數蛋白質屬于活性蛋白質，包括酶、激素蛋白、運輸蛋白（轉運蛋白）、貯存蛋白、運動蛋白、保護或防御蛋白、受體蛋白、控制生長和分化蛋白、毒蛋白、膜蛋白等。2.非活性蛋白質（passiveprotein）

對生物體起支持和保護作用，主要指硬蛋白包括膠原蛋白、角蛋白、絲蛋白、彈性蛋白等。11三、蛋白質功能的多樣性①酶的作用②運載作用③儲存營養素④收縮或運動作用。⑤結構材料。⑥防御功能。⑦調節功能。⑧緩沖作用。12四、蛋白質構象和蛋白質結構的組織層次構型：是指具有相同結構式的立體異構體中取代基團在空間的相對取向，不同的構型如果沒有共價鍵的破裂是不能互變的。構象：是指具有相同結構式和相同構型的分子在空間里可能的多種形態，構象形態間的改變不涉及共價鍵的破裂。13為了對蛋白質結構敘述的方便，人為地將蛋白質的結構分為一級結構、二級結構、三級結構和四級結構。蛋白質的一級結構又稱初級結構，二級結構、三級結構、四級結構的三度空間排列稱蛋白質的空間結構、高級結構、三維結構或構象。14隨著蛋白質化學研究的進展，越來越多的人認為在二級結構和三級結構之間應加入超二級結構和結構域這兩個層次，所以蛋白質的結構層次為：一級結構二級結構超二級結構結構域三級結構四級結構15組織層次：一級結構：多肽鏈的氨基酸序列。二級結構：指多肽鏈借助氫鍵排列成自己特有的α－螺旋和β－折疊股片段。三級結構：是指多肽鏈借助各種非共價鍵（或非共價力）彎曲、折疊成具有特定走向的緊密球狀構象。四級結構：是指寡聚蛋白質中各亞基之間在空間上的相互關系和結合方式。16第二節蛋白質的基本結構單位——氨基酸（aminoacid,aa或AA）

一、氨基酸的通式、分類、結構和代號1、氨基酸的通式或172、氨基酸的分類、結構、代號氨基酸有兩種分類方法(1)按側鏈R基的結構18(2)按側鏈R基的極性19中性氨基酸氨基酸的結構、代號:20二、氨基酸的構型、旋光性和光吸收

構型：組成蛋白質的氨基酸除Gly以外都有手性碳原子，在三維空間上就有兩種不同的排列方式，它們互為鏡影，這兩種不同的構型分別稱為D-型和L-型。21以丙氨酸為例：22如含兩個手性碳原子，則有４種立體異構體，分別稱為Ｄ-,Ｌ-，Ｄ別-和Ｌ別-氨基酸。L-蘇氨酸(L-threonine)D-蘇氨酸(D-threonine)L-別-蘇氨酸(L-allo-threonine)D-別-蘇氨酸(D-allo-threonine)蛋白質中的氨基酸都是L-型。

(Gly除外)23旋光性：組成蛋白質的氨基酸除Gly以外，都有手性碳原子，

所以都有旋光性，能使偏振光的偏振面的向左或向右旋轉，向左旋轉的稱左旋，用“一”號表示，向右旋轉的稱右旋，用“＋”號表示。消旋外消旋內消旋24光吸收：組成蛋白質的氨基酸中，Trp、Tyr和Phe對紫外光有一定的吸收，這是因為它們分子中含有苯環，是苯環的共軛雙鍵造成的，這三個氨基酸的光吸收都在280nm附近。Trp:λMAX在280nm處Tyr：λMAX在275nm處Phe：λMAX在257nm處25三、氨基酸的酸堿性質和等電點

1、氨基酸的兩性離子形式兩性離子(dipolarion)262、氨基酸的兩性解離和等電點Br?nsted的酸堿理論，即廣義酸堿理論。HAA-+H+酸堿質子27氨基酸在水中的兩性離子既能像酸一樣放出質子，也能像堿一樣接受質子，氨基酸具有酸堿性質，是一類兩性電解質。Asanacid（protondonor）：Asabase（protonacceptor）：28不同pH時氨基酸以不同的離子化形式存在：

正離子兩性離子負離子氨基酸所帶靜電荷為“零”時，溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點（isoelectricpoint），以pI表示。29實驗證明在等電點時，氨基酸主要以兩性離子形式存在，但也有少量的而且數量相等的正、負離子形式，還有極少量的中性分子。當溶液的pH=pI時，氨基酸主要從兩性離子形式存在。

pH<pI時，氨基酸主要以正離子形式存在。

pH>pI時，氨基酸主要以負離子形式存在。

303．氨基酸的酸堿滴定曲線Henderson-Hasselbalch方程pH=pKa+lg[質子受體][質子供體]酸堿滴定曲線314．等電點的計算中性氨基酸：以Gly為例K1=[Gly±][H+][Gly+]K2=[Gly-][H+][Gly±]pI時，[Gly+]=[Gly-][Gly±][H+]K1=[Gly±]K2[H+][H+]2=K1K2pH=（pK1+pK2）/2pI=（pK1+pK2）/2pI=（2.34+9.60）/2=5.97Gly32酸性氨基酸，以Asp為例：33堿性氨基酸，以Lys為例：34氨基酸的甲醛滴定35四、氨基酸的化學性質

361．α-氨基參加的反應

（1）成鹽作用37（2）與HNO2的反應38（3）酰基化反應酰氯：芐氧酰氯（Cbz-Cl）:對甲苯磺酰氯(Tos-Cl):叔丁氧酰氯(Boc-Cl):酸酐：鄰苯二甲酸酐：（R’＝酰基）39Cbz-ClCbz-氨基酸40氨基酸與5一二甲氨基萘-1-磺酰氯（dansylchloride,DNS）的反應41（4）烴基化反應①與2、4一二硝基氟苯的反應2，4一二硝基氟苯（R’＝烴基）42DNFBDNP-氨基酸（黃色）43②與苯異硫氰酸（酯）的反應PITCPTC-氨基酸PTH-氨基酸442．α-羧基參加的反應

（1）成鹽和成酯反應45酰化氨基酸對硝基苯酚酰化氨基酸對-硝基苯酯（活化酯）（式中Y＝酰基）46（2）成酰氯反應47（3）成酰胺反應體外：體內：Asp+NH4ATP酶Asn+48（4）脫羧基反應49（5）疊氮反應503.α-氨基和α-羧基共同參加的反應

（1）茚三酮反應注意幾點：51（2）成肽鍵524．側鏈R基參加的反應

（1）-S-S-和-SH的氧化還原反應R-SH：HS-CH2CH2OH巰基乙醇（mercaptoethanol）HS-CH2COOH巰基乙酸（mercaptoaceticacid）HS-CH2(CHOH)2-CH2SH二硫蘇糖醇（dithiothreitol,DTT）53半胱氨酸的-SH很活潑，很容易在空氣中重新氧化形成二硫鍵，一般可用鹵代化物對-SH進行保護。

54（2）苯環的黃色反應phe+少量濃H2SO4+濃HNO3黃色TyrorTrp+濃HNO3黃色55（3）酚基的Millon反應（米倫氏反應）HgNO3

Tyr+ Hg(NO3)2 紅色HNO3

56（4）pauly反應His+重氮苯磺酸紅色（棕紅色）Tyr+重氮苯磺酸橘黃色57（5）Folin一酚反應+磷鉬酸Tyr磷鎢酸orTrp藍色（鉬藍與鎢藍混合物）58氨基酸化學性質總結（重點）1.亞硝酸反應2.酰化反應：（芐氧酰氯、丹磺酰氯－二甲基氨基萘磺酰氯反應（DNS—Cl））3.烴基化反應

2，4—二硝基氟苯反應（FDNB）、苯異硫氰酸酯4.甲醛反應5.α-羧基的成鹽成酯反應6.茚三酮反應7.二硫鍵的氧化還原反應59五、氨基酸分析

1．分配層析法：分配系數Kd=CACBCA：一種物質在A相（流動相）中的濃度CB：一種物質在B相（固定相）中的濃度原理：主要根據被分析的樣品（如aa混合物）在兩種互不相溶的溶劑中分配系數的不同而達到分離的目的，60（1）逆流分溶（逆流分配）61（2）紙層析

單向紙層析圖Rf值

62雙向紙層析圖63（3）薄層層析642．離子交換層析法

原理：分離氨基酸時，用離子交換樹脂作為支持物，利用離子交換樹脂上的活性基團與溶液中的離子進行交換反應，由于各種離子交換能力不同，與樹脂結合的牢固程度就不同，在洗脫過程中，各種離子以不同的速度移動，從而達到分離的目的。這種分離主要與各種離子所帶電荷有關，在電荷相同時，與極性，非極性有關。65離子交換樹脂：化學本質：是一種人工合成的聚苯乙烯一苯二乙烯組成的具有網狀結構的高分子聚合物。外觀：66陽離子交換樹脂：活性基團是酸性的，如磺酸基-SO3H（強酸型），羧基-COOH（弱酸型）陰離子交換樹脂：活性基團是堿性的，如季胺基-N+(CH3)3OH-

67X＋X＋X＋X＋X＋X＋Y＋X＋Z＋X＋Y＋Z＋Z＋Y＋Y＋Y＋X＋Z＋X＋Z＋X＋Z＋Z＋X＋X＋X＋Y＋Z＋Y＋Z＋Ｘ＋Ｘ＋X＋X＋X＋X＋Ｚ＋X＋Ｚ＋X＋X＋OH－nX＋平衡上樣吸附洗雜洗脫6869第三節肽（peptide）

一、肽的結構和命名

肽是由兩個或兩個以上的氨基酸通過肽鍵連接而形成的化合物。Peptidebond70氨基酸之間通過肽鍵連接形成的鏈稱肽鏈。N端氨基酸殘基氨基酸殘基C端肽鏈書寫方式：N端→C端

肽鏈有鏈狀、環狀和分支狀。71命名：根據氨基酸組成，由N端→C端命名丙氨酰甘氨酰亮氨酸Ala－Gly－Leu(orAla?Gly?Leu)7273747576共振結果：限制繞肽鍵的自由旋轉酰胺平面（肽平面）C-N具有40％的雙鍵性質，繞鍵能障高肽鍵具有永久偶極性質反式構型77二、肽的理化性質

1．兩性解離與等電點

肽與氨基酸一樣具有酸、堿性質，它的解離主要取決于肽鏈的末端氨基、末端羧基和側鏈R基。

由于肽中N端自由氨基和C端自由羧基之間的距離比氨基酸中的大，因此它們之間的靜電引力較弱。肽中C端-COOH的pK略大于氨基酸中的pK值，pK1↑。N端-NH+3的pK略小于氨基酸中的pK值，pK2↓。R基的pK變化不大。78肽的等電點：肽所帶凈電荷為“零”時，溶液的pH值。

例：已知末端α-COOH，pK3.6，末端α-NH3+pK8.0ε-NH+3pK10.6。計算Ala-Ala-Lys-Ala的等電點。pI=(8.0＋10.6)/2=9.3792．肽的化學性質肽的化學性質與氨基酸相似，如兩性解離、等電點等，但肽有與氨基酸不同的特殊反應（1）雙縮脲反應（2）肽鍵的紫外吸收 210～230nm雙縮脲＋堿性CuSO4溶液紫色兩個或兩個以上的肽鍵化合物能發生雙縮脲反應生成紫色復合物80第四節蛋白質一級結構及一級結構分析當多肽的分子量大到足夠具有一定的空間結構時就稱為蛋白質。蛋白質與多肽的主要差別：分子量，空間結構

81（一）蛋白質的一級結構（primarystructure）

1．定義：蛋白質的一級結構是指蛋白質多肽鏈中氨基酸的排列順序（sequence），一級結構的主要連接鍵是肽鍵。822．蛋白質一級結構的測定

概況:序列測定前的準備工作：樣品的純度相對分子質量肽鏈的數目氨基酸組成一級結構的測定主要用小片段重疊的原理83蛋白質測序的策略：測定蛋白質分子中多肽鏈的數目拆分蛋白質分子的多肽鏈斷開多肽鏈內的二硫橋分析每一條多肽鏈的氨基酸組成鑒定多肽鏈的N—末端和C—末端殘基裂解多肽鏈成較小的片段測定各肽段的氨基酸序列重建完整多肽鏈的一級結構確定半胱氨酸殘基間形成的S—S交聯橋的位置84序列測定方法（1）末端分析：包括N端分析，C端分析N端分析方法①二硝基氟苯法（DNP法、DNFB法或FDNB法）85②丹磺酰氯法（DNS法）86③苯異硫氰酸(酯)法（PITC法、PTC法、PTH法、Edman降解法）87④氨肽酶（aminopeptidase,Apase）法AlaValGly88亮氨酸氨肽酶（Leucineaminopeptidase,LAP）專一性:A=非極性氨基酸時快A=其它氨基酸時慢ABN端A=Leu時最快89N端氨基封閉的幾種情況：乙酰化、焦谷氨酰環化、環狀肽等。90C端分析①硼氫化鋰還原法91②肼解法：也稱聯氨法苯甲醛的作用92③羧肽酶（carboxypeptidase,Cpase）法934種羧肽酶的來源和專一性羧肽酶來源專一性CpA胰臟能釋放除pro、Arg和Lys以外的所有C端氨基酸CpB胰臟主要水解C端為Arg或Lys的肽鍵CpC植物或微生物相當廣泛，幾乎能釋放C端的所有氨基酸CpY面包酵母可釋放C端所有氨基酸94（2）肽鏈的拆開和分離共價鍵非共價鍵9596（3）氨基酸組成的分析完全水解：酸水解堿水解97（4）肽鏈的部分水解化學方法：溴化氰（CNBr）裂解法:98羥胺裂解法：專一性地水解Asn－Gly之間的肽鍵，但專一性不強，Asn－Leu，Asn－Ala也能部分裂解。99酶解方法100（5）肽段的分離和氨基酸序列測定分離：層析，凝膠電泳，HPLC,凝膠過濾等序列測定：Edman化學講解法（PITC),DNS-Edman測序法酶降解法（氨肽