第二章基因工程與藥物蛋白生產

GeneticEngineeringinMedicineandIndustry第二章基因工程與藥物蛋白生產

GeneticEngineeSometherapeuticproductsforusedinhumansSometherapeuticproductsforGenentech公司1976年，27歲的風險投資人RobertSwanson與UniversityofCalifornia的教授HerbBoyer共飲了幾杯啤酒，討論了基因工程技術的商業前景。討論結束時，他們決定建立一個公司，并取名為Genentech（GeneticEngineeringTechnology）。第一個基因工程公司在學術界和商業界的滿腹懷疑中誕生了！Genentech公司1976年，27歲的風險投資人RobGenentech的驕人業績1976Genentech創立1977首次在微生物里生產了人蛋白生長激素抑制素1978克隆了人胰島素基因1979克隆了人生長激素素基因1980公司上市，募集$35million1982第一個基因重組藥（人胰島素）上市（轉讓給Lilly公司）1984第一個VIII因子，轉讓給CutterBiological1985第一個自己生產的產品（人生長激素）1987生產組織纖溶酶原激活劑（tPA）1990生產interferon1

1990與瑞士Roche醫藥公司合并（$2.1billion）Genentech的驕人業績1976Genentech創立1美國已批準上市的基因工程藥物（1997.7）中文名稱商品名稱英文名縮寫開發公司胰島素HumulinNovolinHumalogInsulinlispoinsulinLillyNovoNordiskLilly人生長激素ProtropinHumatropeNutropinAQrhuGHGenentechLillyGenentech干擾素IntronAReferonAAvonixBetaseronActimmuneAlferon-NrhuIFNa2brhuIFNa2arhuIFN

rhuIFN1brhuIFN1brhuIFNa3ScheringRocheBiogenChironGenentechInterferonScience美國已批準上市的基因工程藥物（1997.7）中文名稱商品名稱白細胞介素2ProleukinrhuIL2Chiron粒細胞集落刺激因子NeupogenrhuG-CSFAmgen粒細胞巨噬細胞集落刺激因子LeukinerhuGM-GSFImmunex紅細胞生成素EpogenProcritrhuEPOAmgenOrtho組織溶纖原激活劑ActivaserhuTPAGenentech生長激素SerostinsomatotropinSerono促生長素NutropinSaizenGenotropinNorditropinBio-TropinsomatopinGenentechSeronoPharma/UpjohnNovoNordiskBiotechGeneral白細胞介素2ProleukinrhuIL2Chiron粒細胞抗血友病因子VIIIKogenateRecombinateFactorVIIIBayerBaxter葡萄腦苷脂酶CerezymeglucocerebrosidaseGenzyml脫氧核糖核酸酶PulmozymedomaseGenentech乙型肝炎疫苗RecombivaxHBEngerixBComraxHepatitisBvaccineMerckSmithKlineMerck甲型肝炎疫苗HavrixHepatitisBvaccineSmithKline抗血友病因子VIIIKogenateFactorVIII體內用單克隆抗體ReoproOrthoOKT-3OncoScintCR/OVOncoScintOC103OncoScintCR103ProstascintMAB,bloodclotsMAB,KidneysupMAB,diaginjectCentocorOrthoBiotechCytogenCytogenCytogenCytogen鼠單克隆抗體PanorexMurineMABGlaxoWelcome1體內用單克隆抗體ReoproMAB,bloodclots中國已經批準上市的基因工程藥物（1998.5）藥品名縮寫開發生產公司批準時間適應癥rhuINFa1b(外用）rhuINFa1brhuINFa2a長春生研所上海生研所深圳興科長春生研所長生藥業三生藥業1989試1996正1996正1996正1997正1997正病毒性角膜炎HBV,HCVHBV,HCV尖銳濕疣，皰疹等HBV,HCVHBV,HCVrhuIFNa2b新大洲藥業里亞哈爾華立達安科華新1997正1996正1997正1997試1997試HBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVHBV,HCV中國已經批準上市的基因工程藥物（1998.5）藥品名縮寫開發rhuINF

上海生研所克隆麗珠生物工程1994試1995試1995試類風濕類風濕類風濕rhuIL2長春生研所長春藥業四環制藥華新三生藥業深圳興科中華合通金絲利康利制藥1997正1997正1997正1997正1997正1997正1995試1995試1995試癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療癌輔助治療rhuINF上海生研所1994試類風濕rhuIL2rhuG-CSF九源1997試化療生白血病rhuGM-CSF特寶1997試化療生白血病rSK醫大實業1996試心梗溶栓rhuEPO華欣永銘維沃1997試1997試再生障礙性貧血再生障礙性貧血bFGF（外用）珠海東大1996試創傷，燒傷rhuG-CSF九源1997試化療生白血病rhuGM-CSF一、基因工程與醫藥衛生1、生產基因工程藥品

（1）傳統的某些藥品（如動物激素）生產：控制某種物質合成基因轉基因“工程菌”基因工程藥品基因表達產物基因工程發酵分離提取從動物組織中提取，生產量小，價格昂貴。（3）基因工程生產的藥品重組人生長激素重組人白細胞介素重組人干擾素重組人胰島素發酵罐（2）基因工程方法生產藥品的方法：一、基因工程與醫藥衛生1、生產基因工程藥品控制某種物質合成基1313二、基因工程菌大腸桿菌表達系統一：大腸桿菌表達外源基因的優勢二大腸桿菌表達載體的基本組成三常用的大腸桿菌表達載體四真核基因在大腸桿菌中的表達五大腸桿菌表達真核基因存在的問題六基因工程菌遺傳不穩定性的表現與機制七.人胰島素的生產方法二、基因工程菌大腸桿菌表達系統一：大腸桿菌表達外源基因的優勢一：大腸桿菌表達外源基因的優勢全基因組測序,共有4405個開放型閱讀框架基因克隆表達系統成熟繁殖迅速、培養簡單、操作方便、遺傳穩定被美國FDA批準為安全的基因工程受體生物大腸桿菌表達外源基因的劣勢缺乏對真核生物蛋白質的復性功能缺乏對真核生物蛋白質的修飾加工系統內源性蛋白酶降解空間構象不正確的異源蛋白細胞周質內含有種類繁多的內毒素(endotoxin)periplasmheterogous一：大腸桿菌表達外源基因的優勢大腸桿菌表達外源基因的劣勢pe二大腸桿菌表達載體的基本組成一個良好的大腸桿菌表達載體：有抗菌素抗性基因決定載體拷貝數的復制起點(ori)供外源基因插入的多克隆位點。參與控制轉錄與翻譯的必不可少的原件外源基因在原核寄主細胞中表達,它的編碼結構必須是連續的,不間斷的,處于寄主啟動子有效控制下。二大腸桿菌表達載體的基本組成一個良好的大腸桿菌表達載體：外1啟動子可使外源基因高水平表達的最佳啟動子必須具備以下幾個條件1)強啟動子，外源基因的蛋白質的表達量占細胞總蛋白的10%-30%以上2)應能呈現出一種低限的基礎轉錄水平3)應該是誘導型的,能通過簡單的方式,使用廉價的誘導物得以誘導。Accountforinducible1啟動子Accountforinducibleb:如果在啟動子的上游部位放置一個有效的轉錄終止子,那么由該啟動子驅動的克隆基因的轉錄便會被限制在最低本底水平。2終止子

a

:如果在克隆基因編碼區的3末端之后，接上一個有效的轉錄終止子，便能夠阻止轉錄通讀過位于下游另一個啟動子

c:轉錄終止子還能增強mRNA分子的穩定性,大大提高蛋白質產物水平。b:如果在啟動子的上游部位放置一個有效的轉錄終止子,那在構建大腸桿菌表達載體時，通常是添加全部終止密碼子,阻止核糖體跳躍(skipping)現象。大腸桿菌格外偏愛使用終止密碼子UAA,當其后連上一個U而形成四聯核苷酸的情況下,轉譯終止效率便會得到進一步加強。在構建大腸桿菌表達載體時，通常是添加全部終止密碼子,阻止3轉譯起始序列mRNA的5末端之獨特的結構特征,是決定mRNA轉譯起始效率的主要因素。在構建外源基因的高效表達載體時,需認真選擇有效的轉錄起始序列。未鑒定出通用有效的轉譯起始序列的保守結構initiationfactorconservedsequenceuniversial3轉譯起始序列mRNA的5末端之獨特的結構特征,是決定4、reportergene其編碼產物可被快速測定的功能單元。追蹤某些特定的DNA結構(重組質粒)是否已經導入寄主細胞同任何一種目的啟動子連接,其表達活性可作為檢測啟動子功能的依據。usageβ－半乳糖苷酶基因lacZ、堿性磷酸酶基因、熒光素酶基因(luciferase)基因、半乳糖激酶基因(galK)氯霉素抗性(乙酰轉移酶)基因(cat)四環素抗性基因(tetr)alkalinephosphatase4、reportergene其編碼產物可被快速測定的功能單三常用的大腸桿菌表達載體啟動子廣泛使用的大多數質粒表達載體啟動子λ噬菌體的PL啟動子大腸桿菌乳糖操縱子lac啟動子色氨酸操縱子trp啟動子pBR322質粒的beta－內酰胺酶啟動子LactoseOperon三常用的大腸桿菌表達載體啟動子廣泛使用的大多數質粒表達載體圖1-1在大腸桿菌中基因表達的3個重要信號啟動子核糖體結合位點基因終止子DNARNA轉錄核糖體結合mRNA位點圖1-1在大腸桿菌中基因表達的3個重要信號啟動子核糖圖1-2基因轉錄起始位點上游序列的比較TTGACATATAATPu>Py-35區-30-70正調控區-20負調控區+1-10區GC區….CAAT區TATAAATPuAPy-40-110+1-20-30增強子CCGCCC或GGGCGG或GGCCAATCTTA原核真核圖1-2基因轉錄起始位點上游序列的比較TTGACATATA圖1-3通過表達載體在大腸桿菌中被表達PRTTPRTPRmRNA蛋白質表達載體外源基因將外源基因插入限制性酶切位點轉化大腸桿菌圖1-3通過表達載體在大腸桿菌中被表達PRTTPRTPRm圖1-4雜交基因的構建和融合蛋白的合成PRTPRT插入外源基因｝ATATTA正確融合N端C端不正確融合外源基因不被翻譯表達ATATTA

GGAGCTGGAGC融合蛋白親和層析法純化化學試劑除去大腸桿菌肽段圖1-4雜交基因的構建和融合蛋白的合成PR圖1-5在大腸桿菌中表達外源基因長遇到的問題翻譯轉錄PRTT轉錄大腸桿菌不能切除內含子轉錄提前終止圖1-5在大腸桿菌中表達外源基因長遇到的問題翻譯轉錄P圖1-6真核細胞表達載體常用的4種啟動子P半乳糖轉錄GAL10P甲醇轉錄乙醇氧化酶基因（a）GAL啟動子（b）AOX啟動子（c）葡萄糖水解酶啟動子（d）纖維二糖水解酶啟動子P纖維素轉錄纖維素二糖水解酶基因P淀粉轉錄葡萄糖淀粉酶基因木糖不轉錄圖1-6真核細胞表達載體常用的4種啟動子P半乳糖轉錄GAL四真核基因在大腸桿菌中的表達三種表達部位各有不同的優缺點//

而且對克隆基因表達產物的制備有很大關系。在細胞質中表達在細胞周質中表達以分泌到細胞外的形式表達。1外源基因在大腸桿菌中表達蛋白質位置cytoplasmperiplasm四真核基因在大腸桿菌中的表達三種表達部位各有不同的優缺點1)細胞質中表達expressedincytoplasm包含體是存在于細胞質中的一種由不可溶性蛋白質聚集折疊而成的晶體結構。在表達中應盡可能限制包含體產生,并促進形成天然三維結構的蛋白質。多采用與分子伴侶共表達的方法,可能是增加外源蛋白的可溶性和折疊能力的一種有效途徑。insolublechaperon1)細胞質中表達expressedincytopl周質:指大腸桿菌一類G-菌中，位于內膜和外膜之間的細胞結構部分。在大腸桿菌中,已成功的使用了各種不同類型信號肽,將細胞質中蛋白的蛋白質轉運至周質。周質中表達外源蛋白質優點:A:周質中蛋白質種類少,周質中表達的外源蛋白質能夠被有效的濃縮和純化。b:周質氧化環境有利于蛋白質按正確的方式折疊c:在周質中蛋白質降解不廣泛。來自原核、真核的外源基因都成功的在大腸桿菌細胞周質中實現了有效表達。2)周質中表達expressedin

periplasm周質:指大腸桿菌一類G-菌中，位于內膜和外膜之間的細胞結3)分泌表達使在大腸桿菌中表達的外源蛋白質分泌到胞外培養基中進行分離純化,這種研究思路稱為外源蛋白質的分泌表達。3)分泌表達目的蛋白穩定性高:目的蛋白易于分離目的蛋白末端完整將外源基因與大腸桿菌信號肽編碼序列重組在一起進行分泌表達,其N端的甲硫氨酸殘基可在信號肽剪切過程中被有效除去這些真核基因在大腸桿菌中表達時,蛋白質甲硫氨酸殘基往往不能被切除。分泌表達優點

:重組人胰島素原若分泌到細胞周質中,其穩定性大約是在細胞質中的10倍許多真核生物成熟蛋白N端不含有甲硫氨酸殘基。intactexcise目的蛋白穩定性高:將外源基因與大腸桿菌信號肽編碼序列重組在一外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進行分泌型表達;外源基因分泌表達的表達率通常要比包涵體形式低很多分泌表達缺點相對其它生物細胞,大腸桿菌蛋白分泌機制不健全。目前產業化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌工程菌很少Perfectsound外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進行分泌型表達;分泌表達缺點分泌型重組蛋白具有較高比例正確構象，對蛋白酶不敏感蛋白質的分泌機制原核細胞周質中有多種分子伴侶,可阻止分泌蛋白隨機折疊分泌至細胞周質或培養基中重組蛋白很少形成分子間二硫鍵與包涵體相比randomSulferinnerouter分泌型重組蛋白具有較高比例正確構象，蛋白質的分泌機制原核細胞重組大腸桿菌--目的蛋白完全分泌分泌型目的蛋白表達系統構建有些G-能將細菌的抗菌蛋白（細菌素）分泌到培養基中,這一過程嚴格依賴于細菌素釋放蛋白

,它激活定位于內膜上的磷酸酯酶,導致細菌內外膜的通透性增大。將細菌素釋放蛋白編碼基因克隆在一個合適的質粒上攜帶大腸桿菌信號肽編碼序列和目的基因的表達質粒轉化受體細胞完全分泌型受體細胞轉化permeabilitybacteriocin重組大腸桿菌--目的蛋白完全分泌分泌型目的蛋白表達系統構建二種類型由報告基因編碼序列和另一個基因啟動子及其它的調節序列構成。用于研究啟動子功能及調控作用分子機理。由一種異源蛋白質基因編碼序列同寄主細胞誘導型啟動子構成。用于生產新型融和蛋白。2融和蛋白質表達將外源基因與受體菌自身的蛋白質編碼基因拼接在一起,并作為一個開放型閱讀框架進行表達。這種雜合基因表達出的蛋白質稱為融合蛋白。

2.1融和基因二種類型2融和蛋白質表達將外源基因與受體菌自身的蛋白質編attention外源基因應裝在受體蛋白編碼基因下游,為融合蛋白提供終止密碼子。在某些情況下,并不需要完整的受體結構基因2.2融和蛋白的表達策略融合蛋白表達質粒的構建原則受體細胞的結構基因能高效表達,且其表達產物可以通過親和層析進行特異性簡單純化兩個結構基因拼接位點處的序列設計十分重要,它直接決定融合蛋白的裂解。兩個蛋白編碼序列應保持一致的翻譯閱讀框架在DNA水平上，人工設計引入的蛋白酶切割位點或化學試劑特異性斷裂位點,可以在體外從純化的融合蛋白分子中釋放回收異源蛋白Baseonconsistentattention外源基因應裝在受體蛋白編碼基因下游,為使克隆外源基因有效轉譯有效轉譯：取決于核糖體的結合位點,

受到編碼區起點核苷酸序列影響。可使蛋白質產物穩定,免受寄主胞內酶的降解作用,因此可以得到較高的產率。可能構成一種信號肽指導大腸桿菌蛋白質分配到細胞的正確位置。能夠使用親和層析技術分離純化融合蛋白。2.3表達融合蛋白質的優點ribosome使克隆外源基因有效轉譯2.3表達融合蛋白質的優點ribos3整合型異源蛋白的表達工程菌在沒有選擇壓力存在下,可以連續培養而不丟失目的基因表達盒,

這對以改良物種遺傳性狀為目的的基因工程特別有意義3.1整合形式表達目的蛋白的特點目的基因穩定表達目的基因表達率低整合型的目的基因隨受體細胞染色體DNA一起復制,

在大多數情況下相當穩定單拷貝整合的目的基因表達率受到限制,此時可通過強化表達元件加以補償replicate/stabilitySpecies/improvementintensify3整合型異源蛋白的表達工程菌在沒有選擇壓力存在下,可以連轉位因子依賴型的體內重組同源序列依賴型的體內重組3.2DNA體內重組的基本原理轉位因子依賴型的體內重組同源序列依賴型的體內重組3.2D生物細胞內天然存在的一類無復制能力的DNA可移動因子,不同生物種群擁有結構不同的轉位因子噬菌體G片段(G-Fragment)原核微生物插入順序(IS)真核微生物轉座子(Tn、Ty)高等植物可移動因子(Ac、Ds)高等動物跳躍基因(mobilegene)轉位因子transposon轉位因子依賴型的體內重組生物細胞內天然存在的一類無復制能力的DNA可移動因子,噬轉位因子的結構transposonpalindromerepressorinversionregion轉位因子的結構transposonpalindromerep整合形式整合形式

同源整合同源序列依賴型的體內重組同源整合一般地說,距離越遠、長度越長、同源性越高,重組的頻率也就越高,反之亦然。同源整合

1基因結構存在很大差異。大多數真核基因含有內含子，細菌細胞中沒有除去內含子機制；五大腸桿菌表達真核基因存在的問題2轉錄信號不同。真核基因轉錄的mRNA分子不具有結合細菌核糖體所必須的SD序列。細菌RNA聚合酶不能識別真核生物啟動子3mRNA的分子結構有所差異。絕大多數真核mRNA分子的3末端有poly(A)尾巴，在5末端有一個帽結構。影響mRNA在細菌中的穩定性及與細菌核糖體相結合的能力，阻止正常的轉錄和轉譯。4真核生物的蛋白質有些是通過前體分子加工來的。在細菌中不存在這種修飾作用。5細菌的蛋白酶可以識別和降解真核生物的蛋白質產物1基因結構存在很大差異。大多數真核基因含有內含子，細菌細胞中結構不穩定性重組DNA分子上某一區域發生缺失、重排、修飾，導致其表觀生物學功能的喪失六基因工程菌遺傳不穩定性的表現與機制1工程菌遺傳不穩定性表現形式基因工程菌的遺傳不穩定性主要表現在重組質粒的不穩性,具有下列兩種表現形式分配不穩定性整個重組DNA分子從受體細胞中逃逸segregativeinstabilitydomainDeletionregionrearrange結構不穩定性六基因工程菌遺傳不穩定性的表現與機制1工程受體細胞中的限制修飾系統對外源重組DNA分子的降解2工程菌遺傳不穩定性的產生機制外源基因的高效表達嚴重干擾受體細胞正常的生長代謝能量、物質的匱乏和外源基因表達產物的毒性誘導受體細胞產生應激反應，關閉合成途徑，啟動降解重組質粒在受體細胞分裂時的不均勻分配是重組質粒逃逸的基本原因受體細胞中內源性的轉座元件促進重組分子的缺失重排Deletion受體細胞中的限制修飾系統對外源重組DNA分子的降解2工程以構建穩定性高質粒:

將R1質粒上的parB基因引入表達型載體中:其表達產物可以選擇性地殺死由于分配不均勻所產生的無質粒細胞3改進載體、受體系統正確設置載體上的多克隆位點:禁止DNA片段插在穩定區內將受體細胞的致死性基因安裝在載體上，并構建條件致死性的相應受體系統。

eg:大腸桿菌的ssb基因(DNA單鏈結合蛋白編碼基因)以構建穩定性高質粒:3改進載體、受體系統正確設置載體上根據載體上的抗藥性標記,向培養系統中添加相應的抗生素(藥物和食品生產時禁止使用抗生素)4施加選擇壓力根據載體上的營養缺陷型標記,向培養系統中添加相應的營養組份(培養基復雜,成本較高)correspond根據載體上的抗藥性標記,向培養系統中添加相應的抗生素(藥使用可控型啟動子控制目的基因定時表達及表達程度5控制目的基因過量表達使用可控型復制子控制質粒的定時增殖或降低質粒的拷貝數(優化基因工程菌的培養工藝)培養基組成:限制培養基比豐富培養基更有利于穩定培養溫度:較低培養溫度有利于重組質粒的穩定replicon使用可控型啟動子控制目的基因定時表達及表達程度5控制目的1982年,美國ElyLiLi公司首先使用重組大腸桿菌生產人胰島素,成為世界上第一個上市的基因工程藥物。1987年,Novo公司,成為世界上第一個上市的基因工程藥物。1987年,Novo公司又推出了利用重組酵母菌生產人胰島素的新工藝。七.人胰島素的生產方法基因工程法生產人胰島素體外胰島素受體結合性能、淋巴細胞和成纖維細胞的應答能力、降血糖作用、血漿藥代動力學等指標上均與天然胰島素沒有任何區別具有無免疫原性、注射吸收迅速。充分展示了基因工程在生物醫藥領域中的巨大潛力。potentialimmunogenic1982年,美國ElyLiLi公司首先使用重組大腸桿菌SHSHSHSHCCCC

COO_SHSHN

CCS.S.Pre-pro-insulinSSSSCCCC

COO_SSCCS-SPro-insulinNSSSSCCCCCOO_CCS

SS-SinsulinNSHSHSHSHCCC基因工程菌的構建戰略：化學合成A鏈和B鏈的編碼序列表達重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構建A鏈和B鏈分別表達法1synthesis基因工程菌的構建戰略：化學合成A鏈和B鏈的編碼序列表達重組人南農-生物技術制藥--第二章基因工程藥物課件由于A鏈和B鏈上共存在六個半胱氨酸殘基，體外二硫鍵的正確配對率較低,通常只有10%-20%.采用這條工藝路線生產正確配對率較低,采用這條工藝路線生產的重組人胰島素每克成本高達100美元以上。A鏈和B鏈分別表達法生產技術評價為了進一步降低生產成本,美國ElyLiLi公司隨后又建立了第二條生產重組人胰島素的工藝路線由于A鏈和B鏈上共存在六個半胱氨酸殘基，體外二硫鍵的正確配對基因工程菌的構建戰略

人胰島素原表達法proinsulin基因工程菌的構建戰略人胰島素原表達法proinsulin表達產物后處理路線B鏈中第22位上的Arg和第29位上的Lys,由于良好折疊的原因,對胰蛋白酶不敏感表達產物后處理路線在人胰島素原表達工藝中,由于C肽的存在,胰島素原能形成良好的空間構象,三對二硫鍵的正確配對率也相應提高,折疊率高達80%以上。生產技術的評價目前美國ElyLiLi公司采用此工藝年產十幾噸的重組人胰島素。雖然這條工藝路線不比AB鏈分別表達法更為簡捷,而且還要使用兩種高純度的酶制劑,但理想的折疊率在很大程度上彌補了工藝繁瑣的缺陷,使得每克最終產品的成本僅50美元。在人胰島素原表達工藝中,由于C肽的存在,胰島素原能形南農-生物技術制藥--第二章基因工程藥物課件

一種能促進融合蛋白分泌的工程菌構建策略是將胰島素或胰島素原編碼序列與beta-內酰胺酶基因拼接,beta-內酰胺酶通常能被大腸桿菌分泌到胞外。獲得的工程菌同時具備了穩定高效表達可分泌型融合蛋白的優良特性,為胰島素的后續分離純化工序減輕了負擔。分泌型重組人胰島素表達法上述三種重組大腸桿菌的構建路線均采用胰島素或胰島素原編碼序列與大腸桿菌beta-半乳糖苷酶基因拼接的方法,所產生的融合型重組蛋白表達率高、穩定性強,但不能分泌,只要以包涵體的形式存在于胞質中。一種能促進融合蛋白分泌的工程菌構建策略是將胰島素什么叫蛋白質工程指通過改造與蛋白質相應的基因中的堿基順序，或設計合成新的基因，將它克隆至受體細胞中，通過基因表達而獲得具有新的特性的蛋白質（酶）技術。這是一門從改變基因入手，定做新的蛋白質的技術。故有人將其稱為“第二代基因工程”

1983年，美國生物學家額爾默首先提出了“蛋白質工程”的概念。蛋白質工程和基因工程蛋白質類藥物什么叫蛋白質工程蛋白質工程和基因工程蛋白質類62

1、蛋白質工程的理論設計：包括活性設計、專一性設計、框架（構象）設計等。由于對蛋白質的結構與功能之間的關系認識還不系統，目前的蛋白質設計僅僅是對天然蛋白質的修飾。如：異常血紅蛋白的氨基酸取代去羧基端胰島素等。

蛋白質工程的一般技術根據需要合成具有特定氨基酸序列和空間結構的蛋白質；確定蛋白質化學組成、空間結構與生物功能之間的關系；從氨基酸序列預測蛋白質的空間結構和生物功能，設計合成具有特定生物功能的全新蛋白質。

蛋白質工程的一般技術根據需要合成具有特定氨基酸序列和632、基因修飾——點突變法蛋白質結構的改變通過基因修飾來完成基因修飾的方法：⑴基因的全化學合成按照所需蛋白質的氨基酸順序，先后合成結構基因、轉錄的起始信號及終止信號、限制酶切位點等核酸片段，然后用連接酶將各片段連接起來，通過基因工程轉移到細菌中進行目標蛋白質的表達。目前用此法已合成了：人血細胞干擾素、胰島素、生長激素釋放抑制激素等基因。

2、基因修飾——點突變法64調節基因啟動基因結構基因終止基因連接酶完整基因調節基因啟動基因結構基因終止基因連接酶完整基因65⑵基因直接修飾法將連接于質粒上的某一蛋白質的基因用酶法去除一小段，然后用合成的核苷酸片段接上，從而獲得新的突變體。已修飾過的酶有：內酰胺酶、酪氨酰tRNA合成酶、二氫葉酸還原酶等酶蛋白。⑵基因直接修飾法66限制性內切酶外源DNA限制性內切酶退火重組質粒轉化受體細胞篩選表達帶重組體的細胞目的產物質粒目的基因酶切割蛋白基因核苷酸片段新突變質粒限制性內切酶外源DNA限制性內切酶退火重組質粒轉化受體細胞篩67⑶盒式突變

1985年Wells提出的一種基因修飾技術，一次可以在一個位點上產生20種不同氨基酸的突變體，可以對蛋白質分子中重要氨基酸進行“飽和性”分析。蛋白質工程的運用蛋白質或肽類藥物的改造和新藥的研制

⑶盒式突變68酶切割蛋白基因核苷酸片段新突變質粒同時獲得多個突變體酶切割蛋白基因核苷酸片段新突變質粒同時獲得多個突變體69圖3-1胰島素的分子結構和從前胰島素原合成胰島素的簡要過程30個氨基酸B鏈21個氨基酸A鏈胰島素利于重組生產的特點前導序列BCA前胰島素原（胰島素原=BCA——無前導序列）胰島素∣S∣S∣∣S∣S∣BA剪切-S-S--S-S-LBAC自發折疊蛋白質工程的應用圖3-1胰島素的分子結構和從前胰島素原合成胰島素的簡要過程370圖3-2由人工合成的A,B鏈的基因合成重組胰島素lac啟動子lacZ’A基因運載人工合成的A基因的載體B基因運載人工合成的B基因的載體(a)人工合成的基因(b)合成胰島素蛋白ABmetβ-半乳糖苷酶片段A鏈胰島素純化A鏈和B鏈二硫鍵連接metB鏈溴化氰處理pBR322pBR322轉化的大腸桿菌合成AB融合蛋白圖3-2由人工合成的A,B鏈的基因合成重組胰島素lac啟動71圖3-3重組促生長素抑制素的合成lac啟動子lacZ’人工促生長素抑制素基因metβ-半乳糖苷酶片段促生長素抑制素融合蛋白轉化大腸桿菌促生長素抑制素（14氨基酸）溴化氰圖3-3重組促生長素抑制素的合成lac啟動子lacZ’人工促72圖3-4重組生長素的合成密碼子01911912424024HaeⅢ保留除去（a）生長素cDNA片段的準備過程（b）表達024合成前導序列191cDNAlac啟動子插入表達載體合成生長素轉化大腸桿菌圖3-4重組生長素的合成密碼子01911912424024H73圖3-5凝血因子Ⅷ基因及其翻譯產物外顯子（26）內含子（25）（a）凝血因子Ⅷ基因（b）凝血因子Ⅷ的翻譯后的加工初級翻譯產物（2351個氨基酸）ABCAC成熟的凝血因子Ⅷ蛋白加工圖3-5凝血因子Ⅷ基因及其翻譯產物外顯子（26）內含子（274重組凝血因子Ⅷ合成的幾種方法在哺乳動物細胞中合成（倉鼠細胞）利用活體動物生產（豬）利用表達載體Ag啟動子SV40聚腺甘酸化序列凝血因子Ⅷ的cDNA導入倉鼠細胞重組蛋白重組凝血因子Ⅷ合成的幾種方法在哺乳動物細胞中合成（倉鼠細胞）75干擾素的合成干擾素分子結構干擾素生產車間干擾素的合成干擾素分子結構干擾素生產車間76圖3-7利用分離的病毒殼體蛋白作疫苗的原理分離的病毒殼體蛋白殼體蛋白的特異抗體注射到血液循環抗體包圍整個病毒被完整病毒感染圖3-7利用分離的病毒殼體蛋白作疫苗的原理分離的病毒殼體77圖3-8重組牛痘病毒可能用途的基本原理乙型肝炎表面抗原基因牛痘病毒啟動子重組牛痘病毒基因組牛痘病毒乙型肝炎病毒抗乙型肝炎抗體抗牛痘病毒抗體注射重組牛痘病毒顆粒到血液循環免疫系統合成抗牛痘病毒和乙型肝炎病毒的抗體圖3-8重組牛痘病毒可能用途的基本原理乙型肝炎表面抗原基因78表3-2在重組牛痘病毒中表達的外源基因

基因惡性瘧原蟲表面抗原流行性感冒病毒衣殼蛋白狂犬病病毒G蛋白乙型肝炎主要表面抗原單純皰疹糖蛋白人類免疫缺陷病毒（HIV）表面蛋白水泡性口炎衣殼蛋白仙臺病毒蛋白BACK表3-2在重組牛痘病毒中表達的外源基因7980（inclusionbodiesIBs)基因工程包含體的純化基因工程菌培養液不同表達形式的前處理胞外分泌型表達：離心,收集液相→濃縮→純化。胞內表達：胞內可溶性表達：離心,收集菌體→細胞破碎→離心，收集上清→純化胞內周質表達：離心,收集菌體→低濃度溶菌酶或滲透壓沖擊等溶解目標物→離心,收集上清液→純化。不溶性包涵體：離心,收集菌體→細胞破碎→離心,收集沉淀→包涵體洗滌→目標蛋白變性溶解→復性→純化。80（inclusionbodiesIBs)基因工程包81外源蛋白在大腸桿菌中的積累蛋白產物占菌體總蛋白外源蛋白的積累人胰島素50%形成包涵體β-丙酰胺酶20%在細胞間區γ-人體干擾素25%形成包涵體凝乳酶原形成包涵體牛生長激素>30%形成包涵體β-內酰胺酶形成間區包涵體人胰島素原5%~26%形成包涵體81外源蛋白在大腸桿菌中的積累蛋白產物占菌體總蛋白外源蛋白的82包涵體：一種蛋白質不溶性聚集體，包括目標蛋白、菌體蛋白等。目標蛋白一級結構是正確的，但立體結構是錯誤的，所以沒有生物活性。包涵體的形成：大腸桿菌中目標產物的表達水平過高，超過正常代謝水平，過多表達產物聚集在細胞內，形成不溶性的包涵體。高表達產生的積聚物在細胞內部形成不溶物原因？蛋白過量積聚，超過溶解度，導致沉淀；②蛋白生成太快，分子間疏水基團相互作用而聚集沉淀；③蛋白生成太快，分子內部二硫鍵的錯誤連接導致沉淀；④表達蛋白過多，與其結合/誘導組分不足，不能形成溶解狀態⑤蛋白質自身不穩定。包含體的構成82包涵體：一種蛋白質不溶性聚集體，包括目標蛋白、菌體蛋白等83基因工程包涵體的純化方法收集菌體細胞細胞破碎包涵體的洗滌目標蛋白的變性溶解目標蛋白的復性包含體的出現不僅增加了生物分離設計的難度，也為蛋白質折疊機理研究提出了新的課題。欲獲得天然活性態的目標產物，必需分離包含體后，溶解包含體并使其中的目標蛋白恢復應有的天然活性。83基因工程包涵體的純化方法收集菌體細胞細胞破碎包涵體的洗滌841）包涵體的洗滌細胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密。洗滌的重要性：收集的沉淀中，除包涵體外，還包括許多雜質，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，復性時會與目標蛋白一起復性形成雜交分子而聚集，給后步純化帶來困難。洗滌劑：溫和的表面活性劑、蔗糖、低濃度的弱變性劑（如尿素）或脫氧膽酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂質類雜質。洗滌劑濃度以溶解雜質，不溶解包涵體中表達產物為原則。841）包涵體的洗滌85

2）目標蛋白的變性溶解

包涵體中不溶性的目標蛋白必須溶解到液相中，才能進一步純化。一般水溶液很難將其溶解，只有采用蛋白質變性才能使其形成可溶性的形式。常用變性劑：▲

5-8mol/L鹽酸胍和6-8mol/L尿素,作用：破壞離子間相互作用；▲

表面活性劑如1-2％SDS，作用：破壞蛋白質肽鏈間的疏水相互作用。▲

PH>9.0的堿溶液和有機溶劑，使用較少。影響變性因素：時間、pH、離子強度、變性劑種類和濃度。852）目標蛋白的變性溶解86原理：在變性劑溶液中，溶解的蛋白質呈變性狀態，即蛋白質高級結構被破壞，但一級結構和共價鍵沒有破壞。當部分變性劑被除去后，蛋白質會重新折疊成具有活性的正確構型，該過程稱復性。復性方法：稀釋法除變性劑－加入大量水或緩沖液。膜分離法除變性劑－透析、超濾、電滲析。層析法：凝膠層析，高效疏水層析3）目標蛋白的復性86原理：在變性劑溶液中，溶解的蛋白質呈變性狀態，即蛋白質高87

蛋白質復性影響因素：變性劑濃度目標蛋白濃度；pH和離子強度；氧化還原條件。

還原劑：

二硫蘇糖醇、β-巰基乙醇、還原型谷胱甘肽；氧化劑：氧化型谷胱甘肽;堿性下通空氣。

復性區

多聚物生成區

絮凝沉淀區鹽酸胍濃度mol/L紅血球碳酐酶復性操作中變性劑與蛋白質濃度對復性的影響蛋白質濃度mol/L87蛋白質復性影響因素：鹽酸胍濃度mol/L紅血球碳酐酶復88腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白在E.coli中的高密度發酵過程中以兩種形式表達：◆細胞內有活性的可溶性蛋白形式（約占目標蛋白的30%）◆無活性的包涵體形式（約占目標蛋白的70%）。懸浮破壁PBS洗滌離心硫銨沉淀親和層析陽離子交換層析溶解復性親和層析濕菌體發酵液干凈菌體上清液包涵體純品活性檢測破壁液離心離心液洗滌舉例：TRAIL的分離純化88腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體蛋白在E.coli中的高密度891.包涵體的洗滌①粗制包涵體用50mM磷酸鹽緩沖液，含150mMNaClpH=7.4(1:3w/v)洗滌2-3次；②用含有1MNaCl的磷酸緩沖液洗滌1次(1:3w/v)，將粘附其表面的大部分蛋白及水溶性雜質除去；③用6M尿素及0.5%TritonX-100聯合洗滌1次(1:3w/v)，去除另一些雜蛋白，這時得較純包涵體（純度達80%左右）；④用SDS電泳檢測純度。2.包涵體的變性溶解①洗滌后包涵體用含有30mMDTT及5mol/l鹽酸胍的Tris緩沖液pH=8.0(1:5w/v)變性溶解→室溫攪拌2h，95%以上的包涵體可被溶解；②離心，13000rpm，20min→棄沉淀得到溶解液。891.包涵體的洗滌2.包涵體的變性溶解903.包涵體復性（間歇式流加稀釋復性法）以含DTT和ZnSO4的Tris-HCl為復性緩沖液，再添加0.4ML-Arg，0.5M尿素，0.5MNaCl作為蛋白聚集抑制劑，變性溶解液可多次流加，每次流加的時間是以上一次流加蛋白已達到部分復性為準。本實驗中，流加間隔時間確定為90min，每次流加濃度為150mg/L，變性液流加次數可高達6次，最終濃度可達到1mg/ml，4℃緩慢攪拌一段時間，對50mMTris-HCl，300mMNaCl，0.1M尿素及0.2mMZnSO4混合液透析過夜，透析后離心除去復性過程中聚集的蛋白，超濾濃縮（也可用硫酸銨沉淀進行濃縮）得復性蛋白液。903.包涵體復性（間歇式流加稀釋復性法）915.復性后純化復性濃縮后蛋白金屬親和層析吸附洗滌：40mmol/L咪唑，洗除非特異性吸附的雜蛋白洗脫：100mmol/L咪唑目標蛋白

純度達95%以上（由SDS和RP-HPLC鑒定）收率75%915.復性后純化92包含體產物分離工藝（牛生長激素分離提取）92包含體產物分離工藝（牛生長激素分離提取）93

來自發酵罐的菌體經過離心除去培養液后加入緩沖液懸浮，通入高壓勻漿器反復破碎三次。勻漿經過離心和水洗除去細胞碎片，再添加溶菌酶、EDTA和促進劑以除去脂蛋白和未破碎的細胞。包含體經離心沉淀和水洗后進行變性溶解，溶解劑為6mol/L鹽酸胍。溶解的同時通入空氣氧化以打斷錯誤連接的雙硫鍵。離心除去沉淀，含變性蛋白質的上清液經超濾濃縮后過凝膠柱除去雜蛋白，再加入復性緩沖液進行透析復性。復性過程中產生的絮凝沉淀用離心除去。包含體產物分離工藝

（牛生長激素分離提取）93來自發酵罐的菌體經過離心除去培養液后

質譜在蛋白質、多肽分析中的應用

質譜在蛋白質、多肽分析中的應用質譜在蛋白質、多肽分析中的應用分子量的測定蛋白質、多肽純度的鑒定肽質量指紋譜肽序列測定技術蛋白質的翻譯后修飾鑒定其他蛋白質鑒定質譜在蛋白質、多肽分析中的應用分子量的測定蛋白質鑒定分子量的測定用ESI-MS和MALDI-TOF-MS測定蛋白質和多肽的分子量，精確度可達0.1％～0.01％，這遠比其它方法(如SDS、凝膠過濾、超離心等）精確。正確測定蛋白質的分子量，可以提供很多信息，如確定分子大小，從氨基酸組成分析的結果求得準確的氨基酸組成，驗證已測定的一級結構是否正確等。分子量的測定用ESI-MS和MALDI-TOF-MS測定蛋白分子量測定實例采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，高效凝膠過濾色譜以及電噴霧離子化質譜三種方法對新發現的一種蛋白質（來源于福建尖吻蝮蛇蛇毒,是一種具有類凝血酶活性的弱酸性蛋白質）的分子量進行了測定。測定方法分子量非還原SDS-PAGE26.2kDa(二硫鍵未打開)還原SDS-PAGE29kDa(二硫鍵被還原)HPGFC24.5kDaESI-MS30298Da分子量測定實例采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，高效凝膠過濾色譜以及電分子量測定實例天花粉蛋白的一級結構測定，在86年時曾出現差錯，當時測定的結果表明它是由234個氨基酸殘基組成，分子量為25682Da。90年，我們發現結構測定有誤，重新修正了其一級結構。它應由247個氨基酸殘基組成，正確分子量為27141.32Da。93年，用MALDL-TOF-MS和ESI-MS測定了天花粉的分子量。分子量測定實例天花粉蛋白的一級結構測定，在86年時曾出現差錯天花粉蛋白（TCS）的MALDI-TOF-MS的分子量圖譜天花粉蛋白（TCS）的MALDI-TOF-MS的分子量圖譜天花粉蛋白（TCS）的ESI-MS的分子量圖譜天花粉蛋白（TCS）的ESI-MS的分子量圖譜分子量測定實例β-苦瓜子蛋白的一級結構計算(包括糖部分)的分子量為29156Da，用MALDI-TOF-MS測定的分子量為29074Da，二者相差82Da。這種差異可能是個別氨基酸測定的差錯造成，估計整個結構測定不會有大錯誤。分子量測定實例β-苦瓜子蛋白的一級結構計算(包括糖部分)的分分子量測定實例β-苦瓜子蛋白其C端用羧肽酶的方法測定為-S-T-A-D-E-N，但尚不能完全確定。苦瓜子蛋白在190位有一個色氨酸，我們用BNPS-Skatole降解色氨酸，降解后的肽用HPLC分離，得到含有C端的一段小肽(59個氨基酸殘基)用MALDI-TOF-MS測定其分子量為6443與計算得到的59肽的分子量為6442.9非常相符，因此也就證明了C端59個氨基酸殘基的順序是正確的。

分子量測定實例β-苦瓜子蛋白其C端用羧肽酶的方法測定為-Sβ-苦瓜子蛋白Trp降解C端肽分子量β-苦瓜子蛋白Trp降解C端肽分子量蛋白質、多肽純度的鑒定

根據質譜測定分子量的作用，質譜還可用來作蛋白質、多肽純度的鑒定。只要質量有差異的雜質都可以被檢出，此方法靈敏度高，用量少(pmol水平)、速度快，并有獨到之處。蛋白質、多肽純度的鑒定根據質譜測定分子量的作用，質譜還可用蛋白質、多肽純度的鑒定實例1：天花粉蛋白C-端微觀不均一，即有二個C末端，一個多一個Ala(即247個氨基酸殘基)，一個少一個Ala(即246個氨基酸殘基)，用ESI-MS完全能夠分辨出來

蛋白質、多肽純度的鑒定實例1：天花粉蛋白C-端微觀不均一，即實例2：如豬胰島素和人胰島素混在一起，用MALDI-TOF-MS也能夠清楚地分出二個峰。兩者的差異僅在豬胰島素B鏈的第30位為Ala(89.09Da)，而人胰島素相應的位置為Thr(119.12Da)，兩者相差30Da（如圖13-11）。這些差異用其他方法是很難檢出的。

實例2：蛋白質鑒定肽質量指紋譜+基于串聯質譜多肽測序蛋白質鑒定蛋白質鑒定肽質量指紋譜+基于串聯質譜多肽質量指紋譜由于各種蛋白質的氨基酸序列(一級結構)不同，蛋白質被酶解后產生的肽段序列也各異，肽混合物質量數亦具特征性，稱為肽質量指紋譜(peptidemassfingerprint,PMF)，可用于蛋白質的鑒定。

肽質量指紋譜由于各種蛋白質的氨基酸序列(PMF流程PMF流程肽質量指紋譜

MALDI-TOF-MS是最有效的分析肽混合物的質譜儀，肽混合物不需分離可直接分析，基質輔助激光電離方法能耐受一定濃度的鹽，儀器靈敏度高，標準樣品1pmol的量就足夠，質量數準確度可達0.1‰～0.01‰，且操作簡單，分析速度快，依儀器型號不同一次可分析十幾個到幾十個樣品。肽質量指紋譜MALDI-TOF-MS是PMF實例蓖麻毒素(ricin)

利用MALDI-TOF生物質譜技術結合肽質量指紋譜方法，經過數據庫檢索，建立了鑒定檢測Ricin的新方法。PMF實例蓖麻毒素(ricin)MALDI-TOF質譜的測定，得到Ricin的分子量為62925DaMALDI-TOF質譜的測定，得到Ricin的分子量為629Ricin的肽質量指紋譜，共檢出22條肽譜峰Ricin的肽質量指紋譜，共檢出22條肽譜峰將這些肽片段的質譜數據用MASCOT搜索引擎在SwissProt數據庫中進行PMF檢索，檢索參數如表1所示。返回前5個檢索結果，如表2所示。其中符合要求的結果(置信區間為得分大于66分)只有一種蛋白即蓖麻毒素:Ricinprecursor(P02879，RICI_RICCO)，得分107，匹配肽段13條，肽譜的實驗值與理論值的對比見表3，其余未檢出的肽段中有4條經過與理論值對照也找到了歸屬。將這些肽片段的質譜數據用MASCOT搜索引擎在SwissPr肽序列測定技術

兩種經典測序方法：

DNA順序測定解決不了翻譯后加工所導致的氨基酸殘基的修飾的問題；

Edman降解不能解決N端封閉的測序的問題。肽序列測定技術兩種經典測序方法：

蛋白梯形測序

(proteinladdersequencing)①使用少量鏈終止劑，進行快速分步降解，在人為控制下產生一系列肽段，其中每個肽段于下一個之間只相差一個殘基；②用MALDI-TOF-MS讀出肽段信息。用此方法可在磷酸肽中定位磷酸絲氨酸殘基。研究N-端封閉的肽和蛋白，必須了解其C-端序列的信息。蛋白梯形測序

(proteinladderseque蛋白梯形測序

(proteinladdersequencing)蛋白梯形測序

(proteinladdersequenc肽測序一般方法（MS/MS）使用串聯質譜，利用待測分子在電離及飛行過程中產生的亞穩離子，通過分析相鄰同組類型峰的質量差，識別相應的氨基酸殘基。其中亞穩離子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用誘導碎裂。肽測序一般方法（MS/MS）使用串聯質譜，利用待測分子在電離基于串聯質譜的肽序列測定用特定蛋白水解酶作用于蛋白質，將得到的肽段送入一級質譜，產生前體離子，經過一定選擇的前體離子在碰撞室發生CID。結果是前體離子肽骨架酰胺鍵的特異性斷裂，并產生了一系列可用于確定氨基酸序列的y型和b型等離子。獲得CID二級質譜圖后可算出肽序列。基于串聯質譜的肽序列測定用特定蛋白水解經過MS/MS分析的多肽片段

經過MS/MS分析的多肽片段N端和C端多肽GFPNAGFPNAGFPNAGFPNAGFPNAN-terminalpeptidesC-terminalpeptides415

486

30115457

71185332429N端和C端多肽GFPNAGFPNAGFPNAGFPNAGFP理論質譜圖理論質譜圖理論質譜圖與實際質譜圖理論質譜圖與實際質譜圖理論質譜圖與實際質譜圖理論質譜圖與實際質譜圖標準肽Glu-fib的MS/MS圖譜

標準肽Glu-fib的MS/MS圖譜MS/MS優點

MS/MS質譜測序可對N端封閉的肽進行測序;并可以通過CID得到部分至完全的序列信息后，做出MS肽譜，這可對修飾的氨基酸殘基定性，并確證其位置，包括二硫鍵的分布。而且質譜技術與分離技術直接相連也可相互驗證，同時還可對混合肽進行測序。另外它還有快速、靈敏的優點。MS/MS優點MS/MS質譜測序可對N基于MS/MS蛋白質鑒定獲得二級質譜圖后可通過下列方法鑒定蛋白質：①較常用的肽序列標簽鑒定方法（peptidesequencetag，PST：從一級質譜產生的肽段中選擇母離子，進入二級質譜，經惰性氣體碰撞后肽段沿肽鏈斷裂，由所得到的各肽段質量數差值推定肽段序列，用于數據庫查尋；②肽碎片離子搜索：直接用前體離子產生的未解析的CID圖譜與數據庫中的CID圖譜比較，如Sequest、Mascot、Sonat等算法；③從頭測序法（denovosequence），通過直接解釋MS/MS數據識別肽序列，這類系統和算法有Lutefisk、SHERENG、PEAKS、AuDeNS等。

基于MS/MS蛋白質鑒定獲得二級質譜圖后可通過下列方法鑒定蛋基于MS/MS的蛋白質鑒定基于MS/MS的蛋白質鑒定串聯質譜在蛋白質組學中的應用串聯質譜在蛋白質組學中的應用測序其它方法先用幾種不同的蛋白水解酶對蛋白質進行酶解，胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)SV8酶(staphylococcusaureusV8)各種酶解片段用HPLC等分離得到的純肽或簡單的混合肽，可用MS/MS測定其各組分的順序，然后從不同蛋白水解酶酶解片段順序，找到其重疊部分，即可得到整個蛋白質順序。測序其它方法先用幾種不同的蛋白水解酶對蛋白質進行酶解，蛋白質的翻譯后修飾鑒定磷酸化修飾糖基化修飾巰基和二硫鍵定位氨基的乙酰化泛素化修飾蛋白質的翻譯后修飾鑒定磷酸化修飾磷酸化修飾已知的磷酰氨基酸的類型有四種：

1．O-磷酸鹽，通過羥氨酸的磷酸化形成的，如絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸。

2．N-磷酸鹽，通過精氨酸，賴氨酸或組氨酸中的氨基的磷酸化形成的。

3．乙酰磷酸鹽，通過天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成的。

4．S-磷酸酯，通過半胱氨酸的磷酸化形成的。

磷酸化修飾已知的磷酰氨基酸的類型有四種：磷酸化肽富集分離技術有：雙向磷酸多肽譜圖(2D-PP)；高分辨率的凝膠電泳(2DE)和反相高效液相色譜(RP-HPLC)。對于32P標記的磷酸化肽或蛋白可用放射自顯影或磷儲屏檢測，提取后可以高靈敏度MALDI-MS分析；如果32P標記不可行，就要用LC-MS/MS分析，常用HPLC與質譜聯用。

常用的富集方法有：固定金屬親和色譜(IMAC)；抗體免疫沉淀；化學修飾。磷酸化肽富集分離技術有：雙向磷酸多肽譜圖(2D-PP)；高分質譜檢測磷酸化肽和確定磷酸化位點的方法

①

MALDI-TOF-MS可以通過肽指紋譜(PMF)鑒定蛋白質，與磷酸酯酶處理相結合可以確定磷酸化位點。

原理：磷酸酯酶處理后，磷酸化的肽丟失磷酸基團而產生特定質量數的變化，MALDI-TOF-MS通過檢測這種質量數的變化而確定磷酸化位點。質譜檢測磷酸化肽和確定磷酸化位點的方法

②串聯質譜(MS/MS)進行前體離子掃描，這一方法是通過檢測磷酸基團產生的特定片段來報告磷酸肽的存在。

原理：磷酸化肽經CID后會產生磷酸基團的特異性片段，這些特異性的片段在用串聯質譜進行前體離子掃描時可作為磷酸肽的“報告離子”。

質譜檢測磷酸化肽和確定磷酸化位點的方法質譜檢測磷酸化肽和串聯質譜還可進行中性丟失掃描，這種方法是用MS/MS檢測經CID后發生中性丟失H3PO4(98u)的肽段。LC-MS/MS分析磷酸化位點傅立葉變換質譜進行電子捕獲解離

質譜檢測磷酸化肽和確定磷酸化位點的方法質譜檢測磷酸化肽和糖基化修飾蛋白質糖基化可分為4類:N-糖基化

O-糖基化

C-甘露糖化聚糖磷脂酰肌醇錨(GPI-anchor)糖基化糖基化修飾蛋白質糖基化可分為4類:糖蛋白糖苷內切酶還原、烷基化、蛋白酶解MALDI-TOF-MS糖含量相對分子質量ESI串聯質譜MALDI-TOF-MS凝集素提取氨基酸序列糖基化位點糖肽片段糖蛋白結構分析示意圖糖蛋白糖苷內切酶還原、烷基化、蛋白酶解MALDI-TOF-M糖基化位點確定先用蛋白酶將糖蛋白酶解成含有和不含有糖鏈的肽片段，獲得糖蛋白的肽質量指紋譜，再用糖苷內切酶將肽鏈切除，PMF發生變化，原含有糖肽段的質量由于糖鏈的丟失在質譜圖上發生位移，通過網上數據庫檢索可以得到位移肽片段的氨基酸序列，而在這個序列中必含有糖基化位點，由此我們可以確定糖蛋白分子中的糖基化位點。糖基化位點確定先用蛋白酶將糖蛋白酶解成糖基化分析用糖苷內切酶將糖鏈切除，將反應前后的質譜圖進行比較，就能直接表述糖鏈的平均質量，而糖蛋白的平均含糖量可由糖鏈的平均質量占糖蛋白平均相對分子質量的百分比來表示。應用ESI，對PMF中的肽片段進行分析，可以得到蛋白某中間片段的序列，對已知蛋白，依靠此序列，判斷其歸屬，從而對糖蛋白的氨基酸序列加以證實。不同的質譜方法可以產生多糖的源后裂解(PSD)和碰撞誘導解離(CID)譜，這可以給出有關糖的序列，分支及糖間的連接等信息。

糖基化分析用糖苷內切酶將糖鏈切除，將反應前后的質譜圖進行比較南農-生物技術制藥--第二章基因工程藥物課件糖基化修飾常用的糖蛋白質分離富集技術有:凝集素親和技術、肼化學富集法、親水相互作用色譜法、β消除麥克爾加成反應。基于質譜的糖蛋白質鑒定及糖基化位點確定方法有:PNGaseF酶法、EndoH酶法、β-消除麥克爾加成反應、三氟甲基磺酸法。糖基化修飾常用的糖蛋白質分離富集技術有:凝集素親和技術、肼化巰基和二硫鍵定位

原理：利用碘乙酰胺、4-乙烯吡啶、2-巰基蘇糖醇等試劑對蛋白質進行烷基化和還原烷基化,結合蛋白酶切、肽譜技術,利用生物質譜的準確分子量測定,可實現對二硫鍵和自由巰基的快速定位與確定。這在含有多二硫鍵結構的活性多肽與蛋白質研究中有重要用途。巰基和二硫鍵定位原理：利用碘乙酰胺、4-乙烯吡啶、2-巰基泛素化修飾原理：由于泛素的C末端是Arg-Gly-Gly結構，經胰蛋白酶水解后，Gly-Gly留在被修飾蛋白質的肽鏈上，使肽段質量增加114

，起到質量標記泛素化位點的作用，進而通過串聯質譜鑒定泛素化位點。泛素化修飾原理：由于泛素的C末端是Arg-Gly-Gly其他翻譯后修飾乙酰化甲基化脂基化谷胱甘肽化其他翻譯后修飾乙酰化質譜的其他應用蛋白質的折疊抗原決定部位指認蛋白和蛋白、低聚核苷酸及金屬之間的作用細胞和病毒分析等藥物代謝鑒定質譜的其他應用蛋白質的折疊蛋白質類藥物的體外聚乙二醇修飾（PEG化）(1)增大藥物分子量，避免被腎小球過濾(2)阻礙蛋白酶的降解作用(3)屏蔽藥物的免疫位點(4)增加藥物在體液中的溶解度(5)與藥物間的化學鍵在體內隨時間水解，緩慢釋放藥物

+蛋白或多肽偶聯物聚乙二醇CH3(-O-CH-CH)n-OH蛋白質類藥物的體外聚乙二醇修飾（PEG化）(1)增大藥物分子國際上PEG修飾技術的研究進展美國Rutgers大學Davis教授70年代的工作甲氧基PEG的應用美國Enzon公司美國最早從事PEG修飾蛋白質藥物的公司美國Shearwaters公司各種PEG修飾劑的生產商美國羅氏、先靈寶雅、安進PEG藥物：PEG-INF，PEG-G-CSF其它：輝瑞、默克、葛蘭素史克、施貴寶。。。國際上PEG修飾技術的研究進展美國Rutgers大學Davi國內PEG修飾技術的研究進展國家863重大機密項目：人工血液代用品的研制，1997-2000中國科學院重點項目：血液代用品和血液凈化，2001-2005國家重大科技專項課題《創新藥物和中藥現代化》：長效基因工程蛋白質和多肽制劑關鍵技術，2002-2005國家863重點項目課題：核酸和多肽的修飾和劑型化技術，2007-2010PEG修飾血紅蛋白：I期臨床（中科院過程所、凱正公司）PEG修飾G-CSF：III期臨床（格蘭百克）國內PEG修飾技術的研究進展國家863重大機密項目：人工血液修飾粒細胞集落刺激因子（rhG-CSF） 延長半衰期修飾人腫瘤壞死因子 消除副作用修飾白介素I受體拮抗劑（rhIL-1Ra） 延長半衰期修飾牛胰核糖核酸酶（RNase） 提高抗腫瘤活性修飾超氧化物歧化酶（SOD） 提高半衰期修飾天冬酰氨酶（Aspartase） 克服免疫原性 提高半衰期修飾人干擾素（IFN） 提高半衰期修飾血紅蛋白（Hb） 血液代用品修飾胰島素 提高半衰期我國在PEG修飾蛋白質方面的一些工作我國在PEG修飾蛋白質方面的一些工作Sc-PEG專利分析以PEG-OH