貴陽學(xué)院畢業(yè)論文（設(shè)計）PAGEPAGE17目錄INDEX\o"S"\c"2"\z"2052"摘要 2ABSTRACT 3第一章前言 4一、細(xì)胞色素P450還原酶的概述 4二、細(xì)胞色素P450還原酶的結(jié)構(gòu)和功能 5三、細(xì)胞色素P450還原酶在昆蟲中的研究進(jìn)展 6四、藥材甲的防治現(xiàn)狀 7五、研究的目的意義 7第二章藥材甲CPR基因的克隆及序列分析 8一、材料與方法 8（一）供試蟲源 8（二）試劑與儀器 8（三）總RNA提取 9（四）基因組DNA的去除 9（五）反轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈 9（六）PCR引物設(shè)計 10（七）PCR產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化、測序 10（八）藥材甲CPR基因的序列分析 10二、結(jié)果與分析 10（一）藥材甲CPR基因的序列分析 11（二）CPR基因的系統(tǒng)發(fā)育分析 14三、討論 14（一）NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶(CPR)的結(jié)構(gòu)與功能 14（二）藥材甲NADPH-細(xì)胞色素還原酶(CPR)的表達(dá)情況 15（三）NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶(CPR)與昆蟲代謝抗性 15（四）NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶(CPR)與昆蟲生長發(fā)育 15第三章參考文獻(xiàn) 16致謝 17摘要藥材甲［Stegobiumpaniceum(L．)］隸屬于鞘翅目(Cole-optera)竊蠹科(Anobiidae)，是一種世界性的儲藏物害蟲，主要危害藥材、谷物、油料等儲藏物品，我國大部分省區(qū)都有分布，且是中藥材儲藏期害蟲的優(yōu)勢種。藥材甲成蟲體型較小，幼蟲在寄主組織內(nèi)部生存，因此，其危害具有較強(qiáng)的隱蔽性，加之在儲藏室光線較暗等，往往在人們發(fā)現(xiàn)其危害時，已經(jīng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。然而，由于殺蟲劑頻繁且不合理的使用，藥材甲對擬除蟲菊醋類殺蟲劑的杭性水平逐漸提高。抗性機(jī)理表明細(xì)胞色素P450氧化酶活性增強(qiáng)在藥材甲對擬除蟲菊醋類殺蟲劑抗性中起主要作用。NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶(CPR)是細(xì)胞色素P450氧化還原酶系的重要組成部分，在細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)中起限速作用。本研究通過一些軟件對其開放閱讀框，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、信號肽、跨膜區(qū)域，N-糖基化位點進(jìn)行預(yù)測。對藥材甲的防治進(jìn)行闡述。關(guān)鍵字：藥材甲；細(xì)胞色素P450還原酶；氨基酸序列分析ABSTRACTAmedicine[Stegobiumpaniceum(L.)]belongstoColeoptera(Cole-optera)anobiidsBranch(Anobiidae),isaworldwidestoragepests,mainlyagainstherbs,cereals,oilseedsandotherstorageitems,mostofprovinceshavedistributionandstorageofmedicinesisthedominantspeciesofpests.Adultsofthesmallerherbs,larvalsurvivalwithinthehosttissue,andtherefore,theharmhasstrongconcealment,combinedwithlowlightinthestorageroom,etc.,oftenatthetimeitwasdiscoveredthattheharmalreadycausedseriouseconomiclosses.However,duetofrequentandunjustifieduseofpesticides,medicinesAvinegarforpyrethroidinsecticidesHanglevelsincreasedgradually.ResistanceMechanismshowthatcytochromeP450oxidaseactivityplaysamajorroleinenhancingherbsAonpyrethroidinsecticideresistanceinvinegar.NADPH-cytochromeP450reductase(CPR)isanimportantcomponentofcytochromeP450oxidoreductasesystem,startinginthecytochromeP450-mediatedoxidation-reductionreactionrate-limitingeffect.

Inthisstudy,someofthesoftwaretopredictitsopenreadingframe,thephysicalandchemicalpropertiesofproteins,thesignalpeptide,transmembraneregion,N-glycosylationsites.Apreventionofherbstoelaborate. Keywords:Stegobium;cytochromeP450reductase;aminoacidsequenceanalysis前言一、細(xì)胞色素P450還原酶的概述細(xì)胞色素P450（cytochromeP450或CYP450，簡稱CYP450）為一類亞鐵血紅素—硫醇鹽蛋白的超家族，它參與內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)的代謝，外源性物質(zhì)包括藥物、環(huán)境化合物。CYP450為單加氧酶系（cytochromeP450monooxygenases，P450s），簡稱P450酶系，廣泛分布于生物有機(jī)體內(nèi)部的光滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，根據(jù)物種的不同，主要分布于真核細(xì)胞微粒體中的微粒體型和位于真核細(xì)胞線粒體中的線粒體型。完整微粒體P450酶系主要分為五部分：NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶（NADPHcytochromeP450reductase，CPR）、細(xì)胞色素P450（cytochromeP450，P450）、NADH-細(xì)胞色素b5還原酶（cytochromeb5，reductNADH-細(xì)胞色素b5還原酶（NADHcytochromeb5，reductase，CBR）、細(xì)胞色素b5（cytochromeb5,cytb5,CYB5）和磷脂；線粒體P450酶系除FAD/FMN黃素蛋白（還原酶作用）和還原型鐵硫蛋白外，還包括P450[1]。細(xì)胞色素P450還原酶電子傳遞過程如圖1所示：圖1.微粒體和線粒體細(xì)胞色素P450的電子傳遞復(fù)合體細(xì)胞色素P450還原酶(CytochromeP450Reductase,CPR)是生物體內(nèi)氧化系統(tǒng)中的電子供體，是細(xì)胞色素P450酶系中重要的功能單位，在細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)中起限速作用，是氧化反應(yīng)中的關(guān)鍵酶[2]。CPR在細(xì)胞色素P450藥物代謝酶系中為細(xì)胞色素P450提供電子的膜蛋白。是參與催化天然產(chǎn)物合成的一類含有血紅素的氧化酶類，在體內(nèi)可催化大量的初級和次級代謝反應(yīng)，次生代謝產(chǎn)物和植物激素的生物合成和除草劑等外源化學(xué)物質(zhì)的脫毒有重要關(guān)系。這類酶催化的反應(yīng)是通過電子傳遞系統(tǒng)，把電子從NAD(P)H傳遞到微粒體系統(tǒng)中的CPR或鐵氧蛋白還原酶，然后再到細(xì)胞色素P450s；這樣使得分子氧(O2)還原活化再將一個氧原子插入底物。生物體內(nèi)的P450s主要以細(xì)胞色素P450還原酶為電子供體，P450s的電子傳遞反應(yīng)是P450s氧化還原反應(yīng)的限速步驟[3]。CPR是一類黃素蛋白(Flavoprotein)，它定位在光滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，它有保守的黃素單核苷酸(flavinmononucleotide，F(xiàn)MN)、還原型煙酰胺腺11票呤二核苷酸碟酸(nicotinamideadeninedinucleotidephosphateoxidase,NADPH)結(jié)合域和黃素腺p票呤二核苷酸(flavinadeninedinucleotide，F(xiàn)AD)，能將電子從NADPH傳遞到各種P450助其行使催化功能。很多離體實驗表明了CPR能夠顯著促進(jìn)P450的生物活性。利用RNAi技術(shù)可以降低CPR基因的表達(dá)量后昆蟲對農(nóng)藥的敏感性降低，該研究說明了CPR在P450代謝過程具有重要作用。因為昆蟲觸角中數(shù)量眾多的P450是潛在的氣味分子降解酶，那么CPR很可能也在觸角中參與代謝氣味分子的表達(dá)過程。海灰翅夜蛾（Spodopteralittoralis）、岡比亞按蚊（Anophelesgambiae）和黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)的CRR基因均在觸角中大量表達(dá)，這表面該基因具有很強(qiáng)的嗅覺功能[4]。二、細(xì)胞色素P450還原酶的結(jié)構(gòu)和功能微粒體細(xì)胞色素P450與CPR一樣同屬于膜結(jié)合蛋白類，其主要功能是通過電子傳遞系統(tǒng)參與到內(nèi)外源物質(zhì)的代謝。該電子的傳遞過程是CPR以黃素輔酶FAD為電子傳入端口從NADPH電子供體上接受一對電子而形成氫化物離子，再以FMN為電子傳出端口一次將一個電子傳遞到細(xì)胞色素P450隨后細(xì)胞色素P450依次將這些電子用于各種底物的氫基化反應(yīng)。NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶(CPR)是哺乳動物中僅存的兩個以FMN和FAD為輔酶的一類氧化還原酶之一，另一個為氮氧化合成酶(NOS)。NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶包含兩個功能域疏水N端膜結(jié)合域和含有數(shù)個結(jié)構(gòu)域的親水C端催化域。疏水N端膜結(jié)合域大小為6kDa，功能是使蛋白分子錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜上，維持CPR正確的空間構(gòu)象，確保電子在CPR與細(xì)胞色素P450之間順利傳遞。C端催化域大小為72kDa，是CPR參與催化反應(yīng)的主要部位，可以進(jìn)一步分為四個結(jié)構(gòu)域，從N端到C端依次為FMN結(jié)合域、連接域、FAD和NADPH結(jié)合域[5]。圖2.CPR的蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖。圖中標(biāo)示了各輔助因子的結(jié)合區(qū)域，α螺旋用空心柱面表示并用字母標(biāo)明，β折疊用實心箭頭表示并用數(shù)字標(biāo)明，不規(guī)則螺旋用黑線表示并用數(shù)字標(biāo)明相應(yīng)的殘基數(shù)。四個結(jié)構(gòu)域用虛框表示，Ⅰ-Ⅳ分別為結(jié)合域、連接域、FAD結(jié)合域和NADPH結(jié)合域。底部顯示了各結(jié)構(gòu)域在蛋白中的線性排列連接域用點狀框表示。在真核生物中有時候細(xì)胞色素b5在某些P450催化反應(yīng)中也能夠提供第二個電子，但是CPR卻是所有微粒體P450的唯一電子供體。CPR也能夠?qū)㈦娮觽鬟f給角鱉烯單加氧酶、細(xì)胞色素bs、7一脫氫膽多醇氧化還原酶和血紅素氧化酶。此外在P450酶不參與的情況下CPR還能夠通過單電子還原反應(yīng)活化抗癌藥物前體在體外還原非生理電子受體如甲蔡醒、細(xì)胞色素c和提氰化物。在動物體中僅僅只有一種CPR基因被鑒定，因此一個單一的CPR與多種不同的P450酶相互作用，因此推測CPR在P450單加氧酶反應(yīng)過程中起到限速的作用。CPR家族以兩種核黃素(FAD和FMN)為輔酶并通過FAD和FMN實現(xiàn)電子在核酸與血紅素間游離的酶系。除CPR以外該家族還包括細(xì)菌亞硫酸鹽還原酶和P450B3NOS[5]。與植物不同的是昆蟲基因組中迄今為止僅僅只發(fā)現(xiàn)有1個P450還原酶基因存在，由于其在P450電子傳遞鏈中處于特殊地位，P450還原酶在P450酶系對外源物質(zhì)進(jìn)行脫毒。研究發(fā)現(xiàn)P450還原酶基因在果蠅綠色細(xì)胞中高水平表達(dá)，推測其可能同表皮碳?xì)浠衔锏暮铣捎嘘P(guān)[6]，P450異源表達(dá)產(chǎn)物中加入P450還原酶蛋白，可提高P450對植物化感物質(zhì)的代謝活性[7]；利用RNAi將溫帶臭蟲Cimexlectularius和岡比亞按蚊Anophelescostails的P450還原酶基因沉默后，二者對擬除蟲菊酯的敏感性均明顯上升[8,9]。三、細(xì)胞色素P450還原酶在昆蟲中的研究進(jìn)展CPR作為黃素氧化還原酶，對底物提供電子，使其參與氧化還原反應(yīng)，其底物包括細(xì)胞色素C，所有的微粒體CYPs以及其他氧化型化合物，酶類以及分子氧。關(guān)于CYPs的研究廣泛而深入，包括從蛋白分類、基因調(diào)控、不同CYPs間的相互作用、CYPs在整體及個體藥物代謝中的作用方面對這個重要的代謝酶體系有了比較深刻的認(rèn)識。但作為CYPs的電子供體，關(guān)于CPR與CYPs的作用機(jī)制研究的并不多[10]。汪丹采用RACE技術(shù)測到棉鈴蟲CPR基因(HaCPR)的全長cDNA序列，研究了這個基因在棉鈴蟲體內(nèi)的時空表達(dá),并分別通過注射和喂食dsRNA兩種方法影響HaCPR基因的表達(dá)，觀察Ha-CPR基因沉默后棉鈴蟲對殺蟲劑的毒力、解毒代謝酶活力和生長發(fā)育的影響，以期為深入研究細(xì)胞色素P450酶系在棉鈴蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性形成及棉鈴蟲的生長發(fā)育過程中的作用提供一定的理論基礎(chǔ)[5]。利用RT-PCR和RACE技術(shù)，得到了棉鈴蟲NADPH一細(xì)胞色素P450還原酶基因（Ha-CPR）全長cDNA，大小為2232bp，開放閱讀框為2070，編碼690個氨基酸。藥材甲CPR基因氨基酸序列同源性比對分析結(jié)果表明：該基因與赤擬谷盜TriboliumcastaneumCPR基因具有最高的同源性[5]。關(guān)于CPR電子傳遞的機(jī)制一直是研究的熱點。對可能的關(guān)鍵位點進(jìn)行定點突變，是研究FAD或FMN與蛋白結(jié)合及兩者相互關(guān)系的主要方法。Shen等用苯丙氨酸和天冬氨酸取代140位和178位的酪氨酸（Tyr-140和Tyr-178），發(fā)現(xiàn)天冬氨酸取代Tyr-178后FMN不結(jié)合CPR且CPR失去細(xì)胞色素C反應(yīng)活性，取代Tyr-140不影響FMN連接，但是減少了CPR的5倍活性。用苯丙氨酸取代不影響酶活性。Tyr-178位點天冬氨酸的取代同樣影響了FAD的結(jié)合水平，說明FAD的結(jié)合依賴于FMN，推測FMN的連接是FAD連接的先導(dǎo)條件。與Tyr140和Tyr178相似，Phe181位點也接近FMN的異咯嗪環(huán)，并在FMN結(jié)合區(qū)域有高度保守的序列，取代Phe181降低了CPR還原細(xì)胞色素C活性的一半。結(jié)果表明Tyr178、Phe181和Tyr140對FMN與酶的結(jié)合和FMN-酶蛋白復(fù)合物的穩(wěn)定起著非常的重要作用[10]。四、藥材甲的防治現(xiàn)狀藥材甲的形態(tài)特征對其生存非常有利。卵和低齡幼蟲體小，肉眼不可見，幼蟲及蛹均在藥材內(nèi)部生活，受外界環(huán)境影響小，這是藥材甲數(shù)量不斷上升的主要原因。調(diào)查發(fā)現(xiàn)藥材甲能在幾乎所有的藥材上生存和繁衍。復(fù)雜的食性及其在惡劣環(huán)境(低溫、干燥甚至少食缺食)中的適應(yīng)能力使其生存競爭處于優(yōu)勢，在種間競爭中處于有利的地位[11]。由于藥材甲危害大，分布范圍廣，寄主多，各國專家很早就對其防治展開深入的研究。擬除蟲菊酯類藥劑熏蒸或煙熏在早期被證明能夠有效控制藥材甲危害。雖然磷化氫和溴甲烷是目前藥材甲等儲藏物害蟲防治比較普遍且有效的熏蒸劑，但溴甲烷對臭氧層有破壞作用，世界糧農(nóng)組織已決定逐步停止生產(chǎn)和使用，磷化氫由于害蟲抗藥性基因的產(chǎn)生，其使用受到了限制[12]，更重要的是化學(xué)防治對施藥者和消費者健康及對環(huán)境的污染的影響，使得人們的憂慮和擔(dān)心與日俱增。因此，近幾年來，有關(guān)生物源殺蟲劑、天敵昆蟲、驅(qū)避劑信息素和氣調(diào)控制等領(lǐng)域的研究越來越深入，而生物防治技術(shù)是環(huán)保，綠色的防治，符合我國綠色環(huán)保理念，因此，生物防治已經(jīng)成為害蟲控制的最理想戰(zhàn)略之一[13]。五、研究的目的意義我國地域遼闊，擁有豐富的藥用植物資源，而中藥藥用植物的研究在我國是很早的，如李時珍的《本草綱目》里面記載了很多藥物，而且對每一種藥物都做了詳盡的闡述，然而許多儲藏物害蟲嚴(yán)重威脅到中藥材的儲藏。藥材甲就是很典型的一種，在儲藏物害蟲領(lǐng)域的研究不斷深入，雖然多數(shù)儲藏物害蟲的生物防治技術(shù)日趨完備，有物理法、化學(xué)法、生物防治等方法，但是對于藥材甲這一儲藏物昆蟲的防治研究卻寥寥無幾。自從藥材甲嚴(yán)重危害中藥材的儲藏以來，高效、低毒的殺蟲劑被大量應(yīng)用于防治藥材甲。然而，由于殺蟲劑頻繁且不合理的使用，藥材甲對殺蟲劑的抗性水平逐年提高。研究發(fā)現(xiàn)藥材甲對殺蟲劑的解毒代謝抗性通常是由1個或多個已知或未知的P450基因過量表達(dá)引起的，即便是同一個P450基因在不同地理種群的藥材甲對同種殺蟲劑的抗性形成中所起的作用也有可能不同，因此很難確定產(chǎn)生代謝抗性的真正原因。RNAi技術(shù)的出現(xiàn)為解決這一問題提供了可能，盡管無法確定參與解毒代謝作用的細(xì)胞色素P450基因有哪些，但是，由于藥材甲體內(nèi)參與解毒代謝作用的細(xì)胞色素還原酶只有一種，而且P450解毒代謝作用必須在有細(xì)胞色素P450還原酶存在的情況下才能發(fā)生，因此只要將藥材甲體內(nèi)的細(xì)胞色素P450還原酶基因沉默，就可能影響細(xì)胞色素P450的解毒代謝作用，一方面從反向遺傳學(xué)角度驗證細(xì)胞色素P450酶系在解毒代謝中的作用，另一方面研究干擾還原酶基因?qū)λ幉募讓⑾x劑敏感性的影響，探索通過沉默細(xì)胞色素P450還原酶基因有效控制藥材甲抗性害蟲成為一種可能[5]。藥材甲CPR基因的克隆及序列分析一、材料與方法（一）供試蟲源供試?yán)ハx于2014年7月采自貴陽市藥材公司和貴陽三橋藥材批發(fā)市場，經(jīng)室內(nèi)馴化2代，供實驗。實驗選用寄主藥材甘遂Euphorbiakansui，購于貴陽市藥材公司。供試藥材經(jīng)過干燥50e殺蟲12h處理，備用。（二）試劑與儀器1.主要試劑：RQ1RNase-FreeDNasePromegaTRIzolReagentInvitrogenPrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKitTakaraOneStepPrimeScriptTMRT-PCRKitTakaraTaq酶及PCR相關(guān)試劑Takara克隆載體pGEMeq\o\ac(○,R)-TEeasyPromega化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞Tran5ɑChemicallyCompetentCell北京全式金T4DNALigase北京泰天和DNAMkarkerDL2000plus北京全式金X-galAmerscoIPTGAmerscoDEPCAmersco蛋白胨TryptoneOxoid酵母提取物YeastestractOxoidAgarose西班牙進(jìn)口分裝2.主要儀器：凈化工作臺SW-CJ-CO蘇州凈化設(shè)備有限公司高速冰凍離心機(jī)Mikro22RHettich高壓滅菌器SS-325TOMY常溫離心機(jī)5415DEppendorf純水系統(tǒng)和儲水罐Elix-5+30LTankMillporeMDF-382E型超低溫保存箱SANYOBio-Rad梯度PCR儀（1000-SeriesThermalCyclingPlanform）C1000TM美國Bio-Rad公司凝膠成像儀UniversalHoodⅡ美國Bio-Rad公司電泳儀PowerPacBasic美國Bio-Rad公司電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9240型上海一恒科學(xué)儀器公司恒溫振蕩器THZ-82A常州國華電子儀器有限公司數(shù)顯式恒溫水浴鍋YLE-2000上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠移液器（ResearchFamily）Eppendorf核酸蛋白質(zhì)濃度測定儀NanovueGEHaeltthcare電子分析天平BSA124S制冰機(jī)IMS-130微波爐EG0252C7-NSH漩渦混勻器2012-01電冰箱海爾BCD-186KB（三）總RNA提取取藥材甲30頭，放于滅菌的研缽中，液氮速凍后迅速研碎，然后加入1mlTRIzol（Invitrogen），待試劑融化后用移液槍充分混勻，后續(xù)步驟參照TRIzolIsolationReagent試劑盒說明書進(jìn)行。最終檢測RNA的完整性，最終選擇質(zhì)量較好的RNA樣品置于-80oC冰箱保存?zhèn)溆谩＃ㄋ模┗蚪MDNA的去除參照RQ1RNase-FreeDNase試劑盒（Promega）的說明書進(jìn)行，具體步驟如下：①在200μL無RNA酶的PCR管中配制下列混合液；試劑（Reagent）體積（Volume）（μL）TotalRNA（1μg/μL）2.0RQ1RNase-FreeDNase10×ReactionBuffer1.0RQ1RNase-FreeDNase（1U/μg）2.0RNase-freeH2O補(bǔ)至10.0②將上述反應(yīng)液置于PCR儀中，37°C孵育30min；③加入1μLStopSolution終止反應(yīng)，65°C孵育10min，4°C保存。將去除基因組DNA的RNA置于-80°C冰箱中保存?zhèn)溆谩＃ㄎ澹┓崔D(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈第一鏈cDNA主要用于基因片段的擴(kuò)增，按照PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit試劑盒（TaKaRa）的說明書進(jìn)行合成。RT反應(yīng)體系（反應(yīng)在液的配制在冰上進(jìn)行）：試劑體積（μL）5×PrimeSciptTMBuffer（forRealTime）2.0PrimeSciptTMREEnzymeMxI0.5Random6mers（100μm）0.5TotalRNAX（總量不超過500ng）反轉(zhuǎn)錄條件：37oC15min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）和85oC5s(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))（六）PCR引物設(shè)計1.引物設(shè)計根據(jù)藥材甲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中CPR基因的部分序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計1對特異性引物（表2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得CPR基因。2.PCR反應(yīng)體系為PCR反應(yīng)體系：(如表2)反轉(zhuǎn)錄條件：37oC15min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）和85oC5s(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))試劑（Reagent）體積（Volume）（μL）ddH2O14.510×PCRBuffer2.5Mgcl2(mM)2.5ForwardPrimer（10μM/L）ReversePrimer（10μM/L）1.01.0dNTPMixture()2.0cDNAtemplate1.0Taq酶0.25PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸時間由擴(kuò)增的目的片段長度決定（1kb/min），共34個循環(huán)；最后72℃延伸10min。（七）PCR產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化、測序PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳于凝膠成像儀檢測，對我們所需要的目的條帶使用膠回收盒Wizard?SVGelandPCRClean-UpSystem（Promega）進(jìn)行回收純化，將回收產(chǎn)物與pGEMeq\o\ac(○,R)–TEasy載體（Promega）連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，藍(lán)色斑篩選，并進(jìn)行驗證；將陽性的克隆菌液送到Invitrogen公司測序。（八）藥材甲CPR基因的序列分析利用DNAMAN5.22（LynnonBioSoft）軟件對測序結(jié)果進(jìn)行編輯及序列，利用ClustalW軟件進(jìn)行序列多重比較，翻譯的氨基酸序列采用BLAST（/BLAST/）軟件進(jìn)行同源性比較和保守區(qū)域的分析。NCBI站點的ORFFinder（/gorf/gorf.html）查找開放閱讀框，MEGA5.04軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，各分支都需要進(jìn)行1000次的重復(fù)檢驗。利用ProtParam（/tools/protparam.html）預(yù)測蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，NetNGlyc1.0server預(yù)測N-糖基化位點，TMHMMv2.0和SignalP4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測蛋白質(zhì)的信號肽和跨膜區(qū)域。結(jié)果與分析（一）藥材甲CPR基因的序列分析CPR基因的開放閱讀框長度為2070bp，編碼690個氨基酸。通過ProtParam軟件在線分析，CPR基因推導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子式為C3510H5449N941O1068S27，理論分子量為78784.1kDa，等電點為5.43，在氨基酸組成方面：精氨酸Leu含量較高，占9%；其次是谷氨酸Glu，占8.6%；最少的是色氨酸Trp，僅占1.2%。帶負(fù)電荷的總殘基（Asp+Glu）為102；總的帶正電荷的殘基（Arg+Lys），為83。N-端氨基酸為蛋氨酸（Met，M）為穩(wěn)定型氨基酸，蛋白質(zhì)半衰期為30小時，不穩(wěn)定性指數(shù)未46.66，為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。脂肪指數(shù)為77.45，親水性指數(shù)-0.503。根據(jù)SignalP4.1Server軟件發(fā)現(xiàn)該蛋白在N-末端無信號肽；利用NetNGlyc1.0Server軟件對該蛋白進(jìn)行預(yù)測，顯示其存在1個潛在的N-糖基化位點，分別為N189；利用TMHMMServer.v.2.0軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)段預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有跨膜區(qū)段。將該基因的氨基酸序列進(jìn)行BlastP分析，結(jié)果顯示CPR與赤擬谷盜Triboliumcastaneum(XP-9711742)具有最高的相似性，為81%；地中海實蠅Ceratitiscapitata（XP-004523898）具有高度的相似性，為72%；與中歐山松大小蠹Dendroctonusponderosae（AF145002）具有高度的相似性。通過對藥材甲CPR基因的氨基酸序列與其他昆蟲CPR氨基酸序列進(jìn)行多重對比分析，結(jié)果表明，它們均具有保守的結(jié)構(gòu)域，且具有較高的同源性。（二）CPR基因的系統(tǒng)發(fā)育分析從系統(tǒng)發(fā)育樹上可以看出CPR基因與地中海實蠅Ceratitiscapitata、中歐山松大小蠹Dendroctonusponderosae的CPR基因具有較近的親緣關(guān)系，且與赤擬谷盜Triboliumcastaneum的基因位于同一進(jìn)化枝上，該結(jié)果與Blast同源性分析的結(jié)果相吻合[5]。三、討論（一）NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶(CPR)的結(jié)構(gòu)與功能哺乳動物中存在兩個以FMN和FAD為輔酶的氧化還原酶，一個是NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶(CPR)，另一個為氮氧化合成酶(NOS)。CPR含有兩個功能域疏水N端膜結(jié)合域和含有數(shù)個結(jié)構(gòu)域的親水C端催化域。疏水N端膜結(jié)合域大小為6kDa，功能是讓蛋白分子錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜上，維持CPR的空間構(gòu)象，確保電子的順利傳遞。親水C端催化域大小為72kDa，是CPR參與催化反應(yīng)的主要部位[5]。本研究克隆的藥材甲Ha-CPR基因的推導(dǎo)氨基酸序列具有CPR的典型結(jié)構(gòu)域，如FMN結(jié)合域、FAD和NADPH結(jié)合域，并且與其它昆蟲的CPR具有很高的同源性，從系統(tǒng)發(fā)育樹可以得出藥材甲的CPR基因與赤擬谷盜TriboliumcastaneumCPR具有最高的相似性，為81%。目前有關(guān)的報道指出CPR在細(xì)胞色素C和細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的內(nèi)源化合物與外源化合物的代謝反應(yīng)中起著重要的作用。本研究從藥材甲中克隆出CPR基因全長cDNA序列，為研究藥材甲基因的結(jié)構(gòu)及其在細(xì)胞P450酶系中的作用方式及其在藥材甲生長發(fā)育和藥物代謝方面的作用提供了重要依據(jù)及啟示。（二）藥材甲NADPH-細(xì)胞色素還原酶(CPR)的表達(dá)情況早期的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素P450酶系所介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)一般發(fā)生在昆蟲的中腸、脂肪體、馬氏管及觸角中。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450、細(xì)胞色素b5和CPR在藥材甲的近側(cè)小腸、馬氏管和脂肪體中均表現(xiàn)出組成型過量表達(dá)，并推測這些組織可能與殺蟲劑代謝有關(guān)。Carino等(1994)在家蠅抗性品系的腸、脂肪體中發(fā)現(xiàn)CYP6A1有組成型過量表達(dá)。Li等(2003)用在研究果蠅基因時發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450在中腸有大量表達(dá)。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示CPR在果蠅Drosopkilamelanogaster觸角中有大量表達(dá),。迄今為止，細(xì)胞P450基因在藥材甲的體內(nèi)分布及表達(dá)情況基本明確，但是起限速作用的基因在藥材甲的分布及表達(dá)情況尚不明朗，因而研究CPR基因在藥材甲體內(nèi)的分布及表達(dá)情況，對更好的了解解毒代謝作用有十分重要的意義。（三）NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶(CPR)與昆蟲代謝抗性NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶(CPR)是細(xì)胞色素P450酶系的主要組成部分，在細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)中，CPR起到了限速的作用。通過對昆蟲代謝抗性機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，由細(xì)胞色素P450所介導(dǎo)的代謝抗性一般都是由多個基因介導(dǎo)的，而己知與抗性相關(guān)的細(xì)胞色素P450基因數(shù)目繁多，因此給昆蟲代謝抗性的作用機(jī)制研究帶來了一定障礙。Lycett等通過RNAi技術(shù)對特異性沉默的CPR基因在岡比亞按蚊（Anophelesgambiae）特定細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蟲體對氯菊酯的敏感性提高，進(jìn)而說明中腸細(xì)胞色素P450酶系在擬除蟲菊酯類殺蟲劑的代謝過程中起關(guān)鍵性作用，研究指出細(xì)胞色素P450氧化還原酶與殺蟲劑的解毒代謝相關(guān)，而在擬除蟲菊酷類殺蟲劑的解毒代謝中細(xì)胞P450氧化還原酶起主要作用。通過向藥材甲幼蟲和蛹分別進(jìn)行喂食和注射Ha-CPRdsRNA的方法，抑制Ha-CPR基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞色素P450氧化還原酶解毒代謝反應(yīng)的發(fā)生。通過觀察基因沉默后藥材甲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑以及模式底物的代謝情況，達(dá)到研究CPR及細(xì)胞色素P450氧化還原酶的功能。研究發(fā)現(xiàn)，通過兩種方法向蟲體內(nèi)導(dǎo)入Ha-CPRdsRNA后，Ha-CPR基因的mRNA表達(dá)量均有所回落。由于試蟲個體間生理狀態(tài)、喂食(注射）過程以及試蟲dsRNA吸收程度的不同，避不了造成不同重復(fù)間存在干擾效率差異的現(xiàn)象。（四）NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶(CPR)與昆蟲生長發(fā)育相關(guān)研究表明NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶(CPR)不僅能夠參與細(xì)胞色素P450所介導(dǎo)的解毒代謝反應(yīng)，還能夠參與生物體生長發(fā)育過程中某些物質(zhì)的合成，進(jìn)一步影響了生物體的生長發(fā)育狀況。因此本研究還對CPR基因沉默后對藥材甲的生長發(fā)育進(jìn)行了觀察和記錄。當(dāng)向藥材甲喂食Ha-CPRdsRNA后，Ha-CPR基因的表達(dá)量下降很多，Ha-CPR基因?qū)λ幉募咨L發(fā)育有延緩發(fā)育的作用。故此推測Ha-CPR基因可能參與藥材甲生長過程中某些物質(zhì)的合成。從Ha-CPR基因沉默后藥材甲的整個生長發(fā)育來看，盡管Ha-CPR基因表達(dá)量為正常發(fā)育的一半，但對藥材甲生長發(fā)育的影響效果卻并不明顯，產(chǎn)生這種結(jié)果的原因是CPR在藥材甲生長發(fā)育過程僅僅需要較少量的表達(dá)就能完成正常的生理活動，還是在生長發(fā)育中有其它的相關(guān)調(diào)控，都待我們進(jìn)一步的探索。第三章參考文獻(xiàn)[1]丁天波.柑橘全爪螨細(xì)胞色素P450及其相關(guān)基因的鑒定和表達(dá)模式研究[J].農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治.201