第六章蛋白酶地位蛋白酶是食品工業(yè)中最重要的一類酶。應(yīng)用廣泛，如干酪生產(chǎn)、肉類嫩化、植物蛋白質(zhì)改性等大量使用。存在廣泛植物：菠蘿、木瓜、無花果動(dòng)物：消化道---胃蛋白酶、胰凝乳酶、羧肽酶、氨肽酶等。微生物：細(xì)菌、霉菌、酵母、放線菌。蛋白酶

水解蛋白質(zhì)中肽鍵。

2、氨基酸的構(gòu)型

蛋白酶的底物---蛋白質(zhì)和多肽是由L-氨基酸構(gòu)成的。3、底物分子的大小一般沒有要求。但酸性蛋白酶有嚴(yán)格要求。4、X和Y的性質(zhì)要求X、Y可以分別是-H、-OH，也可以繼續(xù)衍生出去。肽鏈內(nèi)切酶：X和Y必須繼續(xù)衍生出去，X可以是?；虬被釟埢?，Y可以是酰胺基或酯基或氨基酸殘基。肽鏈端解酶：X和Y分別是-H或-OH

羧肽酶：要求Y是-OH，特異性表現(xiàn)在R2側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的要求上，在X不是-H時(shí)，才表現(xiàn)出高的活力。氨肽酶：要求X是-H，并不優(yōu)先選擇Y不是-OH的底物，特異性表現(xiàn)在R1側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的要求上。5、對(duì)肽鍵的要求多數(shù)蛋白酶不僅能水解肽鍵，還能作用于酰胺（-CONH2）、酯（-COOR）、硫羥酸酯（-COSR）和異羥污酸（-CONHOH）等。胃蛋白酶和其它一些酸性蛋白酶對(duì)水解鍵有較高識(shí)別能力。如肽鍵→酯鍵，即使R2滿足要求也不能作為底物。二、蛋白酶的分類1、根據(jù)水解蛋白質(zhì)的方式分類（1）肽鏈內(nèi)切酶：與蛋白質(zhì)內(nèi)部的肽鍵反應(yīng)，水解蛋白質(zhì)為多肽類或肽類。

（2）肽鏈端解酶：從肽鏈的一個(gè)末端開始將氨基酸水解下來。羧肽酶：從肽鏈的羧基末端開始。

氨肽酶：從肽鏈的氨基末端開始。（3）水解蛋白質(zhì)或多肽酯鍵的酶（4）水解蛋白質(zhì)或多肽酰胺鍵的酶2、根據(jù)來源分類（1）植物：菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶（2）動(dòng)物：胃蛋白酶、凝乳酶（胃）、胰蛋白酶（3）微生物：1398枯草桿菌蛋白酶、3942棲土曲霉蛋白酶、放線菌蛋白酶酸性蛋白酶：

pH2.5-5.0胃蛋白酶、凝乳酶和許多霉菌蛋白酶中性蛋白酶：pH7~8

胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶、細(xì)菌性中性蛋白酶（枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的）堿性蛋白酶：

pH9~11

枯草芽孢桿菌蛋白酶3、最適作用條件4、根據(jù)活性中心分類（1）、絲氨酸蛋白酶

活性部位含有絲氨酸殘基。絲氨酸羥基抑制劑：DFP（二異丙基氟磷酸）肽鏈內(nèi)切酶。

胰蛋白酶、胰凝乳酶、彈性蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶等都屬于此類。2、巰基蛋白酶

活性部位含有一個(gè)或多個(gè)巰基。

抑制劑：氧化劑、烷化劑和重金屬離子。

植物蛋白酶和某些鏈球菌蛋白酶屬于此類。3、金屬蛋白酶

活性中心：含有鎂、鋅、錳、鈷、鐵、汞、鎘、銅或鎳等金屬離子。在EDTA溶液中透析可以分離出金屬離子，使酶失活。

抑制劑：氰化物

羧肽酶A、某些氨肽酶和細(xì)菌蛋白酶屬于此類。4、羧基蛋白酶（酸性蛋白酶）

活性中心：有2個(gè)羧基。

抑制劑：對(duì)-溴苯甲酰甲基溴或重氮試劑。

胃蛋白酶、凝乳酶和許多霉菌蛋白酶在酸性范圍內(nèi)具有活性。最適pH在2~4。三、常用蛋白酶及其特性1、酸性蛋白酶羧基蛋白酶，活性中心含有2個(gè)天冬氨酸殘基最適pH：2.5~5.0最適作用溫度：45~75℃。分子量：30000-40000等電點(diǎn)低：3-5

熱穩(wěn)定性：pH2.0~4.0，40℃以下比較穩(wěn)定，超過50℃酶活力損失較嚴(yán)重，60℃以上很快失活。

pH穩(wěn)定性：pH2.0~6.0穩(wěn)定，超此范圍失活嚴(yán)重。金屬離子穩(wěn)定性：可被Mn2+

、Ca2+

、Mg2+激活，Cu2+

、Hg2+

、Al3+抑制。

抑制劑：對(duì)-溴苯甲酰甲基溴或重氮試劑。應(yīng)用：

皮毛軟化，啤酒、果酒澄清，動(dòng)、植物蛋白質(zhì)水解營(yíng)養(yǎng)液，羊毛染色，廢膠片回收，飼料添加等。2、堿性蛋白酶枯草芽孢桿菌的絲氨酸蛋白酶研究最為深入和廣泛。應(yīng)用：皮革脫毛、絲綢脫膠、加酶洗滌劑、加酶洗衣粉有效溫度范圍：20~65℃最適作用溫度：40~50℃有效pH范圍：7~11最適作用pH：9.5~10.5金屬離子：可被Ca2+激活，Hg2+、Ag+

、Cu2+

、Zn2+

抑制。分子量：20000-34000等電點(diǎn)高：8-93、中性蛋白酶最早用于工業(yè)生產(chǎn)的蛋白酶。大多數(shù)微生物中性蛋白酶是金屬酶，一部分酶蛋白總含有一原子鋅，分子量為35000-40000，等電點(diǎn)8-9。最不穩(wěn)定，易自溶。最適溫度：50℃左右。最適pH：7-8熱穩(wěn)定性：pH7.0~8.0，37℃以下比較穩(wěn)定，作用2h酶活保存80%，超過45℃酶活力不穩(wěn)定，60℃以上很快失活。pH穩(wěn)定性：pH6~7穩(wěn)定，低于5.0或高于9.0很快失活。金屬離子穩(wěn)定性：可被Mn2+

、Ca2+

、Mg2+激活，Cu2+

、Hg2+

、Al3+抑制。4、絲氨酸蛋白酶共性與特性：主要有胰蛋白酶、α-凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶等。共同特征：內(nèi)切酶，活性中心含有絲氨酸殘基，此外活性中心還有咪唑基和羧基，并且在一些蛋白酶活性中心部分的氨基酸連接順序相似。（1）α-胰凝乳蛋白酶由3條多肽鏈組成，以2個(gè)鏈間二硫鍵連接在一起。還含有3個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵，分子量25000左右。牛胰臟可產(chǎn)生兩種沒有活性的胰凝乳蛋白酶酶原A和B，氨基酸組成不同，等電點(diǎn)為8.5和4.5，當(dāng)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚悦笗r(shí)，物理性質(zhì)仍有差別，但特異性相同。最適pH為7~9（2）胰蛋白酶是消化系統(tǒng)中重要的蛋白質(zhì)消化酶，在機(jī)體內(nèi)不僅可以自激活，還要激活其他的蛋白酶。來自不同動(dòng)物的胰蛋白酶氨基酸數(shù)目和順序有差異，但活性中心均有絲氨酸，均由一條單肽鏈組成，并且作用機(jī)制相同。胰蛋白酶的最適pH為7~9，較高時(shí)自我催化分解。鈣離子有保護(hù)和激活作用。（3）彈性蛋白酶肽鏈內(nèi)切酶，專一性的水解不溶性的彈性蛋白動(dòng)物胰臟中提純的彈性蛋白酶由240個(gè)氨基酸殘基組成，分子量25000，等電點(diǎn)9.5，最適pH為8.1-8.9。是一種單體酶，無輔酶，不含輔基和金屬離子。彈性蛋白酶至少有兩個(gè)活性中心一個(gè)是水解活性中心，使彈性蛋白某些鍵斷裂，彈性蛋白結(jié)構(gòu)松弛，親水基團(tuán)大量暴露出來而溶于水；一個(gè)是蛋白水解活性中心，表現(xiàn)出廣譜蛋白水解活性5、巰基蛋白酶木瓜蛋白酶其酶活性部位中含有巰基，屬巰基蛋白酶。木瓜蛋白酶存在于木瓜汁液中，分子量23900，至少有3個(gè)氨基酸殘基存在于酶的活性部位，它們是Cys25（半胱）、His159（組）和Asp158（天冬）。當(dāng)Cys25被氧化劑氧化或與重金屬離子結(jié)合時(shí)，酶活力被抑制，而還原劑半胱氨酸（或亞硫酸鹽）或EDTA能恢復(fù)酶的活力。還原劑作用：從-S-S-——-SH，EDTA螯合重金屬離子。木瓜蛋白酶在pH5時(shí)，有良好穩(wěn)定性，如pH<3或>11時(shí)酶很快失活，最適pH隨底物改變。木瓜蛋白酶具有較高的耐熱性，酶液在pH7和70度下加熱30分鐘，而使牛乳凝結(jié)的活力僅下降20%。木瓜蛋白酶對(duì)酯和酰胺類底物表現(xiàn)出很高的活力。6、金屬蛋白酶這類蛋白酶為肽鏈端切酶。金屬蛋白酶中的金屬離子大多是二價(jià)金屬離子，這些金屬離子是否發(fā)揮相似的作用還不清楚，酶活性均能被金屬螯合劑所抑制。常見的金屬蛋白酶（1）羧肽酶牛體內(nèi)，羧肽酶以酶原形式從胰臟中分泌出來，由三個(gè)多肽鏈組成，在胰蛋白酶的作用下，酶原轉(zhuǎn)化為羧肽酶。羧肽酶A和B的催化作用機(jī)制相同，但專一性有很大差異，A要求碳端氨基酸是除了精氨酸、賴氨酸或羥脯氨酸以外的氨基酸，而B要求碳端氨基酸為精氨酸或賴氨酸。（2）氨肽酶亮氨酸氨肽酶，有較寬廣的底物特異性首先發(fā)現(xiàn)它能水解N-末端氨基酸是亮氨酸的二肽或三肽。還能水解許多N-末端氨基酸的酰胺、酯和肽最適pH在8左右。四、蛋白酶水解蛋白質(zhì)的苦味來源

蛋白質(zhì)中的疏水性氨基酸是導(dǎo)致蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生苦肽的重要原因。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于天然狀態(tài)時(shí)，這些氨基酸埋藏在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，因而對(duì)蛋白質(zhì)的味道不會(huì)產(chǎn)生明顯的影響。在酶水解過程中，小肽的數(shù)量將增加，從而暴露了這些疏水性氨基酸，當(dāng)它們同味蕾相作用時(shí)就產(chǎn)生了苦味。

如果采取有控制的酶水解，使蛋白質(zhì)的水解反應(yīng)停止在某一個(gè)階段，使肽鏈具有足夠的長(zhǎng)度將疏水性氨基酸埋藏在它的結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，就能減少水解蛋白質(zhì)的苦味。五、蛋白酶作為食品添加劑的應(yīng)用1、作為肉類嫩化劑

用于肉類嫩化劑的蛋白酶必須具有較高的耐熱性。因?yàn)槟刍瘎┑淖饔弥饕l(fā)生在當(dāng)肉類被燒煮，溫度逐漸升高，而酶尚未失活之前的這個(gè)階段。