第三節基因工程制藥生產的基本過程一、工具酶的分離純化二、載體的分離純化三、外源DNA和目的基因的分離和獲得四、外源DNA與載體DNA的切割與連接五、宿主細胞的選擇和基因導入操作六、基因工程菌的穩定性及生長代謝的特點七、基因工程菌中試八、基因工程菌的擴增和發酵生產九、基因工程藥物的分離和純化技術十、變性蛋白的復性十一、基因工程藥物的質量控制十二、基因工程藥物的制造實例第三節基因工程制藥生產的基本過程一、工具酶的分離純化六、基因工程菌的穩定性及生長代謝的特點

（一）基因工程菌質粒的不穩定性（二）質粒穩定性的分析方法（三）質粒不穩定的原因（四）提高質粒穩定性的方法（五）基因工程菌的生長速率（六）蛋白質產量/菌體數量比（七）能量供應與菌體生長的關系（八）小分子前體、催化劑供應與菌體生長的關系六、基因工程菌的穩定性及生長代謝的特點

（一）基因工程菌質粒（一）基因工程菌質粒的不穩定性基因工程菌在傳代過程中常出現質粒不穩定的現象，有分裂不穩定和結構不穩定。由于質粒不穩定導致的質粒丟失菌與含有質粒的菌之間生產速率不一致導致可能的生長優勢，進而能在培養基中逐漸取代含質粒菌成為優勢菌群，從而減少基因表達的產率，導致基因工程菌在生產過程中出現不穩定現象。

（一）基因工程菌質粒的不穩定性基因工程菌在傳代過程中常出現質（二）質粒穩定性的分析方法（1）將工程菌培養液樣品適當稀釋，均勻涂于不含抗生素標記的平板培養基，培養10-12h，統計所長出的菌落數A；（2）然后隨機挑選100個菌落，接種到含有抗生素標記的平板培養基，培養10-12h，統計所長出的菌落數B；（3）計算B/A的比值。該比值能反映質粒的穩定性,稱為穩定性(stability,ST)

（二）質粒穩定性的分析方法（1）將工程菌培養液樣品適當稀釋，（三）質粒不穩定的原因1、分裂不穩定:指基因工程菌在分裂的子代菌體中，出現一定比例不含質粒的現象。它主要與2個因素有關：

（1）工程菌產生丟失質粒的概率，拷貝量低的工程細菌，它所產生不含質粒的細菌變異株和概率較大。

（2）丟失質粒的細菌、含有質粒的工程菌之間的競爭力大小。2、結構不穩定:指外源基因從質粒上丟失、或者發生堿基重排、缺失現象，最終導致工程菌性能改變的現象。（三）質粒不穩定的原因1、分裂不穩定:指基因工程菌在分裂的子（四）提高質粒穩定性的方法1、選擇合適的宿主菌2、選擇合適的載體3、選擇性壓力4、分階段培養5、控制培養條件6、固定化（四）提高質粒穩定性的方法1、選擇合適的宿主菌1、選擇合適的宿主菌

宿主菌的遺傳特性對質粒的穩定性影響很大。1、選擇合適的宿主菌宿主菌的遺傳特性對質粒的穩定性影響很2、選擇合適的載體

含低拷貝質粒的菌產生不含質粒的子代菌頻率大于含高拷貝質粒的菌。2、選擇合適的載體

含低拷貝質粒的菌產生不含質粒的子代3、選擇性壓力

因為丟失質粒的細菌在含的抗生素的培養基中不能正常生長。所以可通過加入抗生素來抑制質粒丟失的細菌的生長。3、選擇性壓力

因為丟失質粒的細菌在含的抗生素的培養4、分階段培養

工程菌的培養一般分為2個階段：

（1）第一階段:先使菌體生長至一定密度。

（2）第二階段:開始誘導外源基因的表達。由于第一階段外源基因沒有表達，減少了丟失質粒的細菌的產生概率，也就增加了工程菌的穩定性。4、分階段培養

工程菌的培養一般分為2個階段：

（1）第5、控制培養條件

通過溫度、pH值、培養基組分、溶解氧的綜合調節措施通過以下方法可以提高質粒的穩定性。（1）間歇送氧（2）改變稀釋速率5、控制培養條件

通過溫度、pH值、培養基組分、溶解氧的6、固定化

固定化可提高基因重組大腸桿菌的穩定性。6、固定化

固定化可提高基因重組大腸桿菌的穩定性。（五）基因工程菌的生長速率

細菌菌體生長是核酸和蛋白質的綜合表現，通常用比生長速率表征。

比生長速率:μ表征微生物生長速率的參數。

菌體生長對于提高質粒的穩定性、減少代謝副產物的積累、提高外源蛋白質的產量都有重要的意義。基因工程菌的生長速率可通過選用不同的碳源、控制補料量、稀釋速率的方法來加以控制。（五）基因工程菌的生長速率細菌菌體生長是核酸和蛋白質的（六）蛋白質產量/菌體數量比

在基因工程菌的發酵生產過程中，蛋白質產量/菌體數量比基本上是一個恒定值。細菌生長速度快，其蛋白質合成的速度也相應加快。

（六）蛋白質產量/菌體數量比在基因工程菌的發酵生產過程中（七）能量供應與菌體生長的關系1、Andersen理論（1）Andersen等人通過實驗發現，培養基中所能提供的最大能量決定著工程細菌的最大生長速率。（2）當培養基提供的能量不足時，細菌往往會產生代謝副產物乙酸，而乙酸則會明顯抑制細菌的生長。其實質是由于三羧酸循環的供能不足，導致部分乙酰輔酶A轉化成乙酸來供能。2、改進方法（1）適當提高pH值，可以減少乙酸的抑制作用。（2）分批選用不同的碳源、控制補料速度、能在一定范圍之內，控制細菌的過度生長，從而抑制乙酸的產生。（七）能量供應與菌體生長的關系1、Andersen理論（八）前體供應與菌體生長的關系1、工程菌的生長速率往往低于未經克隆的原始宿主細胞2、外源基因的大量表達常常引起工程菌的生長停滯。這種停滯與能量供應無關。3、在基礎培養基中加入氨基酸，能使細菌的生長速率提高。4、當合成材料的前體物供應不足時，工程細菌就會產生“嚴緊反應”。當氨酰tRNA不足時，核糖體就會在密碼子上停留，并合成ppGpp的魔點蛋白，這是一種調控因子，會導致RNA聚合酶在模板上移動的停頓。（八）前體供應與菌體生長的關系1、工程菌的生長速率往往低于未七、基因工程菌中試

中試:生物技術藥物與其他藥物一樣，從實驗室研究到產業化必須經過中間放大試驗的系列工藝研究和驗證，這種中間放大試驗簡稱之。

中試放大的目的是驗證、復審和完善實驗室工藝所研究確定的反應條件，及研究選定的工業化生產設備結構、材質、安裝和車間布置等，為正式生產提供數據，以及物質量和消耗等。七、基因工程菌中試中試:生物技術藥物與其他藥物一樣，從實驗藥物從實驗室的微量制備到工廠的產業化制備，并不是簡單的數量級的線性放大關系，而是各種研究技術的系統集成和放大優化。中試研究的理想狀況是工藝穩定，工藝規模同等條件放大，使設計的生產批量和成本符合使用要求。基因工程菌中試需考慮以下幾方面：1工程菌的選擇2反應器的設計3發酵培養基的組成4工藝最佳化與參數監測控制5計算機應用藥物從實驗室的微量制備到工廠的產業化制備，并不是簡單的數量級1工程菌的選擇

能用基因重組技術獲得高產潛力以工業原料為培養基生產工藝能用一般的工業生產經驗產生和分泌的蛋白質不致病、無毒性、能安全生產。代謝能控制1工程菌的選擇

能用基因重組技術獲得2反應器的設計

反應器（發酵罐）的設計應符合生物反應與化學工程需要，因此在設計前應取得5種生物數據：培養細胞系特性細胞生長率發酵罐消毒方法溫度、溶氧、二氧化碳、pH值、代謝產物后處理效果2反應器的設計

反應器（發酵罐）的設計應符合生物反應與化3發酵培養基的組成

培養基作用:

提供化學元素,如碳、氮、氧、氫、磷、微量元素提供特殊的營養源，氨基酸、維生素提供能源，如葡萄糖控制代謝3發酵培養基的組成

培養基作用:4工藝最佳化與參數監測控制

工藝最佳化：最快周期、最高產量、最好質量、最低消耗、最大安全、最周全的廢物處理效果、最佳化速度與最低失敗率的綜合指標。參數監測控制：生物反應中，有4種參數需監測：

主要參數：pH值、溫度、溶氧、二氧化碳

生物量：渾濁度、細胞組分、總氮量及菌絲干重碳源：糖、有機酸、乙醇、淀粉、脂質

產品

4工藝最佳化與參數監測控制

工藝最佳化：5計算機應用熱電耦測量---溫度離子敏感電極---元素氧化還原電極---還原電位熱量計---熱平衡全部數據存于計算機5計算機應用熱電耦測量---溫度全部數據存于計算機最終目標：

工藝最佳化、產品產量與質量不斷提高、原材料與能源消耗不斷下降、成本降低。經計算機計算，模擬出一個高質、高產、低成本的生產工藝最佳化的控制微生物的數學公式。最終目標：八、基因工程菌的擴增和發酵生產（一）基因工程菌培養的程序（二）基因工程菌的培養方式（三）影響基因工程菌培養的各種因素分析（四）基因工程菌的培養設備----發酵罐（五）基因工程菌發酵工藝的優化八、基因工程菌的擴增和發酵生產（一）基因工程菌培養的程序（一）基因工程菌培養的程序

①搖瓶操作：了解工程菌生長的基礎條件，如溫度、pH、培養基各種組分以及碳氮比，分析表達產物的合成、積累對受體細胞的影響；

②培養罐操作：確定培養參數和控制的方案和順序。（一）基因工程菌培養的程序①搖瓶操作：了解工程菌生長的基（二）基因工程菌的培養方式1、補料分批培養2、連續培養3、透析培養4、固定化培養（二）基因工程菌的培養方式1、補料分批培養1、補料分批培養

將種子接入發酵反應器進行培養，經過一段時間后，間歇式或連續地補加新鮮培養基，使菌體進一步生長的方法。其目的是創造一個良好的微生物環境，延長菌體的對數生長期，來獲得高密度的菌體總量。1、補料分批培養將種子接入發酵反應器進行培養，經過一段2、連續培養

將種子接入發酵反應器中，攪拌式培養達到一定的菌體濃度后，同時進行進料、出料操作，通過控制一定的營養物稀釋比率，來進行不間斷式培養的培養方式。連續培養利于保持生產環境的恒定，利于控制菌體的生長速率。但是由于基因工程菌的不穩定性，導致連續培養比較困難。2、連續培養將種子接入發酵反應器中，攪拌式培養達到一3、透析培養

透析培養是利用膜的半透性原理，使得代謝產物和培養基分開，通過去除培養液中的代謝產物的方法來消除代謝產物對工程菌的不良影響。透析裝置是用半透膜將發酵器隔成兩半，形成發酵液區和透析液區，通過透析來及時移去合成產物。半透膜的種類、孔徑、面積、發酵液和透析液的比例、透析液的組成、循環流速、培養持續時間等因素會影響產物得率。3、透析培養透析培養是利用膜的半透性原理，使得代謝產物和4、固定化培養

為了維持質粒的穩定性，將固定化技術和基因工程菌結合起來，進行固定化式連續培養，有利于提高生產效率。

4、固定化培養為了維持質粒的穩定性，將固定化技術和基因（三）影響基因工程菌培養的各種因素

基因工程菌

傳統微生物生物材料 含外源重組基因 不含外源重組基因發酵工藝 使外源基因高效表達使自身基因表達目的產物

產生外源蛋白質

產生自身的代謝1、培養基的影響4、溶解氧的影響2、接種量的影響5、誘導時機的影響3、溫度的影響6、PH值的影響（三）影響基因工程菌培養的各種因素1、培養基的影響（1）常用碳源：葡萄糖、甘油、甘露糖、果糖。（2）常用氮源：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨。（3）其它組份：無機鹽、微量元素、維生素、生物素。（4）無機磷在許多初級代謝的酶促反應中是一個效應因子。1、培養基的影響（1）常用碳源：葡萄糖、甘油、甘露糖、果糖。2、接種量的影響

接種量是指所移入的種子液體量與培養液體量的比例，它的大小會影響發酵物的產量和發酵周期。（1）接種量小，菌體生長延遲，不利于外源基因的表達。（2）接種量適中，生產菌能夠迅速占領整個培養環境，減少菌體污染的機會。（3）接種量過大，菌體生長過快，代謝產物積累過多，反而會抑制后期菌體的生長。一般來說，10-15%的接種量，菌體的延遲期短、菌群迅速繁衍、很快進入對數生長期，適用于個源基因的表達。2、接種量的影響接種量是指所移入的種子液體量與培養液體量3、溫度的影響

溫度對基因表達的調控作用發生在復制、轉錄、翻譯、小分子蛋白質的合成水平等方面。（1）在復制水平，溫度可影響基因拷貝數量。（2）在轉錄水平，溫度可影響RNA聚合酶的作用，而來調控基因表達。（3）在翻譯水平上，還可以通過小分子蛋白質的合成水平來影響基因表達。（4）溫度還影響蛋白質的活性和包含體的形成。

3、溫度的影響溫度對基因表達的調控作用發生在復制、轉錄、4、溶解氧的影響

溶解氧對于工程菌發酵過程中的菌體代謝是有十分重要作用。細菌在大量擴增過程中，要進行消耗氧氣的生化反應過程。因此，維持較高水平的溶解氧水平（DO2≥40%），才能維持工程菌的快速生長和繁衍。

采用調節攪拌轉速的方法，可改善培養過程中的氧供給，提高活菌產量。4、溶解氧的影響溶解氧對于工程菌發酵過程中的菌體代謝是5、誘導時機的影響

對于λPL—clts875突變株工程菌來說，在28℃-30℃培養時，突變體能產生阻遏蛋白、來阻止啟動子的轉譯。當溫度升到42℃時，這種阻遏作用就消失。此時溫度對于工程菌的表達起誘導作用。

一般來說，對于處在生長期后期的工程菌進行誘導，如菌體細胞密度在109個/ml時，通過升溫誘導，可達到蛋白質表達增產的效果。5、誘導時機的影響對于λPL—clts875突變株工程菌6、pH值的影響

pH對于細胞的正常生長、外源蛋白的高效表達都有影響。（1）細胞生長期的最佳pH范圍是6.8--7.4。（2）外源蛋白表達的最佳pH范圍是6.0--6.5。在發酵過程中，細菌自身對pH值有一定的調節能力。當pH值超出其調節能力的范圍時，會影響細菌生長。發酵前期，pH值可控制在7.0，隨著蛋白質的表達，pH值不斷下降，當pH≤6.0時，應及時開動堿泵，加入堿液。6、pH值的影響pH對于細胞的正常生長、外源蛋白的高效表達（四）基因工程菌的培養設備----發酵罐1、發酵罐的組成2、發酵罐的要求（四）基因工程菌的培養設備----發酵罐1、發酵罐的組成1、發酵罐的組成（1）空氣加入系統----去水去油的空氣壓縮機+氣體流量計+空氣無菌過濾器+溶解氧電極+溶解氧控制系統。（2）pH調節系統----H電極+pH控制系統+酸堿補加裝置。（3）溫度控制系統----熱敏電極+溫度控制系統+加熱器+冷凍水浴冷卻系統。（4）消沫裝置（5）取樣裝置（6）旋轉攪拌裝置（7）進料系統----培養基加入口。（8）排出系統----氣體排出+冷卻水排出+廢料排出。1、發酵罐的組成（1）空氣加入系統----去水去油的空氣壓縮2、發酵罐的要求（1）總體要求（2）具體要求2、發酵罐的要求（1）總體要求（1）總體要求（A）保證發酵環境條件恒定，（B）不影響其遺傳特性，（C）不能引起所帶質粒丟失。（1）總體要求（A）保證發酵環境條件恒定，（2）具體要求（A）提供菌體生長的最適條件，（B）培養過程不得污染，（C）保證純菌培養，（D）培養及消毒過程中不得游離出異物，（E）不能干擾細菌的代謝活動。（F）發酵罐應當用不銹鋼制成，表面光潔，沒有滅菌死角。（G）任何接口必須用密封圈，不得存在泄漏，（H）為避免基因工程菌在自然界擴散，培養液廢物必須經過殺滅處理后才能進行排放。以免基因污染。（2）具體要求（A）提供菌體生長的最適條件，（五）基因工程菌發酵工藝的優化

是指形成基因工程菌發酵生產的最佳化工藝，

（1）目標----最快反應周期、最高產量、最高質量、最低消耗、最大安全性、最周全的廢物處理效果、最佳速度、最低失敗率。（2）具體方法----通過在不同菌種之間進行重復試驗、繪制出發酵代謝曲線、從而設計出最佳工藝條件。（五）基因工程菌發酵工藝的優化是指形成基因工程菌發酵生產的生活中的辛苦阻撓不了我對生活的熱愛。1月-231月-23Monday,January2,2023人生得意須盡歡，莫使金樽空對月。23:12:3123:12:3123:121/2/202311:12:31PM做一枚螺絲釘，那里需要那里上。1月-2323:12:3123:12Jan-2302-Jan-23日復一日的努力只為成就美好的明天。23:12:3123:12:3123:12Monday,January2,2023安全放在第一位，防微杜漸。1月-231月-2323:12:3123:12:31January2,2023加強自身建設，增強個人的休養。2023年1月2日11:12下午1月-231月-23精益求精，追求卓越，因為相信而偉大。02一月202311:12:31下午23:12:311月-23讓自己更加強大，更加專業，這才能讓自己更好。一月2311:12下午1月-2323:12January2,2023這些年的努力就為了得到相應的回報。2023/1/223:12:3123:12:3102January2023科學，你是國力的靈魂；同時又是社會發展的標志。11:12:31下午11:12下午23:12:311月-23每天都是美好的一天，新的一天開啟。1月-231月-2323:1223:12:3123:12:31Jan-23相信命運，讓自己成長，慢慢的長大。2023/1/223:12:31Monday,January2,2023愛情，親情，友情，讓人無法割舍。1月-232023/1/223:12:311月-23謝謝大家！生活中的辛苦阻撓不了我對生活的熱愛。12月-2212月-22第三節基因工程制藥生產的基本過程一、工具酶的分離純化二、載體的分離純化三、外源DNA和目的基因的分離和獲得四、外源DNA與載體DNA的切割與連接五、宿主細胞的選擇和基因導入操作六、基因工程菌的穩定性及生長代謝的特點七、基因工程菌中試八、基因工程菌的擴增和發酵生產九、基因工程藥物的分離和純化技術十、變性蛋白的復性十一、基因工程藥物的質量控制十二、基因工程藥物的制造實例第三節基因工程制藥生產的基本過程一、工具酶的分離純化六、基因工程菌的穩定性及生長代謝的特點

（一）基因工程菌質粒的不穩定性（二）質粒穩定性的分析方法（三）質粒不穩定的原因（四）提高質粒穩定性的方法（五）基因工程菌的生長速率（六）蛋白質產量/菌體數量比（七）能量供應與菌體生長的關系（八）小分子前體、催化劑供應與菌體生長的關系六、基因工程菌的穩定性及生長代謝的特點

（一）基因工程菌質粒（一）基因工程菌質粒的不穩定性基因工程菌在傳代過程中常出現質粒不穩定的現象，有分裂不穩定和結構不穩定。由于質粒不穩定導致的質粒丟失菌與含有質粒的菌之間生產速率不一致導致可能的生長優勢，進而能在培養基中逐漸取代含質粒菌成為優勢菌群，從而減少基因表達的產率，導致基因工程菌在生產過程中出現不穩定現象。

（一）基因工程菌質粒的不穩定性基因工程菌在傳代過程中常出現質（二）質粒穩定性的分析方法（1）將工程菌培養液樣品適當稀釋，均勻涂于不含抗生素標記的平板培養基，培養10-12h，統計所長出的菌落數A；（2）然后隨機挑選100個菌落，接種到含有抗生素標記的平板培養基，培養10-12h，統計所長出的菌落數B；（3）計算B/A的比值。該比值能反映質粒的穩定性,稱為穩定性(stability,ST)

（二）質粒穩定性的分析方法（1）將工程菌培養液樣品適當稀釋，（三）質粒不穩定的原因1、分裂不穩定:指基因工程菌在分裂的子代菌體中，出現一定比例不含質粒的現象。它主要與2個因素有關：

（1）工程菌產生丟失質粒的概率，拷貝量低的工程細菌，它所產生不含質粒的細菌變異株和概率較大。

（2）丟失質粒的細菌、含有質粒的工程菌之間的競爭力大小。2、結構不穩定:指外源基因從質粒上丟失、或者發生堿基重排、缺失現象，最終導致工程菌性能改變的現象。（三）質粒不穩定的原因1、分裂不穩定:指基因工程菌在分裂的子（四）提高質粒穩定性的方法1、選擇合適的宿主菌2、選擇合適的載體3、選擇性壓力4、分階段培養5、控制培養條件6、固定化（四）提高質粒穩定性的方法1、選擇合適的宿主菌1、選擇合適的宿主菌

宿主菌的遺傳特性對質粒的穩定性影響很大。1、選擇合適的宿主菌宿主菌的遺傳特性對質粒的穩定性影響很2、選擇合適的載體

含低拷貝質粒的菌產生不含質粒的子代菌頻率大于含高拷貝質粒的菌。2、選擇合適的載體

含低拷貝質粒的菌產生不含質粒的子代3、選擇性壓力

因為丟失質粒的細菌在含的抗生素的培養基中不能正常生長。所以可通過加入抗生素來抑制質粒丟失的細菌的生長。3、選擇性壓力

因為丟失質粒的細菌在含的抗生素的培養4、分階段培養

工程菌的培養一般分為2個階段：

（1）第一階段:先使菌體生長至一定密度。

（2）第二階段:開始誘導外源基因的表達。由于第一階段外源基因沒有表達，減少了丟失質粒的細菌的產生概率，也就增加了工程菌的穩定性。4、分階段培養

工程菌的培養一般分為2個階段：

（1）第5、控制培養條件

通過溫度、pH值、培養基組分、溶解氧的綜合調節措施通過以下方法可以提高質粒的穩定性。（1）間歇送氧（2）改變稀釋速率5、控制培養條件

通過溫度、pH值、培養基組分、溶解氧的6、固定化

固定化可提高基因重組大腸桿菌的穩定性。6、固定化

固定化可提高基因重組大腸桿菌的穩定性。（五）基因工程菌的生長速率

細菌菌體生長是核酸和蛋白質的綜合表現，通常用比生長速率表征。

比生長速率:μ表征微生物生長速率的參數。

菌體生長對于提高質粒的穩定性、減少代謝副產物的積累、提高外源蛋白質的產量都有重要的意義。基因工程菌的生長速率可通過選用不同的碳源、控制補料量、稀釋速率的方法來加以控制。（五）基因工程菌的生長速率細菌菌體生長是核酸和蛋白質的（六）蛋白質產量/菌體數量比

在基因工程菌的發酵生產過程中，蛋白質產量/菌體數量比基本上是一個恒定值。細菌生長速度快，其蛋白質合成的速度也相應加快。

（六）蛋白質產量/菌體數量比在基因工程菌的發酵生產過程中（七）能量供應與菌體生長的關系1、Andersen理論（1）Andersen等人通過實驗發現，培養基中所能提供的最大能量決定著工程細菌的最大生長速率。（2）當培養基提供的能量不足時，細菌往往會產生代謝副產物乙酸，而乙酸則會明顯抑制細菌的生長。其實質是由于三羧酸循環的供能不足，導致部分乙酰輔酶A轉化成乙酸來供能。2、改進方法（1）適當提高pH值，可以減少乙酸的抑制作用。（2）分批選用不同的碳源、控制補料速度、能在一定范圍之內，控制細菌的過度生長，從而抑制乙酸的產生。（七）能量供應與菌體生長的關系1、Andersen理論（八）前體供應與菌體生長的關系1、工程菌的生長速率往往低于未經克隆的原始宿主細胞2、外源基因的大量表達常常引起工程菌的生長停滯。這種停滯與能量供應無關。3、在基礎培養基中加入氨基酸，能使細菌的生長速率提高。4、當合成材料的前體物供應不足時，工程細菌就會產生“嚴緊反應”。當氨酰tRNA不足時，核糖體就會在密碼子上停留，并合成ppGpp的魔點蛋白，這是一種調控因子，會導致RNA聚合酶在模板上移動的停頓。（八）前體供應與菌體生長的關系1、工程菌的生長速率往往低于未七、基因工程菌中試

中試:生物技術藥物與其他藥物一樣，從實驗室研究到產業化必須經過中間放大試驗的系列工藝研究和驗證，這種中間放大試驗簡稱之。

中試放大的目的是驗證、復審和完善實驗室工藝所研究確定的反應條件，及研究選定的工業化生產設備結構、材質、安裝和車間布置等，為正式生產提供數據，以及物質量和消耗等。七、基因工程菌中試中試:生物技術藥物與其他藥物一樣，從實驗藥物從實驗室的微量制備到工廠的產業化制備，并不是簡單的數量級的線性放大關系，而是各種研究技術的系統集成和放大優化。中試研究的理想狀況是工藝穩定，工藝規模同等條件放大，使設計的生產批量和成本符合使用要求。基因工程菌中試需考慮以下幾方面：1工程菌的選擇2反應器的設計3發酵培養基的組成4工藝最佳化與參數監測控制5計算機應用藥物從實驗室的微量制備到工廠的產業化制備，并不是簡單的數量級1工程菌的選擇

能用基因重組技術獲得高產潛力以工業原料為培養基生產工藝能用一般的工業生產經驗產生和分泌的蛋白質不致病、無毒性、能安全生產。代謝能控制1工程菌的選擇

能用基因重組技術獲得2反應器的設計

反應器（發酵罐）的設計應符合生物反應與化學工程需要，因此在設計前應取得5種生物數據：培養細胞系特性細胞生長率發酵罐消毒方法溫度、溶氧、二氧化碳、pH值、代謝產物后處理效果2反應器的設計

反應器（發酵罐）的設計應符合生物反應與化3發酵培養基的組成

培養基作用:

提供化學元素,如碳、氮、氧、氫、磷、微量元素提供特殊的營養源，氨基酸、維生素提供能源，如葡萄糖控制代謝3發酵培養基的組成

培養基作用:4工藝最佳化與參數監測控制

工藝最佳化：最快周期、最高產量、最好質量、最低消耗、最大安全、最周全的廢物處理效果、最佳化速度與最低失敗率的綜合指標。參數監測控制：生物反應中，有4種參數需監測：

主要參數：pH值、溫度、溶氧、二氧化碳

生物量：渾濁度、細胞組分、總氮量及菌絲干重碳源：糖、有機酸、乙醇、淀粉、脂質

產品

4工藝最佳化與參數監測控制

工藝最佳化：5計算機應用熱電耦測量---溫度離子敏感電極---元素氧化還原電極---還原電位熱量計---熱平衡全部數據存于計算機5計算機應用熱電耦測量---溫度全部數據存于計算機最終目標：

工藝最佳化、產品產量與質量不斷提高、原材料與能源消耗不斷下降、成本降低。經計算機計算，模擬出一個高質、高產、低成本的生產工藝最佳化的控制微生物的數學公式。最終目標：八、基因工程菌的擴增和發酵生產（一）基因工程菌培養的程序（二）基因工程菌的培養方式（三）影響基因工程菌培養的各種因素分析（四）基因工程菌的培養設備----發酵罐（五）基因工程菌發酵工藝的優化八、基因工程菌的擴增和發酵生產（一）基因工程菌培養的程序（一）基因工程菌培養的程序

①搖瓶操作：了解工程菌生長的基礎條件，如溫度、pH、培養基各種組分以及碳氮比，分析表達產物的合成、積累對受體細胞的影響；

②培養罐操作：確定培養參數和控制的方案和順序。（一）基因工程菌培養的程序①搖瓶操作：了解工程菌生長的基（二）基因工程菌的培養方式1、補料分批培養2、連續培養3、透析培養4、固定化培養（二）基因工程菌的培養方式1、補料分批培養1、補料分批培養

將種子接入發酵反應器進行培養，經過一段時間后，間歇式或連續地補加新鮮培養基，使菌體進一步生長的方法。其目的是創造一個良好的微生物環境，延長菌體的對數生長期，來獲得高密度的菌體總量。1、補料分批培養將種子接入發酵反應器進行培養，經過一段2、連續培養

將種子接入發酵反應器中，攪拌式培養達到一定的菌體濃度后，同時進行進料、出料操作，通過控制一定的營養物稀釋比率，來進行不間斷式培養的培養方式。連續培養利于保持生產環境的恒定，利于控制菌體的生長速率。但是由于基因工程菌的不穩定性，導致連續培養比較困難。2、連續培養將種子接入發酵反應器中，攪拌式培養達到一3、透析培養

透析培養是利用膜的半透性原理，使得代謝產物和培養基分開，通過去除培養液中的代謝產物的方法來消除代謝產物對工程菌的不良影響。透析裝置是用半透膜將發酵器隔成兩半，形成發酵液區和透析液區，通過透析來及時移去合成產物。半透膜的種類、孔徑、面積、發酵液和透析液的比例、透析液的組成、循環流速、培養持續時間等因素會影響產物得率。3、透析培養透析培養是利用膜的半透性原理，使得代謝產物和4、固定化培養

為了維持質粒的穩定性，將固定化技術和基因工程菌結合起來，進行固定化式連續培養，有利于提高生產效率。

4、固定化培養為了維持質粒的穩定性，將固定化技術和基因（三）影響基因工程菌培養的各種因素

基因工程菌

傳統微生物生物材料 含外源重組基因 不含外源重組基因發酵工藝 使外源基因高效表達使自身基因表達目的產物

產生外源蛋白質

產生自身的代謝1、培養基的影響4、溶解氧的影響2、接種量的影響5、誘導時機的影響3、溫度的影響6、PH值的影響（三）影響基因工程菌培養的各種因素1、培養基的影響（1）常用碳源：葡萄糖、甘油、甘露糖、果糖。（2）常用氮源：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨。（3）其它組份：無機鹽、微量元素、維生素、生物素。（4）無機磷在許多初級代謝的酶促反應中是一個效應因子。1、培養基的影響（1）常用碳源：葡萄糖、甘油、甘露糖、果糖。2、接種量的影響

接種量是指所移入的種子液體量與培養液體量的比例，它的大小會影響發酵物的產量和發酵周期。（1）接種量小，菌體生長延遲，不利于外源基因的表達。（2）接種量適中，生產菌能夠迅速占領整個培養環境，減少菌體污染的機會。（3）接種量過大，菌體生長過快，代謝產物積累過多，反而會抑制后期菌體的生長。一般來說，10-15%的接種量，菌體的延遲期短、菌群迅速繁衍、很快進入對數生長期，適用于個源基因的表達。2、接種量的影響接種量是指所移入的種子液體量與培養液體量3、溫度的影響

溫度對基因表達的調控作用發生在復制、轉錄、翻譯、小分子蛋白質的合成水平等方面。（1）在復制水平，溫度可影響基因拷貝數量。（2）在轉錄水平，溫度可影響RNA聚合酶的作用，而來調控基因表達。（3）在翻譯水平上，還可以通過小分子蛋白質的合成水平來影響基因表達。（4）溫度還影響蛋白質的活性和包含體的形成。

3、溫度的影響溫度對基因表達的調控作用發生在復制、轉錄、4、溶解氧的影響

溶解氧對于工程菌發酵過程中的菌體代謝是有十分重要作用。細菌在大量擴增過程中，要進行消耗氧氣的生化反應過程。因此，維持較高水平的溶解氧水平（DO2≥40%），才能維持工程菌的快速生長和繁衍。

采用調節攪拌轉速的方法，可改善培養過程中的氧供給，提高活菌產量。4、溶解氧的影響溶解氧對于工程菌發酵過程中的菌體代謝是5、誘導時機的影響

對于λPL—clts875突變株工程菌來說，在28℃-30℃培養時，突變體能產生阻遏蛋白、來阻止啟動子的轉譯。當溫度升到42℃時，這種阻遏作用就消失。此時溫度對于工程菌的表達起誘導作用。

一般來說，對于處在生長期后期的工程菌進行誘導，如菌體細胞密度在109個/ml時，通過升溫誘導，可達到蛋白質表達增產的效果。5、誘導時機的影響對于λPL—clts875突變株工程菌6、pH值的影響

pH對于細胞的正常生長、外源蛋白的高效表達都有影響。（1）細胞生長期的最佳pH范圍是6.8--7.4。（2）外源蛋白表達的最佳pH范圍是6.0--6.5。在發酵過程中，細菌自身對pH值有一定的調節能力。當pH值超出其調節能力的范圍時，會影響細菌生長。發酵前期，pH值可控制在7.0，隨著蛋白質的表達，pH值不斷下降，當pH≤6.0時，應及時開動堿泵，加入堿液。6、pH值的影響pH對于細胞的正常生長、外源蛋白的高效表達（四）基因工程菌的培養設備----發酵罐1、發酵罐的組成2、發酵罐的要求（四）基因工程菌的培養設備----發酵罐1、發酵罐的組成1、發酵罐的組成（1）空