【實驗題目】藥物中特殊雜質的檢查【實驗目的】掌握阿司匹林腸溶片、貝諾酯中特殊雜質檢查的基本原理和方法。掌握薄層色譜法在藥物雜質檢查中的應用。掌握薄層色譜法的基本操作。【實驗原理】一阿司匹林腸溶片中游離水楊酸的檢查生產過程中乙酰化不完全或儲藏過程中水解均可引入游離水楊酸，檢查的原理是利用水楊酸可在弱酸性溶液中與高鐵鹽反應呈紫堇色（課本上的公式），而阿司匹林結構中無游離酚羥基，不發生該反應，因而對雜質的檢出無干擾。通過與一定量水楊酸對照液生成的色澤比較，從而控制游離水楊酸的限量。二貝諾酯中有關物質的檢查薄層色譜法是一種吸附薄層色譜分離法，它利用各成分對同一吸附劑吸附能力不同，使在流動相（溶劑）流過固定相（吸附劑）的過程中，連續的產生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，從而達到各成分的互相分離的目的。例如用硅膠和氧化鋁作支持劑，其主要原理是吸附力與分配系數的不同，使混合物得以分離當溶劑沿著吸附劑移動時，帶著樣品中的各組分一起移動，同時發生連續吸附與解吸作用以及反復分配作用。由于各組分在溶劑中的溶解度不同，以及吸附劑對它們的吸附能力的差異，最終將混合物分離成一系列斑點。如作為標準的化合物在層析薄板上一起展開，則可以根據這些已知化合物的比移值對各斑點的組分進行鑒定，同時也可以進一步采用某些方法加以定量。【實驗儀器】50ml納氏比色管、50ml量瓶、移液管、點樣毛細管、玻璃板、研缽、研杵、量筒、膠頭滴管、吹風機、展開槽、紫外燈、毛細點樣管等。【實驗試藥】一阿司匹林腸溶片中游離水楊酸的檢查阿司匹林腸溶片（廠家、批號）、稀硫酸鐵銨溶液、0.01％水楊酸溶液、0.05％酒石酸溶液、乙醇（濃度？）、純化水等。二貝諾酯中有關物質的檢查硅膠GF25、0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液、40.0mg/ml貝諾酯溶液、0.4mg/m1貝諾酯溶液、80^g/m1對乙酰氨基酚、無水乙醇、展開劑（二氯甲烷-乙醚-冰醋酸=80：15：4）、純化水等。【實驗操作和現象】一阿司匹林腸溶片中游離水楊酸的檢查取本品5片，研細，用乙醇15ml分次研磨，并移入50ml量瓶中，充分振搖，用水稀釋至刻度，搖勻，立即過濾，精密量取濾液3ml,置50ml納氏比色管中，用水稀釋至50ml,立即加新制的稀硫酸鐵銨溶液（取1mol/L鹽酸溶液1ml,加硫酸鐵銨指示液2ml后再加水適量使成100ml）3ml,搖勻，30秒鐘內如顯色，與對照液（精密量取0.01%水楊酸溶液4.5ml,加乙醇3ml，0.05%酒石酸溶液1ml,用水稀釋至50ml,再加上述新制的稀硫酸鐵銨溶液3ml,搖勻）比較，不得更深。實驗現象：供試品所呈紫堇色比對照品淺。二貝諾酯中有關物質的檢查薄層板的制備：取硅膠GF2g,加0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液6?7ml調成糊狀，均勻涂布于光滑、平254整、潔凈的玻璃板（5X15cm）上，置水平臺上晾干，在110^烘0.5小時，置干燥器中備用。操作：取貝諾酯原料藥，加氯仿-甲醇（9:1）制成每1ml中含40.0mg的溶液，作為供試品溶液；精密稱取本品與對乙酰氨基酚適量，備加氯仿-甲醇（9：1）制成每1ml中含本品0.4mg，與對乙酰氨基酚80叢g的溶液，作為對照溶液（1）、（2）。吸取上述三種溶液各10|±l,分別點同一硅膠GF薄層板上，以254二氯甲烷-乙醚-冰醋酸（80：15：4）為展開劑，展開后，晾干，置紫外光燈（254nm）下檢視。供試品溶液如顯雜質斑點不得多于4個，與對照溶液（2）相同位置上所顯的斑點比較，不得更深；如顯其他雜質斑點，比主斑點位置稍高的雜質斑點，與對照溶液（1）所顯的主斑點比較，不得更深。實驗現象：（畫個圖或者搜個圖）【實驗結論】？廠家生產的批號為？的阿司匹林腸溶片中的游離水楊酸雜質檢查合格。貝諾酯中有關物質（對乙酰氨基酚）的檢查合格。（不確定是不是這樣寫）【注意事項】在阿司匹林中游離水楊酸的檢查中，制備供試品溶液所用的比色管須經干燥后使用，且供試品須用乙醇溶解后才可加水稀釋至刻度，否則供試品難以溶解。游離水楊酸檢查時，供試品溶液要臨用現配，避免阿司匹林水解造成的誤差。進行水楊酸檢查時，應在中性或弱酸性溶液（pH4~6）中進行。若在強酸性溶液中，生成的紫堇色配合物會分解褪色。點樣時宜分次點加，每次點加后，待其自然干燥。點樣基線距底邊2.0cm,樣點一般為圓點，直徑2~4mm,點間距離可視斑點擴散情況以不影響檢出為宜，一般約為1.5cm?2.0cm。不要劃線，以免破壞硅膠表面，毛細管輕觸表面，不要捅破硅膠。思考題】簡要說明以上雜質檢查項目的原理和方法。見實驗原理。簡要說明薄層色譜法在藥物雜質檢查中的應用。有關物質檢查通常采用色譜法，可根據有關物質的性質選用專屬性好，靈敏度高的薄層色譜，高效液相色譜（HPLC）及氣相色譜（GC）法。薄層色譜法設備簡單，操作簡便，但因影響重現性和精密度的因素較多，可用作一般有關物質檢查，而對于要求高的雜質，則無法滿足要求。對于此種情況，則可以采用反相薄層色譜法進行測定。計算雜質限量。阿司匹林腸溶片中游離水楊酸的限量=0-01^/100mLx4-5mLX100%=1.5%5X1OOX1O-39X^貝諾酯中對乙酰氨基酚雜質限量=8°X1°-3"9/問X1°竝X100%=0.2%40卩9/卩5X10“厶【討論】什么是雜質：①有毒副作用的物質（如砷鹽）；②本身無毒副作用，但影響藥物的穩定性和療效的物質（如鐵鹽、硒化物）；③本身無毒副作用，也不影響藥物的穩定性和療效，但影響藥物的科學管理的物質（信號雜質硫酸鹽、氯化物）。雜質的來源：①生產中引入：未反應原料、中間體、副產物、降解產物、催化劑、金屬器皿；②貯藏過程中產生：水解、氧化、分解、異構化、晶型轉變、聚合、潮解、發霉。雜質的分類：①一般雜質：氯化物、硫酸鹽、鐵鹽、重金屬、砷鹽、水分、易炭化物、熾灼殘渣、有機溶劑殘留等（收載在15藥典四部通則0800）;②特殊雜質：某一個或某一類藥物生產或貯藏過程引入的雜質（收載在正文項下）。5.展開劑中冰醋酸的作用薄層色譜是樣品與硅膠之間的吸附/解吸附的過程，如果硅膠對樣品組分的吸附過于強烈或者過載，就會使得樣品在硅膠中的停留時間分布范圍較寬，從而造成拖尾。吸附主要是硅膠中的羥基與樣品中的強極性基團之間的作用。例如分離羧酸類樣品時拖尾是由于硅膠羥基和樣品羧基之間較強的氫鍵作用使其吸附過強；分離堿性物質如生物堿時拖尾則是由于硅膠本身的硅羥基具有微酸性，可以與堿性化合物發生作用。因此需要更強的溶劑系統來解吸附，因此對于羧酸類化合物，需要醋酸或者甲酸來加強洗脫極性；另外，羧酸的電離也會造成拖尾，因此加入醋酸或者甲酸抑制電離，使得薄層點比較圓。同理，對于堿性物質，也需要加堿（通常是三乙胺、二乙胺或者氨水）來加強洗脫極性和抑制電離。也可以制成堿性板（鋪板時用NaOH代替水）或酸性板。產生拖尾最主要的原因是板的酸堿性與所要分離物質的性質，另外硅膠板的質量、水分、電樣量、展開劑的適用性、板的預處理如預飽和等因素都會產生一定影響。解決方法分別為抑制解離（在展開劑中加入二乙胺，氨蒸氣飽或加入1％的乙酸（蒸汽飽和）；適當活化；電樣量不過大，展開劑兼容性好等。/r/