北京化工大學第八屆“萌芽杯”參賽作品—A類北京化工大學第八屆“萌芽杯”參賽作品—A類作品名稱：用于基因治療的納米二氧化硅材料的合成與制備類別（綜述類/實驗類）：實驗類指導教師：負責人：聯系方式：年月日目錄21799目錄 327536第1章實驗原理部分 528419第1.1節納米二氧化硅的合成 511220第1.2節聚合物合成 636701.2.1硅烷偶聯劑原理 642551.2.2ATRP（原子轉移自由基聚合）反應 728230第2章實驗部分 816895第2.1節實驗試劑與器材 8292422.1.1實驗試劑 8192042.1.2實驗器材 92942.1.3表征儀器 926222第2.2節實驗步驟 910182.2.1制備二氧化硅納米球 9219762.2.2用二氧化硅納米球進行ATRP反應合成聚合物 9267952.2.3制備二氧化硅納米螺旋管 9161572.2.4用螺旋管進行ATRP反應合成聚合物 922135第3章結果與討論 1010765第3.1節表面活性劑模板法合成納米二氧化硅 10259333.1.1二氧化硅納米球的合成 10186093.1.2二氧化硅螺旋管的合成 1131113第3.2節聚合物的合成 1118085結論 1111866致謝 11用于基因治療的納米二氧化硅材料的合成與制備摘要：本實驗采用表面活性劑模板法，以正硅酸四乙酯（TEOS）為硅源，和表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）作用，成功合成出二氧化硅納米球，并進行表面改性，再進行原子轉移自由基聚合（ATRP）陽離子多聚物，并作為基因表達載體，可用于基因治療。在三嵌段共聚物F127和陽離子型表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）復配體系中，以HCl作為催化劑，利用TEOS作為硅源進行水解合成了螺旋狀中孔SiO2，并初步探究F127、CTAB、HCl和TEOS的濃度對產物的形貌的影響。關鍵詞：納米二氧化硅材料；表面活性劑；原子轉移自由基聚合；硅烷偶聯劑；基因載體引言：納米技術是21世紀發展起來的新學科，由于納米材料尺寸介于1—1000nm，十分小，因此具有獨特表面、界面效應，使它廣泛運用到各領域[1]。在生物工程領域，由于人體細胞直徑一般在20μm-30μm范圍內，細胞核一般為7μm。因此若以納米材料構建目的基因載體，并導入細胞細胞核將擁有良好的生物相容性。基因載體有很多種，可分為病毒載體和非病毒載體，其中非病毒載體安全性好，但其效率差，但是靶向性的脂質體、靶向性的多聚物，以及脂質/多聚物/DNA復合物等新產品的出現，結合電脈沖、超聲等新技術，明顯提高了導入效率和靶向性，成為重要的發展方向[2]。陽離子多聚物是一種重要的非病毒載體。由于DNA帶負電，利用帶正電荷的多聚物與DNA之間的電荷相互作用，與DNA形成穩定的多聚復合物，使得DNA不易被核酸酶降解。可通過跑膠等實驗來檢驗聚合效果。形成的多聚復合物可與細胞表面帶負電的受體結合，從而有效地被內吞攝入介導基因轉移[3]。本實驗將采用ATRP（原子轉移自由基聚合）反應對SiO2表面進行修飾，接枝上陽離子多聚物，從而成為基因載體。正文實驗原理部分 第1.1節納米二氧化硅的合成目前納米材料的制備方法有很多,依據制備過程中反應物料狀態可分為固相法液相法和氣相法三大類,也可以根據是否發生化學反應分為物理和化學方法兩大類。模板合成法是一種新發展起來的納米結構材料的制備方法[4]。模板法又可分為硬模板法和軟模板法。而表面活性劑模板法也叫微乳液法,這是納米材料合成中應用十分廣泛的一種方法，特別是應用于合成介孔納米材料[5]。本實驗就是采用表面活性劑模板法合成介孔納米二氧化硅材料。實驗原理如圖1-1。本實驗采用的硅源是TEOS（正硅酸四乙酯），使用的表面活性劑是CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）。首先TEOS水解成硅酸鹽，然后在該體系中帶負電的硅酸鹽與陽離子型表面活性劑CTAB之間通過靜電作用形成自組裝硅酸鹽膠束，在NaOH環境下便可得到了六方中孔SiO2納米球。在氨水環境下，添加表面活性劑F127（PEO基三嵌段共聚物EO106PO70EO106）可得到六方中孔SiO2納米棒，當氨水濃度降低，也可得到六方中孔SiO2納米球。其中氨水作用是調控硅酸鹽納米膠束的長度。F127僅在控制產物的形貌方面起作用，非離子型表面活性劑F127圍繞在SiO2和CTAB共組合體的周圍使產物軸徑比變小[6、7]。圖1-1表面活性劑法合成納米二氧化硅的機理圖當將環境改成HCl時，加入F127，便可生成螺旋狀的納米顆粒[8]。第1.2節聚合物合成1.2.1硅烷偶聯劑原理偶聯劑是目前應用最廣泛的表面改性劑。硅烷偶聯劑是最具代表性的偶聯劑，它對表面具有羥基的無機粒子最有效，非常適合納米SiO2的表面改性[9]。硅烷偶聯劑可在無機材料和有機材料的界面之間架起“分子橋”，能把兩種性質懸殊的材料連接起來。其通式為：Y-R-SiX3。其中Y是可以和有機化合物起反應的基團，如：乙烯基、氨基、環氧基、疏基等。R是短鏈烷撐基，起到連接Y和Si的作用。X是可進行水解并生成Si-OH的基團，如烷氧基、乙酰氧基、鹵素等[10]。由于SiO2表面是含有大量羥基的，可與硅烷偶聯劑X部分反應[11]。本實驗采用的硅烷偶聯劑為KH-550（氨丙基三乙氧基硅烷HN3-(CH2)3-Si-(OC2H5)3）,其反應機理如圖1-2所示。圖1-2KH-550對納米二氧化硅表面改性機理1.2.2ATRP（原子轉移自由基聚合）反應ATRP反應以簡單的有機鹵化物為引發劑，以過渡金屬配合物為鹵原子載體，通過氧化還原反應，在活性種與休眠種之間建立可逆的動態平衡，從而實現對聚合反應的控制。其機理如圖1-3所示。圖1-3ATRP反應機理圖過渡金屬化合物通過氧化還原過程從有機鹵化物“提取”鹵原子，產生氧化物種和自由基R·。接著自由基R·和烯烴M反應，生成自由基R—M·，即為活性種。R—M·與反應，得到目標產物R—M—x，同時過渡金屬被還原為，可以再次引發新輪的反應。由／催化的氧化還原過程，能使體系有效地保持一個很低的自由基濃度，從而大大減少自由基間的終止反應。聚合物鹵化物可與進行原子轉移反應，生成有引發活性的自由基·也為活性種，·進行鏈增長反應，生成新的自由基·，再和反應生成相應的鹵化物，而鹵化物則不能和單體發生增長反應，這就是ATRP的反應機理[12-15]。本實驗用的為CuBr與BPY（2，2-聯吡啶）的絡合物，烯烴M為DMAEWA(H2C=C(CH3)-COO-CH(CH3)-N(CH3)2)。要在二氧化硅表面進行ATRP反應，就要先在二氧化硅表面先接上溴，用來作引發劑。本實驗通過硅烷偶聯劑KH550（氨丙基三乙氧基硅烷），已經在SiO2表面接上氨基生成SiO2-NH3，SiO2-NH3中的氨基再和BIBB（2-溴異丁酰溴）的酰溴發生親核取代反應，脫去HBr,生成SiO2-Br，即使SiO2表面接上溴了[16]。然后再進行ATRP反應。其反應過程如圖1-4所示。圖1-4聚合物合成過程示意圖第2章實驗部分第2.1節實驗試劑與器材2.1.1實驗試劑CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）：SIGMA；F127（PEO基三嵌段共聚物EO106PO70EO106）：SIGMA；TEOS（正硅酸四乙酯）：98%，薩思化學技術（上海）有限公司；NaOH（分析純，不少于96.0%）:北京化工廠；濃鹽酸（36.0%-38.0%）：北京益利精細化學品有限公司；溴化亞銅（CuBr）：99%，AlfaAesar；甲醇：99.5%，北京現代東方精細化學品有限公司（北京現代東方）；BIBB（2-溴異丁酰溴）：96%，梯希愛(上海）化成工業發展有限公司；KH550（氨丙基三乙氧基硅烷）：安耐吉；甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯（DMAEMA）：98+%，梯希愛(上海）化成工業發展有限公司；實驗用水為去離子水。2.1.2實驗器材50mL燒杯，250mL燒瓶，移液槍（20-200μL,100-1000μL,1-5mL），稱量紙，離心管，振蕩器，鼓風干燥箱，馬弗爐，氮氣瓶電子天平：AL104、PL203型，梅特勒-托科多儀器（上海）有限公司集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101K，鄭州恒巖儀器有限公司離心機：3K15型，SIGMA冷凍干燥機：LGJ-12型，北京松源華興科技發展有限公司落射熒光顯微鏡:XSY-1型,重慶光學儀器廠2.1.3表征儀器SEM（掃描電鏡），TEM(透射電鏡），HRTEM(高分辨透射電鏡)，XRD（X射線衍射）第2.2節實驗步驟2.2.1制備二氧化硅納米球分別稱取適量的CTAB、水、NaOH及TEOS組成反應液（c（CTAB）=5.62mM；c（NaOH）=14mM；c（TEOS）=0.046mM）。恒溫50℃，不斷攪拌，反應2h。反應結束后，離心三遍，轉速3000r/min，每次20min。2.2.2用二氧化硅納米球進行ATRP反應合成聚合物以乙醇和水為溶劑，加入適量納米SiO2球，再加入300μLKH550。反應12h。然后130℃固化3h。取適量的SiO2-NH3，溶于二氯甲烷溶劑中，加入等量的BIBB和三乙胺，反應3h，再用水與甲醇洗三次，然后真空干燥。（3）量取3mL水、2mL甲醇、2mLDMAEMA，加入適量的SiO2-Br再一質量比為2:1加入BPY和溴化亞銅，再加入溴化亞銅前先排氣10min，再在30℃下反應20分鐘。反應后，透析，凍干。2.2.3制備二氧化硅納米螺旋管分別稱取適量的CTAB、水、F127 、鹽酸，依次加入燒瓶內，恒溫攪拌均勻，再加入TEOS，攪拌10s，恒溫反應8h。反應結束后，離心三遍，轉速3000r/min,每次5min。在60℃下干燥。共做了六組。CTAB濃度F127濃度HCl濃度TEOS濃度備注方案一17.5mM0.391mM1.68M67mM+20%F127方案二17.5mM0.32mM1.68M67mM文獻值方案三17.5mM0.352mM1.68M67mM+5%F127方案四17.5mM0.336mM1.68M67mM+10%F127方案五8.25mM0.176mM1.68M33.5mM相對于方案三CTAB、F127、TEOS減半方案六13.13mM0.264mM1.68M50.3mM相對于方案三CTAB、F127、TEOS降為75%2.2.4用螺旋管進行ATRP反應合成聚合物未完待續…結果與討論第3.1節表面活性劑模板法合成納米二氧化硅1.1二氧化硅納米球的合成在實驗條件正確合成了SiO2納米球，其掃描電鏡圖像如圖3-1（a）所示，透射電鏡圖像如3-1（b）所示。由圖可知納米球平均半徑約100nm左右。由HRTEM圖（圖3-2）中顯示產物具有有序中孔結構。（a）（b）圖3-1二氧化硅納米球SEM（a）及TEM（b）圖像圖3-2二氧化硅納米球HRTEM圖像從小角XLD圖中出現很明顯的（100）、（110）和（200）衍射峰，對應的平均孔徑約為3.32nm，表明產物具有高度有序的二維六方中孔結構。圖3-3二氧化硅納米球小角XRD圖1.2二氧化硅螺旋管的合成我們先進行方案一和方案二探究實驗生成產物的濃度，結果并不理想，方案一產物為大量囊泡狀物體，方案二為少量大徑螺旋管伴有大量不規則物體。于是在方案二的基礎上依次增加F127濃度進行了方案三和方案四實驗。發現方案三較為理想，通過采用掃描電鏡與透射電鏡的表征發現，方案三合成出了螺旋管狀的納米SiO2，其SEM圖與TEM圖如圖3-4與3-5所示。圖3-4納米二氧化硅螺旋管SEM圖圖3-5納米二氧化硅螺旋管TEM圖正如圖3-4與3-5所示，我們合成的中孔螺旋管直徑較大，且形貌具有多樣性，以此為了獲得更好的螺旋管，我們將所有濃度都減少進行方案五、方案六實驗，產物中雖然螺旋管直徑減小，但只制得了極少數量，總體卻未能達到預期效果。第3.2節聚合物的合成2.1聚合物載體與DNA結合實驗——跑膠通過ATRP反應合成聚合物后，用聚合物進行與DNA結合性測試。N/P00.511.522.533.5DNA/μL22222222聚合物/μL01234567水/μL181716151413121跑膠實驗[17]圖形如圖3-6所示。電泳過程中，自由的質粒DNA由于電壓的作用會在凝膠中遷移（跑道1），由于DNA受到聚合物的靜電吸附作用，隨著N/P比值的升高，DNA的遷移運動受到束縛，因而導致熒光帶依次變短。這很好的證明了，我們合成的聚合物與DNA的結合能力很好。圖3-6跑膠實驗圖像3.2.2細胞轉染實驗將轉染聚合物與DNA多聚物24h、36h后的細胞置熒光顯微鏡下觀察,如圖3-7與圖3-8可見細胞有綠色熒光表達。圖3-7轉染24h后熒光觀察圖圖3-8轉染36h后熒光觀察圖在熒光顯微鏡下計數表達綠色熒光蛋白的細胞,計算得到該種細胞占總細胞的百分比,24h和36h表達綠色熒光蛋白的細胞百分數分別為(17.5±0.9)%和(14.6±1.1)%。時間較長的表達綠色熒光蛋白的細胞百分數反而減少，所以該聚合物也許對細胞有一定毒害作用，因此基因載體還需改進。結論（1）在單一表面活性劑CTAB調控下，以TEOS為硅源，可準確合成出介孔六方SiO2納米球。再通過對二氧化硅表面的改性處理，通過ATRP反應成功合成了陽離子多聚物基因載體，并且與DNA結合性良好。但在細胞轉染實驗中，轉染率較低，并且還顯示出對細胞有一定的毒害作用，使聚合物作為基因載體不夠完美。接下來實驗中我們可以通過在聚合物上再接一些生物相容性較好的有機基團，使其毒性降低。（2）在表面活性劑CTAB與F127復配體系中，以TEOS為硅源，可以合成出SiO2納米螺旋管，但是我們實驗中合成出的納米管大小不一，粗細不均，形貌多樣，難以控制，接下來我們將通過改變各反應物的用量來改進實驗，以求獲得更好的螺旋管。之后再用它們合成基因載體并用于基因治療。我們猜測，由于DNA具有雙螺旋結構，因此用螺旋管作基因載體將更加有利。致謝首先我們要特別感謝徐福建教授及趙娜娜副教授給予我們這次走進實驗室的機會，其次感謝林心怡師姐和胡浩師兄對我們的悉心指導。通過本次參加萌芽杯，我們在探索中學會獨立思考和運用已經學到的專業基礎知識，鍛煉了我們的邏輯思維能力和實驗設計能力，我們深刻認識到：我們真的很弱，要學將永無止境，實驗也遠遠沒有想象中那么簡單，需要反復探究總結。最后，再次感謝科技樓918的全體老師及師兄師姐們半年來對我們幫助及照顧。參考文獻：[1]許蘭偉，劉執玉，納米生物材料在臨床基因治療中的應用前景[J].解剖科學進展，2006,12(4):348-351.[2]鄧洪新，田聆，魏于全，基因治療的發展現狀、問題和展望[J].生命科學，2005,17（3）：196-199.[3]張夏華，吳廣通，李蓉，基因治療現狀與前景[J].藥學實踐雜志，2009,27(1):4-10,42.[4]逢麗，高善民，納米材料的模板法合成進展[J].過程工程學報，2004,4（增刊）：431-437.[5]王秀麗，曾永飛，卜顯和，模板法合成納米結構材料[J].化學通報，2005，（10）：723-730.[6]QiangCai,Zhong-Sh