第14章細胞增殖調控與癌細胞？？G1→S及G2→M是細胞周期調控的關鍵時期對G2→M調控過程的探索中央控制器一、MPF的發現及其作用

成熟促進因子(maturationpromotingfactor，MPF）,又稱有絲分裂因子(Mitosis-promotingfactor),是指M期細胞中存在的促進細胞分裂的因子一、MPF的發現及其作用1970年，JohnsonandRao將同步化的不同細胞周期的Hela細胞誘導融合PCC（prematurechromosomecondensation）：即早熟染色體凝縮，主要是指與M期細胞融合的間期細胞（G1、S和G2）發生的形態各異的染色體凝縮。

M期細胞可以誘導PCC，暗示在M期細胞中可能存在一種誘導染色體凝縮的因子，稱為細胞有絲分裂促進因子（MPF）。非洲爪蟾卵細胞成熟過程、受精和第一次卵裂示意圖生發泡（GV）一、MPF的發現及其作用在成熟的卵細胞的細胞質中，必然有一種物質，可以誘導卵母細胞成熟。他們將這種物質稱作成熟促進因子，即MPF。1988年Lohka等用非洲爪蟾分離獲得MPF，并證明其主要有P32和P45蛋白。P32和P45結合后，可以使多種蛋白底物磷酸化，MPF是一種蛋白激酶。

一、MPF的發現及其作用二、p34cdc2

激酶的發現及其與MPF的關系允許溫度條件下20～23℃

(permissvetemperature)，芽殖酵母正常分裂繁殖，而在限定溫度條件下(restrictivetemperature)35～37℃，則不能正常分裂繁殖。由于某個基因發生突變而引起的，產生了突變體。

L.Hartwell分離獲得了數十個溫度敏感突變體（temperature-sensitivemutants）。不同的突變體，發生突變的基因不同，細胞在細胞周期中所停留的時期以及細胞所表現出的形態結構也常常不同。酵母中這些與細胞分裂和細胞周期調控有關的基因，被稱之為cdc（celldivisioncycle）基因。如cdc2、cdc25、cdc28等。二、p34cdc2

激酶的發現及其與MPF的關系cdc2基因是裂殖酵母中的關鍵基因。cdc2基因突變導致細胞停留在G2/M交界。cdc2基因表達的產物為一種相對分子量為34kDa的蛋白，被稱為p34cdc2。p34cdc2具有蛋白激酶活性，可以使多種蛋白底物磷酸化因而被稱為p34cdc2激酶。cdc28是芽殖酵母中的關鍵基因。cdc28基因突變，芽殖酵母細胞或者停留在G1/S交界處，或者停留在G2/M交界處。它的基因表達的產物也是一種相對分子量為34kDa的蛋白，被稱為p34cdc28。p34cdc28也是一種蛋白激酶。p34cdc2還是p34cdc28本身不具有酶的活性，必須與另一種蛋白p56cdc13結合才具有激酶的活性。TimHuntfoundcyclinin

1983:seaurchineggsWhenthegelwasdevelopedonFriday23July1982,Ifoundthatthestrongestbandearlyonsuddenlygotverymuchweakerataboutthetimewhentheeggswereabouttodivideintwo.Thiswasastunning,startlingdiscovery.“

Cyclin:inseaurchineggsthatisdestroyedateachcleavagedivision.

Cell,1983,33:389-396P34cdc2與MPF都具有激酶活性并能夠促進G2/M轉換。那么P34cdc2與MPF有何關系？JamesMaller實驗室和PaulNurse實驗室開始合作證明MPF中的p32可以被芽殖酵母中的p34cdc2

特異抗體所識別，并且p34cdc2多肽片段可以增強MPF活性，表明二者為同源物。

MPF的p45和p56cdc13是否也有一定關系呢？二、p34cdc2

激酶的發現及其與MPF的關系三、周期蛋白周期蛋白均含有一段相當保守的氨基酸序列，稱為周期蛋白框(cyclinbox)，約100個氨基酸殘基，其功能介導周期蛋白與CDK結合。不同的周期蛋白框識別不同的CDK，組成不同的cyclin-CDK復合體，表現出不同的CDK活性。M期周期蛋白的近N端含有一段由9個氨基酸殘基組成的特殊序列RXXLGXIXN），稱為破壞框（destructionbox），主要參與泛素依賴性的cyclinA和cyclin

B

的降解。已知30余種，在脊椎動物中為A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。分為4類：G1型、G1/S型、S型、M型。

MPF的發現HeLa細胞融合：有絲分裂促進因子非洲爪蟾卵細胞提取物注射：MPF概念提出酵母溫度敏感突變株：cdc基因，p34cdc2，Cdc28海膽卵細胞：Cyclin的發現MPF生化成分：Cdc2和Cyclinthe2001NobelPrizeforPhysiologyorMedicine對MPF結構和功能的進一步了解1、MPF的活性在細胞周期中波動很大,在M期前急劇升高,但M期后急劇下降直到零；2、MPF由兩個亞基構成，其一稱為周期蛋白（Cyclin），其二為蛋白質激酶（CDK），MPF的活性即由該蛋白質激酶體現；3、周期蛋白在細胞周期中表現為周期性變化，蛋白質激酶只有與周期蛋白結合后該激酶才具有活性。三、周期蛋白MPF:G2→M①細胞周期的調控依賴于一類蛋白質激酶的活化,通過磷酸化下游蛋白而推進細胞周期進程；②激酶的活性受另一亞基的控制，它的濃度在細胞周期中呈現周期性變化，因而酶的活性也呈周期性。細胞周期的調控中央控制器細胞周期蛋白（Cyclin）及細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）構成了細胞周期調控系統的核心（中央控制器）細胞周期調控系統的核心細胞周期的調控Cyclin種類多樣，各自在其特定的細胞周期進程中周期性變化，與特定CDK結合，調控細胞周期的進程；CDK與Cyclin結合后被激活，可將某些功能蛋白磷酸化，進而實施調控。CDK的活性依賴于Cyclin，其活性與Cyclin的含量同步變化

——細胞周期調控系統的核心成員Cdk1VariableCyclinandCDKsInCellcyclephasesCdk4，6Cdk2Cdk1細胞周期的調控細胞周期的調控Cyclin種類多樣，各自在其特定的細胞周期進程中周期性變化，與特定CDK結合，調控細胞周期的進程；CDK與Cyclin結合后被激活，可將某些功能蛋白磷酸化，進而實施調控。CDK的活性依賴于Cyclin，其活性與Cyclin的含量同步變化細胞周期檢測點監控細胞周期的運行細胞在長期進化中發展出了一套保證細胞周期正常有序進行的監控檢查機制,通常被稱為細胞周期檢測點(checkpoint)又稱為限制點(restrictionpoint)

；檢測點發揮負反饋調節作用。當細胞周期進程中出現異常事件,如DNA損傷或復制異常,檢測點的相關組分就被激活,及時地中斷細胞周期的運行,待細胞修復或排除了故障后,細胞周期才能恢復運轉。細胞周期調控的中央控制器需接收、整合各檢測點反饋的信息，對細胞周期進程作出調節細胞周期檢測點監控細胞周期的運行細胞周期檢測點：G1-S期檢測點、S期檢測點、G2-M期檢測點、M期檢測點檢測點的功能：發現或傳感(detect或sensor)；制動或扣留(stop或arrest)；修復(repair)；繼續分裂或誘導死亡。檢測點功能缺陷會導致基因突變和染色體結構異常細胞增殖,導致腫瘤發生。細胞周期的檢測點G1-ScheckpointScheckpointG2-McheckpointMcheckpointG1-S期檢測點（START）是最重要的檢測點，將整合多方信息,決定細胞是否進行分裂、發生凋亡或是進入G0期。START調節失靈，將導致細胞越過正常的程序限制進入S期，并允許細胞復制未修復的突變DNA，從而積累形成腫瘤表型的基因改變對START檢測點的研究是搞清癌細胞為何持續進入循環的關鍵所在細胞周期檢測點的特點及作用機制細胞周期檢測點監控細胞周期的運行細胞周期的檢測點的功能模式細胞周期檢測點：G1-S期檢測點、S期檢測點、G2-M期檢測點、M期檢測點檢測點的功能：發現或傳感(detect或sensor)；制動或扣留(stop或arrest)；修復(repair)；繼續分裂或誘導死亡。檢測點功能缺陷會導致基因突變和染色體結構異常細胞增殖,導致腫瘤發生。G1/S檢驗點：檢測DNA是否受損，細胞營養狀況等，啟動DNA的復制S期檢驗點：檢驗DNA復制是否完畢

G2/M檢驗點：復制是否完成，DNA是否受損，能否開始分裂中-后期檢驗點：紡錘體組裝的檢驗細胞周期中的主要的檢驗點四、CDK和CDK抑制因子CKI五、細胞周期運轉調控（一）G2/M期轉化與CDK1的關鍵性調控作用CDK1激酶，在細胞周期中的含量相對穩定，而cyclinB的含量則呈現周期性變化；p34cdc2蛋白只有與cyclinB結合后才有可能表現出激酶活性。因而，CDK1活性首先依賴于cyclinB含量的積累。cyclinB一般在G1期的晚期開始合成，通過S期，其含量不斷增加，到達G2期，其含量達到最大值。（一）G2/M期轉化與CDK1的關鍵性調控作用誘導紡錘體裝配啟動染色體凝集促使核被膜崩解促使細胞骨架重排促使高爾基體、內質網等細胞器重新組織五、細胞周期運轉調控（二）M期周期蛋白與細胞分裂中期向后期轉換細胞周期運轉到分裂中期后，M期cyclinA和B將迅速降解，CDK1活性喪失，上述被CDK1磷酸化的靶蛋白去磷酸化，細胞周期便從M期中期向后期轉化。五、細胞周期運轉調控APC(AnaphasePromotingComplex)介導選擇性降解的靶蛋白與Ubiquitin結合(通過泛素依賴性途徑降解)

APC主要介導兩類蛋白降解:AnaphaseInhibitors和MitoticCyclin.前者維持姐妹染色單體粘連,抑制后期啟動；后者的降解意味著有絲分裂即將結束，即染色體開始去凝集，核膜重建。Cdc20和Mad2蛋白位于動粒上，在染色體結合有絲分裂紡錘體前將不能從動粒上釋放，由于Mad2與Cdc20結合而抑制APC的活性。所以只有所有染色體都與紡錘體結合后，APC才有活性，才啟動細胞向后期轉換。五、細胞周期運轉調控（三）G1/S期轉化與G1期周期蛋白依賴性CDK細胞由G1期向S期轉化主要受G1期周期蛋白依賴性CDK所控制。哺乳動物細胞中，G1期周期蛋白主要包括cyclin

D、E。與G1期周期蛋白結合的CDK主要包括CDK2、CDK4和CDK6

等。cyclinD–CDK的作用底物是Rb蛋白（retinoblastomaprotein，成視網膜細胞瘤蛋白）。Rb蛋白是G1/S期轉化的負調控因子。cyclinE–CDK2活性為S期啟動所必需。cyclinA–CDK2與DNA的復制有關。五、細胞周期運轉調控五、細胞周期運轉調控SCF泛素化依賴蛋白質降解途徑在整個細胞周期中DNA復制一次，且只能一次。執照因子假說——對細胞核染色質DNA復制發行“執照”（licensing）。在M期，細胞核膜破裂，胞質中的執照因子與染色質接觸并與之結合，使后者獲得DNA復制所必需的“執照”。細胞通過G1期后進入S期，DNA開始復制。隨DNA復制過程的進行，“執照”信號不斷減弱直到消失。到達G2期，細胞核不再含有“執照”信號，DNA復制結束并不再起始。只有等到下一個M期，染色質再次與胞質中的執照因子接觸，重新獲得“執照”，細胞核才能開始新一輪的DNA復制。DNA復制執照因子的主要成分Mcm蛋白（minichromosomemantenanceprotein）是其主要成分。五、細胞周期運轉調控（四）S/G2/M期轉換與DNA復制檢驗點DNA復制還未完成或者DNA復制出現問題，細胞周期便不能向下一個階段轉換。DNA復制檢驗點主要包括兩種：S期內部檢驗點（intra-Sphasecheckpoint）以及DNA復制檢驗點（replicationcheckpoint）六、其他因素在細胞周期調控中的作用內在因素：癌基因和抑癌基因；外在因素：離子輻射、化學物質作用、病毒感染、溫度變化、pH變化等。第二節癌細胞

癌癥是一種嚴重威脅人類生命安全的疾病。動物體內細胞分裂調節失控而無限增殖的細胞稱為腫瘤細胞(tumorcell)。－良性腫瘤：生長緩慢，與周圍組織邊界明顯。－惡性腫瘤：癌癥(cancer)，生長快、具有遷移性。單一細胞癌變就會形成癌癥。一．癌細胞的基本特征◆癌細胞有三個顯著的基本特征即：不死性，遷移性和失去接觸抑制。不死性，遷移性，失去接觸抑制，生長信號的自給自足，對程序性細胞死亡的逃逸，增長血管的能力。最新研究表明，腫瘤還具備第七種特征：腫瘤相關性炎癥。如何判別？癌細胞還有許多不同于正常細胞的形態特征和生理、生化特征。1、癌細胞的形態特征癌細胞大小形態不一，通常比它的源細胞體積要大，核質比顯著高于正常細胞。

出現巨核、雙核或多核現象。核內染色體呈非整倍態（aneuploidy），某些染色體缺失，而有些染色體數目增加。線粒體表現為不同的多型性、腫脹、增生。

細胞骨架紊亂，某些成分減少，骨架組裝不正常。細胞表面特征改變，產生腫瘤相關抗原（tumorassociatedantigen）染色體非整倍性2、癌細胞的生理、生化特征1）細胞周期失控，生長和分裂失控；－具有無限增殖能力，成為“永生”細胞。2）具有浸潤性和擴散性（遷移性）；癌細胞的細胞間粘著性下降，具有侵潤性和擴散性，這是癌細胞區別于良性腫瘤細胞的主要特征在分化程度上癌細胞低于良性腫瘤細胞(一定程度的去分化)，且失去了許多原組織細胞的結構和功能。擴散性癌細胞的遷移3）細胞間相互作用改變；識別改變；表達水解酶類；產生新的表面抗原。4）表達譜改變或蛋白活性改變；往往有胚胎細胞蛋白表達，胎兒甲種球蛋白（甲胎蛋白）是胎兒所特有的。但在肝癌細胞中表達，因此可做肝癌早期檢定的標志特征。端粒酶活性升高；纖連蛋白減少；蛋白質合成及分解代謝都增強，5）體外培養的惡性轉化細胞特征體外培養的惡性轉化細胞的特征惡性轉化細胞同癌細胞一樣具有無限增殖的潛能；在體外培養時貼壁性下降；失去接觸抑制；培養時對血清依賴性降低；當將惡性轉化細胞注入易感動物體內，往往會形成腫瘤。二、癌基因與抑癌基因——腫瘤形成的內因涉及到兩大類與細胞增殖相關的基因的突變：●促進細胞增殖相關基因突變：原癌基因(proto-oncogene)突變形成癌基因(oncogene)●抑制細胞增殖相關基因突變：腫瘤抑制基因(tumor-suppressorgene)，抑癌基因細胞癌變是基因突變累積和自然選擇的結果，所以患者多為年長者。原癌基因與腫瘤抑制基因產物協調作用，避免細胞癌變1、癌基因(oncogenes)癌基因oncogenes,onc：可引起細胞癌變的基因，是調控細胞增殖、分裂和生長的正常基因（原癌基因）的突變形式。原癌基因proto-oncogenes：細胞中調控細胞增殖、分裂和生長的一類正常基因（促進因子），當其突變會促進癌癥的發生（即變成癌基因）。癌基因按其來源可分為兩類：－細胞癌基因(原癌基因突變而來):c-onc;－病毒癌基因(致腫瘤病毒中攜帶):v-onc

。原癌基因的產物主要包括：①生長因子，如sis；②生長因子受體，如fms（受體酪氨酸激酶，CSF-1受體）、erbB（受體酪氨酸激酶，EGF受體）；③信號轉導組分，如src、ras、raf；④細胞周期蛋白，如cyclinD；⑤細胞凋亡調控因子，如bcl-2；⑥轉錄因子，如myc、fos、jun。原癌基因編碼蛋白原癌基因激活往往是顯性突變－－兩個等位基因中的一個激活即會致腫瘤。Rasoncogene:RetainbindGTPBcl-2oncogene:Preventapoptosis2、抑癌基因(Tumor-suppressorgenes)◆抑癌基因是正常細胞增殖過程中的負調控因子，其產物抑制細胞增殖；促進細胞分化；和抑制細胞遷移。

通常發生于功能喪失性突變(隱性突變)抑癌基因失活往往是隱性突變－－兩個等位基因都失活時才會致腫瘤抑癌基因的種類①轉錄調節因子（控制細胞周期或誘導細胞凋亡）：如Rb、p53。Rb基因突變導致視網膜母細胞瘤形成；P53基因突變將導致細胞癌變或凋亡。②負調控轉錄因子：如WT；③周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CDKI），如p21；④rasGTP酶活化蛋白(GAP)：如NF-1；⑤DNA修復因子：如BRCA1、BRCA2；⑥磷酸脂酶：如PTEN；⑦細胞粘附分子：如DCC。Rb基因突變導致視網膜母細胞瘤形成Rb作用機理：－其產物成視網膜瘤蛋白（pRb）是轉錄因子E2F的抑制因子；－G1期CDK激活后將pRb磷酸化，從而解除它對E2F的抑制；－相