感染性疾病的分子診斷感染性疾病的分子診斷1感染的慨念

感染是病原體和人體之間的相互作用過程病原微生物：致病菌（條件致病菌）微生物人體微生物人體不同的感染狀態共生狀態在正常情況下，人體的一些腔道和體表均有微生物寄生感染的慨念感染是病原體和人體之間的相互作用過程微人微人不共感染性疾?。河赡撤N病原體所致，通過不同方式引起人體發生感染并出現臨床癥狀的疾病。病原體：病毒、細菌、原蟲、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體、寄生蟲。

感染性疾?。河赡撤N病原體所致，通過不同方式引起人體發生感染并常規檢測方法：免疫學方法微生物學方法受敏感性、特異性限制，不易早期診斷，并且不易提供病原體分型及耐藥性方面的信息。常規檢測方法：感染性疾病的分子診斷策略一般性策略（檢出病原體）：判斷有無感染是何種病原體感染常用方法：PCR＋雜交完整性策略：檢出病原體分型（分類）－亞型－耐藥性常用方法：雜交、PCR、基因芯片、DNA測序感染性疾病的分子診斷策略一般性策略（檢出病原體）：感染性疾病分子診斷標志物病原體核酸分子（DNA/RNA）基因表達產物代謝物免疫應答分子細胞免疫體液免疫TT致敏T細胞淋巴因子B漿細胞IgMIgGIgAIgDIgE感染早期出現臨近恢復期出現與原蟲和蠕蟲感染有關感染性疾病分子診斷標志物病原體核酸分子（DNA/RNA）細體二、感染性疾病分子診斷的常用方法

根據目的基因是否被放大，可分為雜交法和擴增法。信號放大技術檢測方法靶分子數目不變，而檢測的探針信號放大

采用多酶、多探針或二者結合等方法來增加探針標志物的濃度使檢測信號得到放大。靶分子擴增技術檢測方法靶分子（RNA、DNA或探針）的擴增PCR、替代擴增、LCR等二、感染性疾病分子診斷的常用方法根據目的基因是否被放大擴增的靶序列：編碼外膜蛋白Ⅲ的結構基因，或16SrRNA基因、CPPB基因（同時存在于染色體及質粒上）合多個側鏈HIV表型主要依據逆轉錄酶和蛋白酶基因突變的檢測RNA逆轉錄cDNA整合到宿主基因組中復制，以被感染細胞DNA為模板PCR擴增；B型和C型主要存在于亞洲人群流感病毒的診斷過去主要靠雞胚羊膜腔培養和血清學血凝抑制試驗，這些方法比較費時，靈敏度低，難以作出早期診斷。gag基因5’-GAACTTTAAATGCATGGGTAAA-3’342外膜蛋白Ⅲ5’-TAAAGCAAGCCAAGGTCGCG-3’494衣原體是介于立克次氏體與病毒之間，能通過細菌濾器，專性活細胞內寄生的一類原核生物。PCR法敏感、特異、簡便、快速，并且可用于流感病毒的分型和流行病學調查。5’-ATGGCCATCGGATCCTCAAC-3’241(bp)有8個RNA片段或7個RNA片段；沙眼衣原體感染常缺乏特異癥狀，易形成隱匿感染，分子診斷技術敏感性和特異性高，適用于早期診斷和無癥狀攜帶者的檢查；感染性疾?。河赡撤N病原體所致，通過不同方式引起人體發生感染并出現臨床癥狀的疾病。Dane顆粒（完整的病毒）形態條件致病菌：正常菌群與人體平衡破壞，引起疾病的一類細菌；病毒載量檢測：在臨床進展情況的判定及療效觀察上極有價值。C區編碼HBeAg、HBcAg整個反應過程由三種酶控制，循環次數少，忠實性高,其擴增效率高于PCR，特異性好。5’-ATGGCCATCGGATCCTCAAC-3’241(bp)引物A

靶RNA

引物B

RNAcDNA

RT

3'5'5'5'3'5'3'5'3'cDNA

cDNA模板

5'5'3'3'5'3'引物B

RNAseH

RT

T7RNA聚合酶

100-1000RNA擴增子5'3'5'3'3'5'3'5'引物A

3'5'5'RNAseH

RNA

RNA

cDNA

cDNA

圖8-3NASBA原理示意圖引物A5’端帶有T7RNA聚合酶結合位點，3’端堿基與靶RNA3’端序列互補;引物B的堿基序列與cDNA3’端序列互補擴增的靶序列：編碼外膜蛋白Ⅲ的結構基因，或16SrRNA基因nucleicacidsequence-basedamplification(NASBA)nucleicacidsequence-basedam我國流行的主要是B和C基因型，長江以北以C型為主，長江以南以B型為主，另又少量的A型、D型和混合型。HBVDNA3.擴增的靶序列：編碼外膜蛋白Ⅲ的結構基因，或16SrRNA基因、CPPB基因（同時存在于染色體及質粒上）疾病狀況的判斷檢測出病原體的存在并不能說此病原體就是引起疾病的直接原因。DNA重復序列5’-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3’245信號檢測：bDNA可結合很多酶標探針，酶催化底物（1,2-二惡二酮，dioxetane）發光，使核酸信號放大，且發光強度與DNA量成正比。對疑似病例的診斷和鑒別診斷。我國流行的主要是B和C基因型，長江以北以C型為主，長江以南以B型為主，另又少量的A型、D型和混合型。三、感染性疾病分子診斷的標本處理分為甲(A)、乙(B)和丙(C)3個型別;常用方法：PCR＋雜交操作簡便，省時，易于普及受敏感性、特異性限制，不易早期診斷，并且不易提供病原體分型及耐藥性方面的信息。靶分子擴增技術檢測方法Dane顆粒（完整的病毒）形態病原體：病毒、細菌、原蟲、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體、寄生蟲分型（分類）－亞型－耐藥性靶序列引物序列擴增片斷（bp）NASBA的特點為操作簡便，不需特殊儀器，不需溫度循環。整個反應過程由三種酶控制，循環次數少，忠實性高,其擴增效率高于PCR，特異性好。

我國流行的主要是B和C基因型，長江以北以C型為主，長江以南以引物A

靶RNA

引物B

RNAcDNA

RT

3'5'5'5'3'5'3'5'3'cDNA

cDNA模板

5'5'3'3'5'3'引物B

RNAseH

RT

T7RNA聚合酶

100-1000RNA擴增子5'3'5'3'3'5'3'5'引物A

3'5'5'RNAseH

RNA

RNA

cDNA

cDNA

圖8-3NASBA原理示意圖引物A5’端帶有T7RNA聚合酶結合位點，3’端堿基與靶RNA3’端序列互補;引物B的堿基序列與cDNA3’端序列互補引物A靶RNA引物BRNAcDNART3'5'5'nucleicacidsequence-basedamplification(NASBA)nucleicacidsequence-basedamNASBA的特點為操作簡便，不需特殊儀器，不需溫度循環。整個反應過程由三種酶控制，循環次數少，忠實性高,其擴增效率高于PCR，特異性好。

NASBA的特點為操作簡便，不需特殊儀器，不需溫度循環。整個三、感染性疾病分子診斷的標本處理標本采集處理主要包括選擇合適的標本種類、標本量、抗凝劑等及對標本進行合適的傳送、保存和預處理。三、感染性疾病分子診斷的標本處理標本采集處理主要包括選擇合適四、感染性疾病分子診斷的結果解釋1.陰性結果假陰性可能性方法的靈敏度太低方法失敗目標分子2.陽性結果假陽性可能性方法的特異性受到污染四、感染性疾病分子診斷的結果解釋1.陰性結果假陰性可能性3.定性檢測結果有時不能提供病原體活力相關信息臨床治療病情緩解后一定時間內，在患者樣本中仍可以檢測出相應的病原體。有些病原體潛伏在進體內，沒有臨床癥狀。4.疾病狀況的判斷檢測出病原體的存在并不能說此病原體就是引起疾病的直接原因。該病原體可能是一種正常菌群

3.定性檢測結果有時不能提供病原體活力相關信息五、感染性疾病分子診斷的臨床應用及評價用于感染性疾病治療的監控和預測、病情發展過程的危險性評價及疾病預后等。耐藥性的檢測細菌的分型流行病調查五、感染性疾病分子診斷的臨床應用及評價用于感染性疾病治療的監第一節病毒的基因檢測人類許多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝炎、腦炎、流行性感冒等等，占人類傳染疾病的75%左右。400多種不同病毒。病毒結構：大?。?0-300nm

核心區：核酸（DNA或RNA）外周衣殼：蛋白質包膜：脂質（鑲嵌有蛋白質）第一節病毒的基因檢測人類許多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝

我國是HBV高流行區，50%－70%的人受過感染，8%－10%是HBV攜帶者，肝炎患者中60%是慢性肝炎患者，導致肝硬變，HBV又與原發性肝癌密切相關。外殼（HBsAg):外殼蛋白成分為表面抗原核心（HBcAg)：DNADNA聚合酶

HBcAg一、乙型肝炎病毒我國是HBV高流行區，50%－70%的人受過感染，8Dane顆粒（完整的病毒）形態HBsAgHBcAgHBVDNADNAPol（外膜蛋白）（核衣殼蛋白）完整的乙肝病毒顆粒直徑42納米由雙層外殼和一個核心組成的，核心直徑為27納米，內含DNA雙鏈和DNA多聚酶Dane顆粒（完整的病毒）形態HBsAgHBcAgHBVD（一）病毒基因組結構3.2kb雙鏈DNA病毒不完全雙連環狀DNA

長鏈L為負鏈：有4個開放閱讀框S、C、P、XS區編碼外膜蛋白（HBsAg）

C區編碼HBeAg、HBcAgp區編碼DNA聚合酶

X區位編碼X蛋白，可能與病毒蛋白表達有關。短鏈S為正鏈：長短不一（一）病毒基因組結構3.2kb雙鏈DNA病毒gap基因5’-ATAATCCACCTATCCCAGATAGGAGAAATC-3’115操作簡便，省時，易于普及最外層為囊膜，雙層脂蛋白，是病毒識別攻擊宿主細胞所必不可少的；條件致病菌：正常菌群與人體平衡破壞，引起疾病的一類細菌；病毒載量檢測：在臨床進展情況的判定及療效觀察上極有價值?？股刂委熜Ч挠^察。檢測②靶探針1⑥分子生物學：靈敏、特異，可進行早期診斷、分型、耐藥性檢測；我國是HBV高流行區，50%－70%的人受過感染，8%－10%是HBV攜帶者，肝炎患者中60%是慢性肝炎患者，導致肝硬變，HBV又與原發性肝癌密切相關。包裹后的前基因mRNA細菌耐藥性的產生導致治療失敗、感染復發、增加昂貴抗生素的使用。喹諾酮的耐藥-DNA解旋酶的gyrA和gyrB基因擴增的靶序列有tpp47、bmp、tpf1、tyf1、tmpA等基因。HIV表型主要依據逆轉錄酶和蛋白酶基因突變的檢測四、感染性疾病分子診斷的結果解釋支鏈DNA信號放大技術(bDNA）16SrRNA的rrs基因gag基因5’-GAACTTTAAATGCATGGGTAAA-3’342telbivudineF型僅見于中南美洲的土著人最外層為囊膜，雙層脂蛋白，是病毒識別攻擊宿主細胞所必不可少的；pre-s1

pre-s2S

P

C

pre-c

XHBVDNA3.2kbpre-S1pre-S1蛋白pre-S2pre-S2蛋白SHBsAgpre-CHBeAgCHBcAgPDNAPXHBxAgHBV基因組結構gap基因5’-ATAATCCACCTATCCCAGATAGHBV基因分型HBV基因序列差異的多少，可將HBV劃分為不同的基因型，至今為止已發現A、B、C、D、E、F、G、H共8種基因型：A型主要存在于白人，B型和C型主要存在于亞洲人群E型主要存在于西非F型僅見于中南美洲的土著人G型和H型很少見不同基因型序列長度不同，主要是前S1區的不同。我國流行的主要是B和C基因型，長江以北以C型為主，長江以南以B型為主，另又少量的A型、D型和混合型。西北和西南尤其是西北有較高比例的D型HBV基因分型HBV基因序列差異的多少，可將HBV劃分為不HBV在肝細胞內的復制A(n)mRNAcccDNAHBsAg

包膜負鏈DNA包裹后的前基因

mRNA傳染性HBV病毒顆粒傳染性HBV病毒顆粒部分雙鏈DNA逆轉錄酶DNA聚合酶肝細胞HBV在肝細胞內的復制A(n)mRNAcccDNAHBsAg（二）分子診斷常用的免疫學檢測方法，即二對半的檢測存在窗口期，不易早期診斷。1.PCR

采用普通PCR、FQ-PCR、競爭性PCR、免疫雜交PCR，可提供直接、準確的病原學診斷證據。引物是根據S、C、P、X基因中高度保守序列設計，決定擴增的特異性和敏感度。（二）分子診斷常用的免疫學檢測方法，即二對半的檢測存在窗口期擴增位置引物序列擴增片斷（bp)

P、X基因5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’2785’-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3’

C基因5’-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3’4775’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’

C基因5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3’2585’-ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA-3’

擴增位置引物序列擴增片斷（bp

有時為了證實擴增產物的特異性，對擴增產物進行以下分析：

RLFP

斑點雜交

Southern雜交

有時為了證實擴增產物的特異性，對擴增產物進行以下分析：2.支鏈DNA信號放大技術(bDNA）原理:①捕獲探針檢測②靶探針1

體系③靶探針2④bDNA分子:DNA主鏈上結合多個側鏈2.支鏈DNA信號放大技術(bDNA）原理:第九章：細菌感染的分子生物學檢驗3%，另有一個7493bp的質粒，整個基因組有894個蛋白編碼基因，其中604個(68%)編碼蛋白的功能已明確，35個(4%)編碼基因在GenBank收錄的其他細菌中有同源序列，但功能不清，剩下的255個(28%)在GenBank中沒有檢索到同源序列。喹諾酮的耐藥-DNA解旋酶的gyrA和gyrB基因（一）流感病毒基因組結構沙眼衣原體感染常缺乏特異癥狀，易形成隱匿感染，分子診斷技術敏感性和特異性高，適用于早期診斷和無癥狀攜帶者的檢查；對疑似病例的診斷和鑒別診斷。2kb雙鏈DNA病毒現已發現引起艾滋病的病毒有HIV-1、HIV-2、HIV-3三種。擴增的靶序列：編碼外膜蛋白Ⅲ的結構基因，或16SrRNA基因、CPPB基因（同時存在于染色體及質粒上）梅毒螺旋體(syphilisspirochete)是人類梅毒的病原體。流感病毒的診斷過去主要靠雞胚羊膜腔培養和血清學血凝抑制試驗，這些方法比較費時，靈敏度低，難以作出早期診斷。S區編碼外膜蛋白（HBsAg）操作簡便，省時，易于普及③env基因所編碼病毒包膜蛋白，是HIV免疫學診斷的主要檢測抗原。Dane顆粒（完整的病毒）形態所有RNA片段5’末端和3’末端高度保守；擴增的靶序列有tpp47、bmp、tpf1、tyf1、tmpA等基因。8%，共有1041個開放閱讀框，占整個基因組的92.gap基因5’-ATAATCCACCTATCCCAGATAGGAGAAATC-3’115外膜蛋白Ⅲ5’-TAAAGCAAGCCAAGGTCGCG-3’494捕獲探針固化在微孔板上靶探針1分別與捕獲探針及待測核酸雜交靶探針2分別與待測核酸及bDNA雜交形成復合物：固相支持物捕獲探針靶探針1CEs待測核酸靶探針2LEsbDNA復合物第九章：細菌感染的分子生物學檢驗捕獲探針固化在微孔板上固相操作簡便，省時，易于普及MPB蛋白基因（結核桿菌復合群特有）連接酶鏈反應(Ligasechainreaction，LCR)，是一種新的DNA體外擴增和檢測技術，主要用于點突變的研究及靶基因的擴增.衣原體是介于立克次氏體與病毒之間，能通過細菌濾器，專性活細胞內寄生的一類原核生物。準確、快速、早期診斷TB人類免疫缺陷病毒（HIV)細菌耐藥性的產生導致治療失敗、感染復發、增加昂貴抗生素的使用。3%，另有一個7493bp的質粒，整個基因組有894個蛋白編碼基因，其中604個(68%)編碼蛋白的功能已明確，35個(4%)編碼基因在GenBank收錄的其他細菌中有同源序列，但功能不清，剩下的255個(28%)在GenBank中沒有檢索到同源序列。染色體分子量980M，可編碼約5000個基因，GC含量為50%；全世界1/5人口感染，每年約300萬死于結核，中國占70%，免疫低下個體特別是HIV感染者更易于感染結核分枝桿菌。⑤動物實驗NS基因NS基因5’-CCATAGTAACCCATACGCATGCTG-3’⑥分子生物學：靈敏、特異，可進行早期診斷、分型、耐藥性檢測；5’-CCAGTAGGAGAAATCTATAAAA-3’64℃50.HBVDNA>107拷貝/ml提示病毒復制活躍；5’-TTTTCACATCTACGCGGCGG-3’受到污染分支鏈DNA信號放大技術(bDNA)操作簡便，省時，易于普及分支鏈DNA信號放大技術(bDNA)信號檢測：bDNA可結合很多酶標探針，酶催化底物（1,2-二惡二酮，dioxetane）發光，使核酸信號放大，且發光強度與DNA量成正比。優點：放大倍數確定陽性檢出率高穩定性和可重復性好操作簡便，省時，易于普及信號檢測：bDNA可結合很多酶標探針，酶催化底物（1,2-二3.基因芯片技術標本經PCR擴增后與芯片上的特異探針進行雜交，可以檢測：是否有病毒感染感染病毒的種類及亞型病毒的耐藥情況特點：可同時進行大量標本的檢測3.基因芯片技術近年來陸續上市的核苷(酸)類似物對HBV的治療壓力集中在P區。干擾素治療對HBV的壓力主要集中在前C/C區及前S區。HBV耐藥突變lamivudineadefovirentecavirtelbivudine近年來陸續上市的核苷(酸)類似物對HBV的治療壓力集中在P區YMDD

(酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸)

HBV對拉米夫定耐藥是HBVDNA聚合酶突變所致。耐藥基因位點(YMDD)位于聚合酶的C區(rtM2041或rtM204V)，分別是YMDD中的蛋氨酸(M)被異亮氨酸(I)或纈氨酸(V)所替代，形成YIDD或YVDD變異.拉米夫定作用靶位為HBVDNA聚合酶C區。有研究表明，拉米夫定與HBV逆轉錄酶的親和力與位于第552位氨基酸側鏈長度有關，異亮氨酸和纈氨酸取代蛋氨酸，使側鏈氨基酸長度縮短，使逆轉錄酶dNTP結合區增大，不適于拉米夫定結合，從而誘發耐藥性。YMDD

(酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸)HBV對條件致病菌：正常菌群與人體平衡破壞，引起疾病的一類細菌；5’-AAGGGCTTTCACCGAAGAGG-3’190(bp)免疫學方法RLFP對疑似病例的診斷和鑒別診斷。HIV表型主要依據逆轉錄酶和蛋白酶基因突變的檢測①gag基因編碼病毒的核心蛋白；操作簡便，省時，易于普及感染2周后才能逐漸產生病毒抗體；支鏈DNA信號放大技術(bDNA）DNA聚合酶圖8-3NASBA原理示意圖Dane顆粒（完整的病毒）形態疫情監控和抗癆治療療效的評價NASBA最低檢測限20拷貝/mlgag基因5’-GAACTTTAAATGCATGGGTAAA-3’342三、感染性疾病分子診斷的標本處理檢測病毒逆轉錄酶（RT）和蛋白酶（PI）基因的序列，然后把這些結果與已知的沒有發生突變的HIV（稱為野生株）基因序列進行比較，與之不同的基因序列就認為發生了突變。衣原體是介于立克次氏體與病毒之間，能通過細菌濾器，專性活細胞內寄生的一類原核生物。外膜蛋白Ⅲ5’-TAAAGCAAGCCAAGGTCGCG-3’494HBV耐藥檢測（YMDD突變檢測方法）條件致病菌：正常菌群與人體平衡破壞，引起疾病的一類細菌；HBYMDD突變檢測方法1.基因測序法2.熒光定量PCR方法基本原理確定探針特定的TM值來區分是否突變常用方法覆蓋突變位點熒光雙探針雜交

YIDDYMDDYVDD46.91℃54.64℃50.74℃YMDD突變檢測方法1.基因測序法YIDD（三）臨床意義1.早期診斷免疫學檢測敏感性：0.1μg/ml

核酸雜交檢測敏感性：0.1pg/mlPCR檢測：0.1fg/ml

因此，在感染早期即可通過DNA檢測證實病毒的存在。（三）臨床意義1.早期診斷2.監測治療效果:HBVDNA>107拷貝/ml提示病毒復制活躍；

HBVDNA＜104拷貝/ml治療有一定療效；

HBVDNA＜103拷貝/ml、HBeAg陰轉、轉氨酶正常為乙型肝炎臨床治愈指標；3.判斷病情，指導制定合理的治療方案2.監測治療效果:4.病毒耐藥性的檢測乙肝病毒DNA聚合酶YMDD處的突變是病毒產生耐藥性的重要原因，通過監測YMDD的突變情況，可以獲得病毒耐藥性方面的信息，指導抗病毒治療。感染性疾病的分子診斷課件二、流行性感冒病毒

流行性感冒病毒(Influenzavirus)，是引起流行性感冒的病原體;分為甲(A)、乙(B)和丙(C)3個型別;根據病毒顆粒表面血凝素(Haemagglutinin

，HA)和神經氨酸酶(Neuramiridase，NA)的抗原性，甲型流感病毒又可分為不同的亞型。甲型流感病毒易發生變異，致病力強，1918年發生在西方國家的大流感殺死了幾千萬人，即是由甲型流感病毒引起。

Thereare16differentH

antigens

(H1toH16)andninedifferentNantigens(N1toN9).二、流行性感冒病毒Thereare16differ感染性疾病的分子診斷課件（一）流感病毒基因組結構

單鏈RNA病毒，RNA為負鏈；有8個RNA片段或7個RNA片段；所有RNA片段5’末端和3’末端高度保守；兩種不同亞型病毒感染宿主時，會生成基因重配的新病毒；RNA基因在復制過程中常會發生點突變。

（一）流感病毒基因組結構（二）分子診斷方法可采用RT-PCR、FQ-PCR檢測流感病毒RNA。引物常按流感病毒保守的非結構基因（NS）的序列進行設計。為證實PCR擴增產物的特異性或提高檢測的靈敏度，可用限制性內切酶分析法、斑點雜交法、Southern印跡法進行擴增產物的分析。

（二）分子診斷方法擴增位置引物序列擴增片段大小NS基因

5’-AAGGGCTTTCACCGAAGAGG-3’190(bp)5’-CCCATTCTCATTACTGCTTC-3’

NS基因

5’-ATGGCCATCGGATCCTCAAC-3’241(bp)

5’-TGTCAGCTATTATGGAGCTG-3’

擴增位置引物序列DNA重復序列5’-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3’245淋病在我國性傳播疾病種中，發病率居首位。MPB蛋白基因（結核桿菌復合群特有）LCR的擴增效率與PCR相當，其產物的檢測也較方便靈敏RNA逆轉錄cDNA整合到宿主基因組中復制，以被感染細胞DNA為模板PCR擴增；連接酶鏈反應(Ligasechainreaction，LCR)，是一種新的DNA體外擴增和檢測技術，主要用于點突變的研究及靶基因的擴增.因此，在感染早期即可通過DNA檢測證實病毒的存在。水解酶或藥物修飾酶（β-內酰胺酶、氨基糖苷乙?；D移酶和藥物外排系統等）共有4033基因，功能已知的有1734個,1694個可能為新基因;合多個側鏈PCR法敏感、特異、簡便、快速，并且可用于流感病毒的分型和流行病學調查。檢測病毒逆轉錄酶（RT）和蛋白酶（PI）基因的序列，然后把這些結果與已知的沒有發生突變的HIV（稱為野生株）基因序列進行比較，與之不同的基因序列就認為發生了突變。根據病毒顆粒表面血凝素(Haemagglutinin，HA)和神經氨酸酶(Neuramiridase，NA)的抗原性，甲型流感病毒又可分為不同的亞型。常用方法：雜交、PCR、基因芯片、DNA測序分支鏈DNA信號放大技術(bDNA)特點：可同時進行大量標本的檢測人類免疫缺陷病毒（HIV)靶序列引物序列擴增片斷（bp）⑥分子生物學：靈敏、特異，可進行早期診斷、分型、耐藥性檢測；陽性結果假陽性可能性（三）臨床意義流感病毒的診斷過去主要靠雞胚羊膜腔培養和血清學血凝抑制試驗，這些方法比較費時，靈敏度低，難以作出早期診斷。

PCR法敏感、特異、簡便、快速，并且可用于流感病毒的分型和流行病學調查。

DNA重復序列5’-CGTGAGGGCATCGAGGTGG三.人類免疫缺陷病毒（HIV)HIV，humanimmunodeficiencyvirusAIDS，acquiredimmunodeficiencysyndromeHIV為艾滋病的病原體?，F已發現引起艾滋病的病毒有HIV-1、HIV-2、HIV-3三種。1998年底艾滋病感染者和艾滋病患者總數為3.340萬，已死亡1.390萬，是全球十大主要死因之一。三.人類免疫缺陷病毒（HIV)HIV，humanimmu最外層為囊膜，雙層脂蛋白，是病毒識別攻擊宿主細胞所必不可少的；其內為核衣殼。最外層為囊膜，雙層脂蛋白，是病毒識別攻擊宿主細胞所必不可少的感染性疾病的分子診斷課件2.基因組結構逆轉錄病毒，兩個拷貝的單股正鏈RNA；每個RNA長約9.7Kb，有5’帽，3’端有多聚尾；

HIV是一種高度變異的病毒；含有gag、env和pol三個基因以及6種調控基因tat,vif,vpr,vpx,nef,rev。

2.基因組結構①gag基因編碼病毒的核心蛋白；②pol基因編碼病毒復制所需要的酶類（逆轉錄酶、整合酶和蛋白酶）；③env基因所編碼病毒包膜蛋白，是HIV免疫學診斷的主要檢測抗原。④調控基因編碼輔助蛋白，調節病毒蛋白合成和復制。

①gag基因編碼病毒的核心蛋白；（二）分子診斷方法抗體的檢測：酶聯免疫吸附法（ELISA）和免疫熒光檢測法（IFA）；感染2周后才能逐漸產生病毒抗體；抗原的檢測：酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測P24抗原，靈敏度低（二）分子診斷方法抗體的檢測：酶聯免疫吸附法（ELISA）和1.病毒載量檢測感染者體內HIV的定量檢測，對病情判斷和治療效果檢測極有價值。目前常用三種技術：

RT-PCR最低檢測限50拷貝/mlbDNA最低價測限50拷貝/mlNASBA最低檢測限20拷貝/ml1.病毒載量檢測PCRRNA逆轉錄cDNA整合到宿主基因組中復制，以被感染細胞DNA為模板PCR擴增；

HIV為高變異病毒，不同患者體內分離的病毒基因結構有差異，引物設計應根據各編碼區的保守序列設計；靈敏度高，特別是用于無癥狀HIV感染者。

PCR擴增位置引物序列擴增片斷（bp)

gag基因5’-GAACTTTAAATGCATGGGTAAA-3’3425’-CCAGTAGGAGAAATCTATAAAA-3’

gap基因5’-ATAATCCACCTATCCCAGATAGGAGAAATC-3’1155’-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATCC-3’

pol基因5‘-TAGAATTCCTCAGATCACTCTT-3’3605’-GCAAGCTTATGGGCCATCCATTCC-3’

擴增位置引物序列擴增片2.病毒表型和耐藥檢測HIV表型主要依據逆轉錄酶和蛋白酶基因突變的檢測最常用的耐藥檢測方法是基因型檢測方法,即查找與病毒耐藥有關的基因突變。檢測病毒逆轉錄酶（RT）和蛋白酶（PI）基因的序列，然后把這些結果與已知的沒有發生突變的HIV（稱為野生株）基因序列進行比較，與之不同的基因序列就認為發生了突變。檢測出的任何突變都有可能導致形成HIV耐藥性，但具體結果的解釋必須要有非常有經驗的專家和醫師來進行。2.病毒表型和耐藥檢測HIV表型主要依據逆轉錄酶和蛋白酶基因RT-PCR最低檢測限50拷貝/ml最外層為囊膜，雙層脂蛋白，是病毒識別攻擊宿主細胞所必不可少的；5’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’外膜蛋白Ⅲ5’-TAAAGCAAGCCAAGGTCGCG-3’494p區編碼DNA聚合酶LCR的擴增效率與PCR相當，其產物的檢測也較方便靈敏流感病毒的診斷過去主要靠雞胚羊膜腔培養和血清學血凝抑制試驗，這些方法比較費時，靈敏度低，難以作出早期診斷。衣原體是介于立克次氏體與病毒之間，能通過細菌濾器，專性活細胞內寄生的一類原核生物。兩種不同亞型病毒感染宿主時，會生成基因重配的新病毒；產生滅活酶和鈍化酶，如-內酰胺酶；pol基因5‘-TAGAATTCCTCAGATCACTCTT-3’360PCR：可對無癥狀的感染者進行早期診斷；產生滅活酶和鈍化酶，如-內酰胺酶；現已發現引起艾滋病的病毒有HIV-1、HIV-2、HIV-3三種。AIDS，acquiredimmunodeficiencysyndrome5’-ATGGCCATCGGATCCTCAAC-3’241(bp)pre-S1pre-S1蛋白感染者體內HIV的定量檢測，對病情判斷和治療效果檢測極有價值。（三）臨床意義1.原位雜交：可以顯示病毒感染的部位；2.PCR：可對無癥狀的感染者進行早期診斷；3.病毒載量檢測：在臨床進展情況的判定及療效觀察上極有價值。RT-PCR最低檢測限50拷貝/ml（三）臨床意義1第九章：細菌感染的分子生物學檢驗概述正常菌群：存在于人體表及與外界相通部位的細菌；條件致病菌：正常菌群與人體平衡破壞，引起疾病的一類細菌；病原菌：具有毒性和侵襲力的細菌，造成人體感染；第九章：細菌感染的分子生物學檢驗概述病原菌的診斷方法：①直接涂片法②生化試驗③血清學試驗④分離培養⑤動物實驗⑥分子生物學：靈敏、特異，可進行早期診斷、分型、耐藥性檢測；不能確診或進行分型、耐藥性的檢測，或費時等病原菌的診斷方法：不能確診或進行分型、耐藥性的檢測，或費時

全世界1/5人口感染，每年約300萬死于結核，中國占70%，免疫低下個體特別是HIV感染者更易于感染結核分枝桿菌。結核分枝桿菌為革蘭氏陽性菌，細長略帶彎曲，分枝狀，有莢膜，抗酸染色陽性，對多種抗生素有抵抗力。一.結核分枝桿菌全世界1/5人口感染，每年約300萬死于結核，中國形態

形態(一)基因組結構

1.TBH37Rv株基因組是環狀雙鏈DNA，共有4411529bp;2.共有4033基因，功能已知的有1734個,1694個可能為新基因;3.基因組中有許多藥物抗性因子的編碼序列，包括水解酶或者藥物修飾酶。

(一)基因組結構感染性疾病的分子診斷課件HBVDNA3.病毒結構：大?。?0-300nmHIV表型主要依據逆轉錄酶和蛋白酶基因突變的檢測nucleicacidsequence-basedamplification(NASBA)流行性感冒病毒(Influenzavirus)，是引起流行性感冒的病原體;⑥分子生物學：靈敏、特異，可進行早期診斷、分型、耐藥性檢測；水解酶或藥物修飾酶（β-內酰胺酶、氨基糖苷乙酰基轉移酶和藥物外排系統等）逆轉錄病毒，兩個拷貝的單股正鏈RNA；nucleicacidsequence-basedamplification(NASBA)四、感染性疾病分子診斷的結果解釋感染性疾病：由某種病原體所致，通過不同方式引起人體發生感染并出現臨床癥狀的疾病。產生滅活酶和鈍化酶，如-內酰胺酶；操作簡便，省時，易于普及分支鏈DNA信號放大技術(bDNA)C基因5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3’258陰性結果假陰性可能性達有關。病毒的耐藥情況X區位編碼X蛋白，可能與病毒蛋白表5’-CCATAGTAACCCATACGCATGCTG-3’最常用的耐藥檢測方法是基因型檢測方法,即查找與病毒耐藥有關的基因突變。HBVDNA3.（二）分子診斷方法普通PCR、FQ-PCR、競爭性PCR、免疫雜交PCR

擴增靶序列：

65KDa抗原基因（細菌細胞壁上蛋白）

MPB蛋白基因（結核桿菌復合群特有）

rRNA基因（種屬鑒定）

ISDNA6110插入序列（二）分子診斷方法靶序列引物序列擴增片斷（bp）

IS6110插入5‘-CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG-3’3175’-TCAGCCGCGTCCACGCCGCCA-3’

16SrRNA5’-GGTGGTTTGTCGCGTTGTTC-3’4635’-TGCACACAGGCCACAAGGGA-3’

DNA重復序列5’-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3’2455’-GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3’

靶序列引物序列擴增片斷（bp）TB耐藥檢測利福平耐藥-RNA聚合酶rpoB基因異煙肼耐藥-katG基因鏈霉素耐藥-S12的rpsL基因

16SrRNA的rrs基因喹諾酮的耐藥-DNA解旋酶的gyrA和gyrB基因水解酶或藥物修飾酶（β-內酰胺酶、氨基糖苷乙?；D移酶和藥物外排系統等）TB耐藥檢測利福平耐藥-RNA聚合酶rpoB基因細菌耐藥基因的檢測

細菌耐藥性的產生導致治療失敗、感染復發、增加昂貴抗生素的使用。機理：由于細菌基因組的變異，導致

1.細菌細胞外膜通透性改變；

2.產生滅活酶和鈍化酶，如-內酰胺酶；

3.藥物作用靶位改變；

4.代謝途徑改變；細菌耐藥基因的檢測細菌耐藥性的產生導致治療失敗、感染復發（三）臨床意義1.準確、快速、早期診斷TB2.區分TB與其它分枝桿菌3.疫情監控和抗癆治療療效的評價（三）臨床意義1.準確、快速、早期診斷TB二、淋球菌

淋球菌是淋病的病原菌，人是淋球菌的唯一自然宿主。淋病在我國性傳播疾病種中，發病率居首位。淋球菌耐藥菌株的出現和流行對淋病的控制帶來很大困難。傳播途徑：1.直接性接觸感染

2.間接接觸感染

二、淋球菌淋球菌是淋病的病原菌，人是淋球菌感染性疾病的分子診斷課件（一）基因組結構

1.染色體分子量980M，可編碼約5000個基因，GC含量為50%；

2.無操縱子結構

3.含有1至數個質粒（2.6MDa，24.5MDa），通過質粒介導耐藥性在不同菌株間的轉移；

（一）基因組結構感染性疾病的分子診斷課件（二）分子診斷1.PCR:

擴增的靶序列：編碼外膜蛋白Ⅲ的結構基因，或16SrRNA基因、CPPB基因（同時存在于染色體及質粒上）

（二）分子診斷1.PCR:靶序列引物序列擴增片斷（bp）

CPPB基因5’-GTTTGGCTGGTTGATTCAAG-3’6335’-GCAAGATTTCCGATTTGGCG-3’

外膜蛋白Ⅲ5’-TAAAGCAAGCCAAGGTCGCG-3’4945’-TTTTCACATCTACGCGGCGG-3’

5’-CCGAAGCTCAAGACAACCTC-3’

181靶序列引物序列擴增片斷（bp）2.LCR（Ligasechainreaction

）連接酶鏈反應(Ligasechainreaction，LCR)，是一種新的DNA體外擴增和檢測技術，主要用于點突變的研究及靶基因的擴增.

2.LCR（Ligasechainreaction原理：在PCR反應體系中加入二對引物，加熱(94～95℃)使DNA變性，雙鏈打開，然后降溫退火(65℃)，引物與模板DNA結合并留下一缺口，如果引物與模板完全互補，DNA連接酶即連接封閉缺口，PCR反應接著進行，擴增出大量的目標DNA.若有點突變，引物不能與模板精確結合，缺口附近核苷酸的空間結構發生變化，連接酶不能封閉缺口，PCR反應不能進行，無擴增產物生成，據此可判斷模板DNA中有無突變.原理：在PCR反應體系中加入二對引物，加熱(94～95℃)感染性疾病的分子診斷課件（三）臨床意義1.分子診斷技術具有靈敏性高、快速、特異性好的優點，可檢測極微量的淋球菌。2.應用于以下幾方面：對菌株進行分型和耐藥性分析。抗生素治療效果的觀察。進行流行病學分析。對疑似病例的診斷和鑒別診斷。（三）臨床意義衣原體的基因檢測

衣原體是介于立克次氏體與病毒之間，能通過細菌濾器，專性活細胞內寄生的一類原核生物。沙眼衣原體是一種在人體內長期生存并又廣泛傳播的病原體，常導致人泌尿生殖道疾病及眼病，有15種血清型。衣原體的基因檢測一、基因組沙眼衣原體（血清型D）基因組大小1042Kbp，GC含量為41.3%，另有一個7493bp的質粒，整個基因組有894個蛋白編碼基因，其中604個(68%)編碼蛋白的功能已明確，35個(4%)編碼基因在GenBank收錄的其他細菌中有同源序列，但功能不清，剩下的255個(28%)在GenBank中沒有檢索到同源序列。一、基因組二、分子診斷1.PCR

擴增靶序列主要有外膜蛋白(MOMP)基因、特有質粒DNA和rRNA基因序列。rRNA基因5’-GAAGGCGGATAATACCCGCTG-3’

5’-GATGGGGTTGAGCCATCC-3’

MOMP基因

5’-GATAGCGAGCACAAAGACTAA-3’

5’-CCATAGTAACCCATACGCATGCTG-3’

二、分子診斷2.LCRLCR的擴增效率與PCR相當，其產物的檢測也較方便靈敏三、臨床意義沙眼衣原體感染常缺乏特異癥狀，易形成隱匿感染，分子診斷技術敏感性和特異性高，適用于早期診斷和無癥狀攜帶者的檢查；

2.LCR支原體的基因檢測

肺炎支原體(mycoplasmapulmonis,MP)是原發性非典型肺炎的病原體。一、基因組結構肺炎支原體M129株基因組有816394bp，G+C含量為40%，含677個開放閱讀框，39個RNA編碼基因。支原體的基因檢測肺炎支原體(mycoplasmap二、分子診斷方法1.PCR

擴增靶序列常選在16SrRNA基因組可變區與保守區、特異的染色體DNA片段、P1蛋白基因區。2.核酸雜交特異的寡核苷酸探針與樣品DNA進行斑點雜交，特異性好，但靈敏度不如PCR法。

二、分子診斷方法三、臨床意義因肺炎支原體與其他支原體存在共同抗原，免疫學方法檢測可出現假陽性和假陰性。

PCR方法簡便快速、特異、敏感，適于早期快速檢測MP。

三、臨床意義螺旋體的基因檢測梅毒螺旋體(syphilisspirochete)是人類梅毒的病原體。一、基因組結構基因組大小約1000kb，為最小的原核基因組之一，GC含量為52.8%，共有1041個開放閱讀框，占整個基因組的92.9%，每個ORF的平均大小為1023bp。螺旋體的基因檢測二、分子診斷方法1.PCR

擴增的靶序列有tpp47、bmp、tpf1、tyf1、tmpA等基因。2.核酸雜交用同位素或非同位素(如生物素、地高辛)標記的探針與待測標本的DNA或擴增后的DNA進行斑點雜交。

二、分子診斷方法三、臨床意義血清學試驗對早期梅毒診斷不敏感，對先天性和神經性梅毒的診斷特異性差。分子診斷的方法可早期診斷梅毒感染的病人，盡早根治梅毒。

三、臨床意義感染性疾病的分子診斷感染性疾病的分子診斷89感染的慨念

感染是病原體和人體之間的相互作用過程病原微生物：致病菌（條件致病菌）微生物人體微生物人體不同的感染狀態共生狀態在正常情況下，人體的一些腔道和體表均有微生物寄生感染的慨念感染是病原體和人體之間的相互作用過程微人微人不共感染性疾病：由某種病原體所致，通過不同方式引起人體發生感染并出現臨床癥狀的疾病。病原體：病毒、細菌、原蟲、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體、寄生蟲。

感染性疾?。河赡撤N病原體所致，通過不同方式引起人體發生感染并常規檢測方法：免疫學方法微生物學方法受敏感性、特異性限制，不易早期診斷，并且不易提供病原體分型及耐藥性方面的信息。常規檢測方法：感染性疾病的分子診斷策略一般性策略（檢出病原體）：判斷有無感染是何種病原體感染常用方法：PCR＋雜交完整性策略：檢出病原體分型（分類）－亞型－耐藥性常用方法：雜交、PCR、基因芯片、DNA測序感染性疾病的分子診斷策略一般性策略（檢出病原體）：感染性疾病分子診斷標志物病原體核酸分子（DNA/RNA）基因表達產物代謝物免疫應答分子細胞免疫體液免疫TT致敏T細胞淋巴因子B漿細胞IgMIgGIgAIgDIgE感染早期出現臨近恢復期出現與原蟲和蠕蟲感染有關感染性疾病分子診斷標志物病原體核酸分子（DNA/RNA）細體二、感染性疾病分子診斷的常用方法

根據目的基因是否被放大，可分為雜交法和擴增法。信號放大技術檢測方法靶分子數目不變，而檢測的探針信號放大

采用多酶、多探針或二者結合等方法來增加探針標志物的濃度使檢測信號得到放大。靶分子擴增技術檢測方法靶分子（RNA、DNA或探針）的擴增PCR、替代擴增、LCR等二、感染性疾病分子診斷的常用方法根據目的基因是否被放大擴增的靶序列：編碼外膜蛋白Ⅲ的結構基因，或16SrRNA基因、CPPB基因（同時存在于染色體及質粒上）合多個側鏈HIV表型主要依據逆轉錄酶和蛋白酶基因突變的檢測RNA逆轉錄cDNA整合到宿主基因組中復制，以被感染細胞DNA為模板PCR擴增；B型和C型主要存在于亞洲人群流感病毒的診斷過去主要靠雞胚羊膜腔培養和血清學血凝抑制試驗，這些方法比較費時，靈敏度低，難以作出早期診斷。gag基因5’-GAACTTTAAATGCATGGGTAAA-3’342外膜蛋白Ⅲ5’-TAAAGCAAGCCAAGGTCGCG-3’494衣原體是介于立克次氏體與病毒之間，能通過細菌濾器，專性活細胞內寄生的一類原核生物。PCR法敏感、特異、簡便、快速，并且可用于流感病毒的分型和流行病學調查。5’-ATGGCCATCGGATCCTCAAC-3’241(bp)有8個RNA片段或7個RNA片段；沙眼衣原體感染常缺乏特異癥狀，易形成隱匿感染，分子診斷技術敏感性和特異性高，適用于早期診斷和無癥狀攜帶者的檢查；感染性疾?。河赡撤N病原體所致，通過不同方式引起人體發生感染并出現臨床癥狀的疾病。Dane顆粒（完整的病毒）形態條件致病菌：正常菌群與人體平衡破壞，引起疾病的一類細菌；病毒載量檢測：在臨床進展情況的判定及療效觀察上極有價值。C區編碼HBeAg、HBcAg整個反應過程由三種酶控制，循環次數少，忠實性高,其擴增效率高于PCR，特異性好。5’-ATGGCCATCGGATCCTCAAC-3’241(bp)引物A

靶RNA

引物B

RNAcDNA

RT

3'5'5'5'3'5'3'5'3'cDNA

cDNA模板

5'5'3'3'5'3'引物B

RNAseH

RT

T7RNA聚合酶

100-1000RNA擴增子5'3'5'3'3'5'3'5'引物A

3'5'5'RNAseH

RNA

RNA

cDNA

cDNA

圖8-3NASBA原理示意圖引物A5’端帶有T7RNA聚合酶結合位點，3’端堿基與靶RNA3’端序列互補;引物B的堿基序列與cDNA3’端序列互補擴增的靶序列：編碼外膜蛋白Ⅲ的結構基因，或16SrRNA基因nucleicacidsequence-basedamplification(NASBA)nucleicacidsequence-basedam我國流行的主要是B和C基因型，長江以北以C型為主，長江以南以B型為主，另又少量的A型、D型和混合型。HBVDNA3.擴增的靶序列：編碼外膜蛋白Ⅲ的結構基因，或16SrRNA基因、CPPB基因（同時存在于染色體及質粒上）疾病狀況的判斷檢測出病原體的存在并不能說此病原體就是引起疾病的直接原因。DNA重復序列5’-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3’245信號檢測：bDNA可結合很多酶標探針，酶催化底物（1,2-二惡二酮，dioxetane）發光，使核酸信號放大，且發光強度與DNA量成正比。對疑似病例的診斷和鑒別診斷。我國流行的主要是B和C基因型，長江以北以C型為主，長江以南以B型為主，另又少量的A型、D型和混合型。三、感染性疾病分子診斷的標本處理分為甲(A)、乙(B)和丙(C)3個型別;常用方法：PCR＋雜交操作簡便，省時，易于普及受敏感性、特異性限制，不易早期診斷，并且不易提供病原體分型及耐藥性方面的信息。靶分子擴增技術檢測方法Dane顆粒（完整的病毒）形態病原體：病毒、細菌、原蟲、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體、寄生蟲分型（分類）－亞型－耐藥性靶序列引物序列擴增片斷（bp）NASBA的特點為操作簡便，不需特殊儀器，不需溫度循環。整個反應過程由三種酶控制，循環次數少，忠實性高,其擴增效率高于PCR，特異性好。

我國流行的主要是B和C基因型，長江以北以C型為主，長江以南以引物A

靶RNA

引物B

RNAcDNA

RT

3'5'5'5'3'5'3'5'3'cDNA

cDNA模板

5'5'3'3'5'3'引物B

RNAseH

RT

T7RNA聚合酶

100-1000RNA擴增子5'3'5'3'3'5'3'5'引物A

3'5'5'RNAseH

RNA

RNA

cDNA

cDNA

圖8-3NASBA原理示意圖引物A5’端帶有T7RNA聚合酶結合位點，3’端堿基與靶RNA3’端序列互補;引物B的堿基序列與cDNA3’端序列互補引物A靶RNA引物BRNAcDNART3'5'5'nucleicacidsequence-basedamplification(NASBA)nucleicacidsequence-basedamNASBA的特點為操作簡便，不需特殊儀器，不需溫度循環。整個反應過程由三種酶控制，循環次數少，忠實性高,其擴增效率高于PCR，特異性好。

NASBA的特點為操作簡便，不需特殊儀器，不需溫度循環。整個三、感染性疾病分子診斷的標本處理標本采集處理主要包括選擇合適的標本種類、標本量、抗凝劑等及對標本進行合適的傳送、保存和預處理。三、感染性疾病分子診斷的標本處理標本采集處理主要包括選擇合適四、感染性疾病分子診斷的結果解釋1.陰性結果假陰性可能性方法的靈敏度太低方法失敗目標分子2.陽性結果假陽性可能性方法的特異性受到污染四、感染性疾病分子診斷的結果解釋1.陰性結果假陰性可能性3.定性檢測結果有時不能提供病原體活力相關信息臨床治療病情緩解后一定時間內，在患者樣本中仍可以檢測出相應的病原體。有些病原體潛伏在進體內，沒有臨床癥狀。4.疾病狀況的判斷檢測出病原體的存在并不能說此病原體就是引起疾病的直接原因。該病原體可能是一種正常菌群

3.定性檢測結果有時不能提供病原體活力相關信息五、感染性疾病分子診斷的臨床應用及評價用于感染性疾病治療的監控和預測、病情發展過程的危險性評價及疾病預后等。耐藥性的檢測細菌的分型流行病調查五、感染性疾病分子診斷的臨床應用及評價用于感染性疾病治療的監第一節病毒的基因檢測人類許多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝炎、腦炎、流行性感冒等等，占人類傳染疾病的75%左右。400多種不同病毒。病毒結構：大?。?0-300nm

核心區：核酸（DNA或RNA）外周衣殼：蛋白質包膜：脂質（鑲嵌有蛋白質）第一節病毒的基因檢測人類許多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝

我國是HBV高流行區，50%－70%的人受過感染，8%－10%是HBV攜帶者，肝炎患者中60%是慢性肝炎患者，導致肝硬變，HBV又與原發性肝癌密切相關。外殼（HBsAg):外殼蛋白成分為表面抗原核心（HBcAg)：DNADNA聚合酶

HBcAg一、乙型肝炎病毒我國是HBV高流行區，50%－70%的人受過感染，8Dane顆粒（完整的病毒）形態HBsAgHBcAgHBVDNADNAPol（外膜蛋白）（核衣殼蛋白）完整的乙肝病毒顆粒直徑42納米由雙層外殼和一個核心組成的，核心直徑為27納米，內含DNA雙鏈和DNA多聚酶Dane顆粒（完整的病毒）形態HBsAgHBcAgHBVD（一）病毒基因組結構3.2kb雙鏈DNA病毒不完全雙連環狀DNA

長鏈L為負鏈：有4個開放閱讀框S、C、P、XS區編碼外膜蛋白（HBsAg）

C區編碼HBeAg、HBcAgp區編碼DNA聚合酶

X區位編碼X蛋白，可能與病毒蛋白表達有關。短鏈S為正鏈：長短不一（一）病毒基因組結構3.2kb雙鏈DNA病毒gap基因5’-ATAATCCACCTATCCCAGATAGGAGAAATC-3’115操作簡便，省時，易于普及最外層為囊膜，雙層脂蛋白，是病毒識別攻擊宿主細胞所必不可少的；條件致病菌：正常菌群與人體平衡破壞，引起疾病的一類細菌；病毒載量檢測：在臨床進展情況的判定及療效觀察上極有價值?？股刂委熜Ч挠^察。檢測②靶探針1⑥分子生物學：靈敏、特異，可進行早期診斷、分型、耐藥性檢測；我國是HBV高流行區，50%－70%的人受過感染，8%－10%是HBV攜帶者，肝炎患者中60%是慢性肝炎患者，導致肝硬變，HBV又與原發性肝癌密切相關。包裹后的前基因mRNA細菌耐藥性的產生導致治療失敗、感染復發、增加昂貴抗生素的使用。喹諾酮的耐藥-DNA解旋酶的gyrA和gyrB基因擴增的靶序列有tpp47、bmp、tpf1、tyf1、tmpA等基因。HIV表型主要依據逆轉錄酶和蛋白酶基因突變的檢測四、感染性疾病分子診斷的結果解釋支鏈DNA信號放大技術(bDNA）16SrRNA的rrs基因gag基因5’-GAACTTTAAATGCATGGGTAAA-3’342telbivudineF型僅見于中南美洲的土著人最外層為囊膜，雙層脂蛋白，是病毒識別攻擊宿主細胞所必不可少的；pre-s1

pre-s2S

P

C

pre-c

XHBVDNA3.2kbpre-S1pre-S1蛋白pre-S2pre-S2蛋白SHBsAgpre-CHBeAgCHBcAgPDNAPXHBxAgHBV基因組結構gap基因5’-ATAATCCACCTATCCCAGATAGHBV基因分型HBV基因序列差異的多少，可將HBV劃分為不同的基因型，至今為止已發現A、B、C、D、E、F、G、H共8種基因型：A型主要存在于白人，B型和C型主要存在于亞洲人群E型主要存在于西非F型僅見于中南美洲的土著人G型和H型很少見不同基因型序列長度不同，主要是前S1區的不同。我國流行的主要是B和C基因型，長江以北以C型為主，長江以南以B型為主，另又少量的A型、D型和混合型。西北和西南尤其是西北有較高比例的D型HBV基因分型HBV基因序列差異的多少，可將HBV劃分為不HBV在肝細胞內的復制A(n)mRNAcccDNAHBsAg

包膜負鏈DNA包裹后的前基因

mRNA傳染性HBV病毒顆粒傳染性HBV病毒顆粒部分雙鏈DNA逆轉錄酶DNA聚合酶肝細胞HBV在肝細胞內的復制A(n)mRNAcccDNAHBsAg（二）分子診斷常用的免疫學檢測方法，即二對半的檢測存在窗口期，不易早期診斷。1.PCR

采用普通PCR、FQ-PCR、競爭性PCR、免疫雜交PCR，可提供直接、準確的病原學診斷證據。引物是根據S、C、P、X基因中高度保守序列設計，決定擴增的特異性和敏感度。（二）分子診斷常用的免疫學檢測方法，即二對半的檢測存在窗口期擴增位置引物序列擴增片斷（bp)

P、X基因5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’2785’-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3’

C基因5’-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3’4775’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’

C基因5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3’2585’-ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA-3’

擴增位置引物序列擴增片斷（bp

有時為了證實擴增產物的特異性，對擴增產物進行以下分析：

RLFP

斑點雜交

Southern雜交

有時為了證實擴增產物的特異性，對擴增產物進行以下分析：2.支鏈DNA信號放大技術(bDNA）原理:①捕獲探針檢測②靶探針1

體系③靶探針2④bDNA分子:DNA主鏈上結合多個側鏈2.支鏈DNA信號放大技術(bDNA）原理:第九章：細菌感染的分子生物學檢驗3%，另有一個7493bp的質粒，整個基因組有894個蛋白編碼基因，其中604個(68%)編碼蛋白的功能已明確，35個(4%)編碼基因在GenBank收錄的其他細菌中有同源序列，但功能不清，剩下的255個(28%)在GenBank中沒有檢索到同源序列。喹諾酮的耐藥-DNA解旋酶的gyrA和gyrB基因（一）流感病毒基因組結構沙眼衣原體感染常缺乏特異癥狀，易形成隱匿感染，分子診斷技術敏感性和特異性高，適用于早期診斷和無癥狀攜帶者的檢查；對疑似病例的診斷和鑒別診斷。2kb雙鏈DNA病毒現已發現引起艾滋病的病毒有HIV-1、HIV-2、HIV-3三種。擴增的靶序列：編碼外膜蛋白Ⅲ的結構基因，或16SrRNA基因、CPPB基因（同時存在于染色體及質粒上）梅毒螺旋體(syphilisspirochete)是人類梅毒的病原體。流感病毒的診斷過去主要靠雞胚羊膜腔培養和血清學血凝抑制試驗，這些方法比較費時，靈敏度低，難以作出早期診斷。S區編碼外膜蛋白（HBsAg）操作簡便，省時，易于普及③env基因所編碼病毒包膜蛋白，是HIV免疫學診斷的主要