核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶活性的測定核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶（ribulose-1，5-bisphosphalecarboxylase，RuBPCase）是光合作用碳代謝中的重要的調(diào)節(jié)酶，是植物中最豐富的蛋白質(zhì)，主要存在于葉綠體的可溶部分，總量約占葉綠體可溶蛋白50%~60%。本實驗分別用分光光度法和同位素法測定酶的羧化能力。I.分光光度法一、原理在RuBPCase的催化下，1分子的核酮糖-1，5-二磷酸（RuBP）與1分子的CO2結(jié)合，產(chǎn)生2分子的3-磷酸甘油酸（PGA），PGA可通過外加的3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的作用，產(chǎn)生甘油醛-3-磷酸，并使還原型輔酶I（NADH）氧化，反應如下：這里1分子CO2，被固定，就有2分子還原型輔酶1被氧化。因此，由輔酶1氧化的量就可計算RuBPCase的活性，由340nm吸光度的變化可計算還原型輔酶I氧化的量。為了使NADH的氧化與CO2之的固定同步，從而需要加入磷酸肌酸（Cr~P）和磷酸肌酸激酶的ATP再生系統(tǒng)。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料菠菜葉片、小麥及水稻葉片。（二）儀器設(shè)備紫外分光光度計，冷凍離心機，勻漿器，移液管，秒表。試劑（1）5mmol/LNADH。（2）25mmol/LRuBP。（3）0.2mol/LNaHCO3。（4）RuBPCase提取介質(zhì)：40mmol/L（pH7.6）Tris-HCl緩沖溶液，內(nèi)含10mmol/LMgCl2、0.25mmol/LEDTA、5mmol/L谷胱甘肽。（5）反應介質(zhì)：100mmol/LTris-HCl緩沖液，內(nèi)含12mmol/LMgCl2。和0.4mmol/LEDTA·Na2,pH7.8。（6）160u/ml.磷酸肌酸激酶溶液。（7）160u/mL甘油醛-3-磷酸脫氫酶溶液。(8)50mmol/LATP。（9）50mml/L磷酸肌酸。（10）160u/mL磷酸甘油酸激酶溶液。菠菜的RuBPCase提取液。三、實驗步驟1.酶粗提液的制備取新鮮菠菜葉片10g，洗凈擦干，放勻漿器中，加入10mL預冷的提取介質(zhì)，高速勻漿30s，停30s，交替進行3次；勻漿經(jīng)4層紗布過濾，濾液于20000×g4℃下離心15min，棄沉淀；上清液即酶粗提液，置0℃保存?zhèn)溆谩uBPCase活力測定按表2-14-1配制酶反應體系。將配制好的反應體系播勻，倒人比色杯內(nèi)，以蒸餾水為空白，在紫外分光光度計上340nm處反應體系的吸光度作為零點值。將0.1ml.RuBP加于比色杯內(nèi)，并馬上計時，每隔30s測一次吸光度，共測3min。以零點到第一分鐘內(nèi)吸光度下降的絕對值計算酶活力。由于酶提取液中可能存在PGA，會使酶活力測定產(chǎn)生誤差，因此除上述測定外，還需做一個不加RaBP的對照。對照的反應休系與上述酶反應體系完全相同，不同之處只是把酶提取液放在最后加，加后馬上測定此反應體系在340mm處的吸光度，并記錄前一分鐘內(nèi)吸光度的變化量，計算酶活力時應減去這一變化量。四、結(jié)果計算二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料菠菜葉。（二）儀器設(shè)備液體閃爍儀，冷凍離心機，水浴鍋，移液管。（三）試劑（1）0.5mol/LTris-HCl緩沖液，pH7.8。（2）10mmol/LRuBP。（3）0.1mol/LNaHΛ14'CO3（25μCi/mL）。（4）0.1mol/LMgCl2。（5）20mmol/LDTT。（6）6mol/LHCl)（7）2-苯基-5-（4-二苯基）-1，3，4-噻二唑。（8）1，4-雙-2-（5-苯基噻唑基）苯。（9）1，4-二氧六環(huán)。（10）茶。三、實驗步驟在總體積為100μl的反應混合液中，含有：10μmol/ETris-HCl緩沖液（pH7.8），1μmol/LMgCl2，4μmol/LNaHΛ14CO3，0.2μmol/LDTT和10μL稀釋酶液。混合液在25℃下預溫10min，使酶活化，再加入0.1μmolRuBP為反應開始。反應5min后，加入100μL6mol/LHCl終止反應。終止反應后的反應液在閃爍管中于90℃下干燥，并除去未固定的CO2。干燥后，向管中加入0.1mL蒸餾水，使之溶解，再加入5