《水質丙烯酰胺的測定固相萃取-高效液相色譜-質譜/質譜法》

編制說明（送審稿）《水質丙烯酰胺的測定高效液相色譜-質譜/質譜法》

標準編制組2012年10月TOC\o"1-5"\h\z\o"CurrentDocument"1項目背景 1\o"CurrentDocument"任務來源 1\o"CurrentDocument"工作過程 12標準制訂的必要性分析 1\o"CurrentDocument"丙烯酰胺的環境危害 1\o"CurrentDocument"相關環保標準和環保工作的需要 2\o"CurrentDocument"新建標準方法的優勢 2\o"CurrentDocument"3國內外相關分析方法實施情況與存在問題 2\o"CurrentDocument"4標準制訂的基本原則和技術路線 3\o"CurrentDocument"標準制訂的基本原則 3\o"CurrentDocument"標準的適應范圍和主要技術內容 3\o"CurrentDocument"標準制訂的技術路線 3\o"CurrentDocument"5方法研究報告 5\o"CurrentDocument"方法研究的目的 5\o"CurrentDocument"方法原理 5\o"CurrentDocument"試劑和材料 5\o"CurrentDocument"儀器和設備 6\o"CurrentDocument"樣品 6\o"CurrentDocument"分析步驟 7\o"CurrentDocument"結果計算與表述 9\o"CurrentDocument"檢出限、精密度和準確度 10\o"CurrentDocument"質量保證和質量控制 12\o"CurrentDocument"6方法驗證 12\o"CurrentDocument"方法驗證方案 13\o"CurrentDocument"方法驗證過程 13\o"CurrentDocument"7標準主要技術內容的解釋 13\o"CurrentDocument"8對實施本標準的建議 149質量保證和質量控制 14\o"CurrentDocument"空白 14\o"CurrentDocument"加標 14\o"CurrentDocument"平行樣 14\o"CurrentDocument"校準標準點 14\o"CurrentDocument"10參考文獻 14《水質丙烯酰胺的測定高效液相色譜-質譜/質譜法》

編制說明.項目背景任務來源《水質丙烯酰胺的測定高效液相色譜-質譜/質譜法》標準的制定工作，是按照陜西省質量技術監督局陜質監標【2011】第6號文《關于下達2011年第一批地方標準修制訂計劃的通知》規定起草的，由陜西省環境監測中心站負責制定，項目計劃編號為25號。工作過程標準制定任務下達后，陜西省環境監測中心站立即成立了標準編制組。編制組在查閱國內外相關文獻、標準的基礎上，制定實施方案，進行開題論證。按照方案，進行了方法的條件優化實驗，確定方法藍本，然后在實驗室內和實驗室間進行方法的驗證實驗，最后，根據驗證結果，完成標準（征求意見稿）的編制。2.標準制訂的必要性分析丙烯酰胺的環境危害丙烯酰胺，分子式：C3H5NO,分子量為71.08,為白色結晶固體，無氣味，熔點：84.5℃，飽和蒸汽壓：0.21Kpa（84.5℃）。溶于水、乙醇、乙醚、丙酮等，但不溶于苯。丙烯酰胺是聚丙烯酰胺的單體，聚丙烯酰胺是一種水溶性高分子聚合物，主要應用于水的凈化處理方面。據統計，在發達國家水處理應用方面，美國占聚丙烯酰胺總用量的36%、西歐占35%、日本占49%；近年來，聚丙烯酰胺在我國水處理方面應用也越來越廣泛，雖然聚丙烯酰胺被認為是無毒的，但其單體的毒性卻是被肯定的；丙烯酰胺已被國家癌癥中4（IARC）列為W類致癌物，急性毒性實驗證明丙烯酰胺有神經毒性、生殖、發育毒性，動物實驗證明丙烯酰胺可導致遺傳物質的改變和癌癥的發生。在飲用水和地表水中，丙烯酰胺主要來源于使用有丙烯酰胺單體殘留的聚丙烯酰胺絮凝劑。所以水中丙烯酰胺的分析是環境分析中的一項重要內容。相關環保標準和環保工作的需要由于丙烯酰胺對環境的危害較大，它已被我國列入水中優先控制的污染物。我國的《地表水環境質量標準》（GB3838-2002）規定丙烯酰胺的標準限值為0.0005mg/L。在環境分析中還沒有建立相關的國家及地方標準分析方法。因此，建立快速、靈敏的水中丙烯酰胺的監測分析方法，對了解水環境的質量，保護水質環境安全，保障公眾飲水安全，對人群健康的影響具有重要的意義。新建標準方法的優勢HPLC-MS/MS分析水樣中的丙烯酰胺，其優勢是：（1）提高了分析效率。由于取樣量少，大大縮短了分析時間。（2）定性準確，在不能完全將干擾物質分離的情況下仍可以準確定性定量，掃描方式可以選擇多反應監測（MRM）；抗干擾能力非常強。（3）檢出限更低，三重四級桿質譜具有非常高的靈敏度，因此，檢出限可達0.008口g/L,而GC方法檢出限為0.15口g/L（取樣量100ml水），HPLC方法檢出限為0.1口g/L（取樣量300mL）。.國內外相關分析方法實施情況與存在問題關于水中丙烯酰胺的測定，國外多采用氣相色譜法、高效液相色譜法等方法進行測定；如美國EPA8032A用氣相色譜法，前處理采用澳化衍生-液液萃取。EPA8316采用高效液相色譜法，但其主要檢測對象為除水外的其它基質，而且方法檢出限高達10口g/L。國內關于水中丙烯酰胺的測定主要是氣相色譜法，氣相色譜-質譜法。《生活飲用水衛生規范》（中華人民共和國衛生部2001）中，采用澳化衍生■液液萃取-氣相色譜法測定飲用水中的丙烯酰胺；中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準《食品中丙烯酰胺的測定方法同位素內標法》（SN/T2096-2008）中使用氣相色譜儀-質譜法。前處理采用石墨化碳黑層析柱凈化，凈化液中的丙烯酰胺經澳水衍生化后，用同位素標記的內標法，氣相色譜-質譜聯用儀檢測。以上GC和GC-MS測定丙烯酰胺，一般都需要經過繁瑣的澳化衍生-液液萃取過程，測定周期長，復雜的前處理過程也造成方法精密度、準確度等性能不穩定；HPLC方法，定性能力差，檢出限高。.標準制訂的基本原則和技術路線標準制訂的基本原則（1）方法檢出限和測定范圍滿足《地表水環境質量標準》（GB3838-2002）等相關環保標準和環保工作的要求。（2）方法準確可靠、滿足各項方法特性指標的要求。（3）方法具有普遍適用性，易于推廣使用。（4）標準的格式按照《環境監測分析方法標準制修訂技術導則》（HJ/T168-2010）、《標準化工作導則第1部分：標準的結構和編寫》（GB/T1.1-2009）的要求制定。標準的適用范圍和主要技術內容（1）本標準規定了測定地表水及飲用水中丙烯酰胺的固相萃取-高效液相色譜-質譜/質譜法的范圍、方法原理、試劑和材料、儀器和設備、樣品、分析步驟、結果計算、準確度和精密度、質量保證和質量控制。（2）本標準采用高效液相色譜-質譜/質譜法，側重儀器分析條件的建立以及質量保證和質量控制，同時兼顧便捷、準確的可操作性。標準制訂的技術路線本標準的制訂是在查閱國內外相關文獻的基礎上，制定實驗方案，進行實驗室內的條件優化實驗、驗證試驗后，編制標準的草稿，再通過實驗室間的驗證試驗，完成標準（征求意見稿）的編制。通過在全省進行標準征求意見稿的意見征求、匯總、修訂，完成標準送審稿的編制。陜西省質量技術監督局組織專家對標準送審稿進行評審，標準編制組根據評審意見，進行修改完善，最后形成標準報批稿。技術路線圖見下圖。標準管理部門下達制訂計劃成立標準編制組標準編制組進行文獻調研標準編制組通過初步實驗完善和確定實驗方案開題論證，確定方法驗證技術路線和疑難問題解決途徑進行實驗室內驗證，完善實驗方案標準主編單位按要求選擇驗證實驗室，開展實驗室間驗證工作標準編制組編寫標準征求意見稿及編制說明標準編制組對征求的意見進行匯總，形成送審稿及編制說明送審稿經審查合格后，提交報批稿及編制說明報批稿經審查合格后標準管理部門進行批準、編號、發布.方法研究報告方法研究的目的(1)本標準適用于地表水和飲用水中丙烯酰胺的測定。(2)通過本標準的制訂，使該監測方法的檢出限、精密度、準確度等滿足地表水及飲用水等環境質量控制標準中對丙烯酰胺的測定要求。我國的《地表水環境質量標準》(GB3838-2002)規定丙烯酰胺的標準限值為0.0005mg/L。制訂后的標準中，按《環境監測分析方法標準制修訂技術導則》(HJ168-2010)附錄A要求測定方法檢出限，丙烯酰胺的檢出限為0.008Hg/L,以4倍檢出限作為測定下限，測定下限為0.032ug/L,測定下限可滿足環境質量標準對丙烯酰胺的監測要求。方法原理本方法采用Sep-PakAC2-Plus固相萃取小柱對水樣中的痕量丙烯酰胺進行富集，使用甲醇洗脫，洗脫液濃縮至剛干為宜，迅速加1mL超純水定容，過PTFE一次性濾膜后，目標物經過HPLC分離進入三重四級桿質譜檢測器，定性定量分析。試劑和材料除非另有說明，分析時均使用符合國家標準的HPLC-MS專用試劑和高純水。甲醇HPLC級。甲酸HPLC-MS專用。0.45um一次性PTFE微孔濾膜水系。固相萃取小柱SampliQC18ODS500mg/6mL固相萃取小柱；Oasis(R)HLB6cc(150mg)固相萃取小柱；Sep-PakAC2-Plus固相萃取小柱。丙烯酰胺標準溶液，P=1000.0mg/L市售有證丙烯酰胺標準溶液，濃度為P=1000.0mg/L,介質為甲醇，在4℃冰箱中保存。丙烯酰胺標準貯備溶液，P=1.0mg/L準確吸取丙烯酰胺標準溶液（5.3.5）100HL于100mL容量瓶中，用純水稀釋至標線，在4℃冰箱中保存。儀器和設備高效液相色譜-質譜/質譜聯用儀（三重四極桿質譜）。色譜柱的選用。選用反相ODS柱即十八烷基硅烷化學鍵合相色譜柱，規格150mm（柱長）義2.1mm（內徑），5.0Hm（粒徑）。樣品樣品采集及保存樣品應采集在棕色玻璃容器中。采樣前用待測水樣將樣品瓶清洗2?3次。采樣后，水樣應充滿樣品瓶并加蓋密封，置于4℃冰箱內避光保存。樣品制備關于取樣量的選擇由于HPLC-MS/MS具有極低的檢出限，因此取用10mL水樣進行固相萃取等前處理步驟，即滿足定性定量要求。固相萃取條件的優化飲用水及地表水中的丙烯酰胺采用直接進樣法就能滿足分析需要，但實驗發現，大部分地表水及飲用水對丙烯酰胺具有基質抑制效應，加標回收率僅能達到50%左右；而且隨著加標濃度增大抑制效應越明顯；因此，如果不考慮基質抑制作用，就會大大低估水中丙烯酰胺的濃度，故需要考慮固相萃取法對樣品進行前處理。固相萃取小柱及洗脫溶液選擇A.固相萃取小柱的選擇本實驗采用SampliQC18ODS500mg/6mL,Oasis（R）HLB6cc（150mg）,Sep-PakAC2-Plus三種固相萃取小柱（5.3.5）,先用10mL甲醇（5.3.2）,再用10mL水對其活化，留5mL水浸泡固相萃取小柱15min后上樣過柱富集，小柱吹干后，用10mL甲醇（5.3.2）洗脫，洗脫液氮吹至干，力D1mL超純水定容，過0.45um一次性微孔濾膜（5.3.4）過濾，上機測定。從萃取效果來看，用Sep-PakAC2-Plus柱萃取樣品加標回收率能達到70%以上，而其它兩種都低于5%。因此本實驗選擇Sep-PakAC2-Plus萃取小柱，見表1。表1不同萃取小柱對加標水樣的回收率比較小柱規格C18HLBAC2丙烯酰胺加標回收率5%?7%10%?15%70%?95%B.洗脫液用量的選擇分別用2mL、4mL、6mL、8mL、10mL、12mL、15mL的甲醇對富集的目標物進行洗脫，結果發現，隨著洗脫液用量的增加回收率越高，當洗脫液用量大于10mL時，回收率達到最高，且相差不大，為了節約氮吹時間，提高效率并保證回收率，本實驗洗脫劑用量選擇為10mL。5.6分析步驟有關色譜-質譜條件流動相條件選擇分別使用水-甲醇、5mmol/L乙酸銨水溶液-甲醇、5mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-甲醇等做流動相，發現用0.1%甲酸水溶液-甲醇梯度洗脫，靈敏度高，峰對稱性好，見標準色譜圖1,流動相梯度洗脫程序見表1。丙烯酰胺的保留時間為1.63min。

圖1丙烯酰胺標準溶液色譜圖表2流動相梯度洗脫程序時間(min)流速(UL/min)0.1%甲酸溶液（％）甲醇（％）0.004009910.404009912.5040040602.514009915.00400991質譜條件優化離子化模式：電噴霧電離正離子模式（ESI+）；質譜掃描方式：多反應監測（MRM），母離子（Parent）（m/z）:72.375 子離子（Product）（m/z）:55.487碰撞能量（CollisionEnergy）:11V 管狀透鏡電壓（Tubelens）:65V鞘氣（Sheathgas）：35psi 輔助氣（Auxiliarygas）:10arb毛細管溫度￡2口］廿2rTemperature）：350℃分辨率（FWHM）：0.70。蒸發器溫度（VaporizerTemperature）:450℃極性：正噴霧電壓（SprayVoltage）（V）:3500進樣量選擇由于質譜為質量型檢測器，進樣量越大，響應值越高，因此，加大進樣量能最大限度的提高方法檢出限，但進樣量過大會加大色譜峰的拖尾;分別選擇5uL、10uL、25uL、50uL、100HL進樣量上機測定，實驗證明，50uL進樣量響應值高，且峰對稱性好，而進樣100HL時，峰拖尾嚴重。因此，進樣量選擇50uL。5.6.2標準曲線建立將丙烯酰胺標準貯備液（5.3.6）用甲醇（5.3.2）逐級稀釋，最后用純水配制濃度分別為0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16、制Hg/L的使用液，以峰面積對濃度作線性回歸分析，回歸方程見表3,標準曲線見圖2。表3丙烯酰胺標準曲線測定編號12345678濃度（ug/L）0.20.51.02.04.08.016.020.0峰面積13033356617633314409329755856698311337411499140線性方程Y=73414X-3617線性相關系數r=0.99965.6.3每次分析前用中間濃度的標準溶液作常規校準試驗和空白試驗：采用和樣品分析相同的試劑和步驟，制備全程序空白溶液，并做為日常的質控手段。結果計算與表述制定的標準中采用以樣品的保留時間和標樣的保留時間相比及特征離子來定性。用作定性的保留時間窗口寬度以當天測定標樣的實際保留時間變化為基準。制定的標準中采用外標標準曲線法按式(1)來定量水中丙烯酰胺的濃度。P=(Y-a)V/(KXV) (1)t s式中：P 水樣中丙烯酰胺的濃度，ug/L；Y 水樣中丙烯酰胺的峰面積；a 校準曲線截距；Vt 洗脫液濃縮定容后的體積，mL；Vs 水樣體積，mL；K 校準曲線斜率。檢出限、精密度和準確度檢出限按照《環境監測分析方法標準制修訂技術導則》(H168-2010)要求，方法分別測定空白加標濃度為0.02口g/L的水樣8份，剔除離群值后，統計8份水樣的標準偏差S,此時檢出限MDL=SX2.998。具體數據及結果見表2。表2檢出限測試數據平行號試樣0.02ug/L測定結果(ug/L)10.01520.00830.01440.01450.01260.01370.00980.014平均值乂(ug/L)0.012標準偏差S(ug/L)0.003檢出限0.008-10-

室內精密度和準確度測定(1)精密度測定取某地地表水10mL,各七份，分別加入一定量的標準物質，按樣品步驟進行測定，計算其相對標準偏差，見表3。表3.精密度測試數據平行號試樣0.040ug/L2.000ug/L測定結果(ug/L)10.0361.7620.0351.8430.0321.8140.0311.9150.0321.9060.0341.92平均值乂(ug/L)0.0331.86標準偏差S(ug/L)0.0020.064相對標準偏差(％)6.13.4(2)準確度測定取兩個不同水樣(飲用水和地表水)，各七份，分別加入一定量的標準物質，按樣品分析步驟測定其回收率，分析結果見表4。表4實際樣品加標測試數據平行號實際樣品類型飲用水地表水樣品加標樣品回收率(%)樣品加標樣品回收率(%)測定結果(ug/L)10.008ND0.03485.00.008ND1.4773.520.008ND0.03280.00.008ND1.7788.530.008ND0.03280.00.008ND1.5075.040.008ND0.03280.00.008ND1.5376.550.008ND0.03382.50.008ND1.7286.060.008ND0.03177.50.008ND1.6884.0平均值(ug/L)0.008ND0.03280.80.008ND1.6180.6加標量(ug/L)0.0402.000測定結果相對標準偏差「RSD1(%)3.17.9-11-說明:力Xi（1）測定均值X計算公式為：X=i^—n'X1—X）2（2）標準偏差S計算公式為：S=i\n-1S（3）相對標準偏差RSD計算公式： RSDT=，100%X（4）加標回收率二（加標試樣測定值-試樣測定值）/加標量X100%室間精密度和準確度測定（1）精密度測定在飲用水中分別加入一定量丙烯酰胺標準溶液制得水樣1和水樣2,由西省環境監測中心站、西安市環境監測站、渭南市環境監測站、寶雞市環境監測站、漢中市環境監測站、商洛市環境監測站等6個實驗室分別對其進行6次測定，水樣1實驗室內相對標準偏差為：5.6%-9.1%,實驗室間相對標準偏差為：6.3%,重復性限為：0.006ug/L,再現性限為：0.008ug/L；水樣2實驗室內相對標準偏差為：6.7%-11.7%,實驗室間相對標準偏差為：2.8%。重復性限：0.403ug/L,再現性限：0.403ug/L。（2）準確度測定在飲用水中分別加入一定量丙烯酰胺標準液而制得水樣1和水樣2,由其6個實驗室分別對其進行6次加標回收率測定，水樣1加標回收率在70.0%-97.5%之間，加標回收率最終值為80.8%±9.3%；水樣2加標回收率在73.0%-98.0%之間，加標回收率最終值為83.0%±4.6%。（實驗數據詳見各實驗室驗證報告）質量保證和質量控制（QA/QC）方法根據HPLC-MS/MS定性、定量分析特點和分析過程技術關鍵點，從空白干擾消除、儀器性能、校準曲線檢查等幾個方面制訂了質量保證和質量控制的建議和要求。本次制定的標準，將QA/QC單獨列為方法的一個主要內容。.方法驗證-12-方法驗證方案參與方法驗證的實驗室基本情況按照《環境監測分析方法標準制修訂技術導則》（HJ168）和《國家環境污染物監測方法標準制修訂工作暫行要求》（環科涵[2009]10號）的要求，組織6家實驗室進行驗證，陜西省環境監測中心站、西安市環境監測站、寶雞市環境監測站、渭南市環境監測站、漢中市環境監測站、商洛市環境監測站。根據影響方法精密度和準確度的主要因素和數理統計學的要求，編制方法驗證報告，驗證數據主要包括精密度、準確度等。方法驗證方案方法檢出限：按照《環境監測分析方法標準制修訂技術導則》（H168-2010）要求，方法分別測定空白加標濃度為0.02口g/L的水樣8份，剔除離群值后將各自的8次測定結果計算其標準偏差S,此時檢出限MDL=SX2.998。方法的測定下限：參照HJ168-2010,以4倍方法檢出限確定為本方法目標物的測定下限。方法精密度和準確度：取某地地表水10mL,各六份，分別加入一定量的標準物質，按樣品步驟進行測定，計算其相對標準偏差。加標回收率：取10mL水樣各6份，加入標準品使其濃度為0.040Hg/L、2.000Hg/L,進行全程序分析，剔除離群值后將測定結果分別計算平均值、標準偏差、相對標準偏差、加標回收率等。方法驗證過程首先，通過篩選確定方法驗證單位。按照方法驗證方案準備實驗用品，與驗證單位確定驗證時間。在方法驗證前，參加驗證的人員應熟悉和掌握方法原理、操作步驟及流程。方