哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心LiaoYL,HuLY,TsaiKW,etal.TranscriptionalregulationofmiR-196bbyETS2ingastriccancercells[J].Carcinogenesis,2012:bgs031.IF=5.266ThepolymerizationanddepolymerizationofF-actinareessentialforcellmotility.ToassesswhethertheobservedarrangementsoftheactincytoskeletoncouldaffectthemigrationofshETS2-orlenti-196b-treatedAGScells,weexaminedcellularactinstructurewithphalloidinestaining.TheF-actinpositivemembraneprotrusionsweresignificantlyincreasedinadditiontotheF-actinorganizationenhancementintheshETS2-orlenti-196b-treatedAGScells細胞培養基礎知識相關實驗儀器使用細胞學相關實驗細胞培養教學視頻細胞培養技術哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心※△一、概念：細胞培養是指從器官、組織中分離出細胞并在體外模擬體內生理環境在無菌、適當的溫度和一定的營養條件下使之生長生存，維持結構和功能的培養方法。（培養物是單個細胞或細胞群）哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心二、細胞培養的優點及局限性優點：能長時間直接觀察活細胞的形態結構和生命活動，應用領域廣。便于觀察、記錄、攝影，直接觀察細胞變化。可供研究的細胞種類廣泛，從低等生物到高等動物，以及人類；從胚胎到成體；從正常組織到腫瘤細胞皆可。便于使用不同方法研究細胞。培養細胞攜帶有與體內細胞同等的基因組，是分子生物學和基因工程學的研究對象和組成部分。可同時提供大量生物性狀相似的實驗對象，耗資少。易于施加物理、化學和生物因素進行實驗。生物制品、基因工程制品、單克隆抗體生產必要手段。

哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心局限性：組織和細胞離體以后，獨立生存在人工培養環境中，與體內環境相比，仍有很大差異。故實驗結果不能推至體內，輕易做出與體內等同的結論。哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心三、細胞培養特性（一）生長方式根據是否附于支持物上生長的特性，分為貼附生長和懸浮生長。1.貼附生長是指細胞附著于支持物表面生長。貼壁生長的細胞從形態學上大體分為上皮細胞型和成纖維細胞型兩種哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心（2）上皮型細胞扁平不規則多角形，中有圓形核，細胞緊密相連成單層膜。其生長特點為細胞緊密相連，呈“鋪路石”狀消化管外皮細胞、肝、胰、肺泡上皮、血管內皮等哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心②多形型細胞難以確定其規律和穩定的形態神經組織細胞哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心（二）生長特性1、接觸抑制：細胞進行體外培養時，分散貼壁生長的細胞一旦相互匯合接觸，即停止移動和生長的現象。細胞增殖到一定程度,也就是互相挨在一起的時候,糖蛋白識別了這種信息,就會使細胞停止繼續繁殖,這種現象就叫做接觸抑制。（腫瘤細胞不受影響）2、密度抑制：細胞接觸匯合成片后，雖發生接觸抑制，只要營養充分，細胞仍然能夠進行增殖分裂，因此細胞數量仍在增多。但當細胞密度進一步增大，培養液中營養成分減少，代謝產物增多時，細胞因營養的枯竭和代謝物的影響，則發生密度抑制（DensityInhibition），導致細胞分裂停止。（腫瘤細胞受影響）哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心四、細胞培養所需儀器設備及用品（一）無菌操作環境1.無菌操作區：只限于細胞培養，獨立的區域或與外界隔離，備有紫外殺菌條件（主要用于培養室空氣、操作臺、塑料培養皿和培養板等表面消毒）；2.個人：無菌服、無菌室專用鞋，并且帶上口罩和帽子；哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心（二）設備1.超凈工作臺：為細胞操作提供無菌環境2.顯微鏡：倒置顯微鏡、熒光顯微鏡等；3.CO2培養箱；4.干烤箱5.高壓鍋6.純水器、離心機、液氮罐、天平等；哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心（三）用品1.濾器：細胞培養用的培養基、消化液中含有多種生物活性物質，這些物質在高溫和射線的照射下易失去功能，必須用濾器除菌；2.培養瓶、培養板、吸管、加樣器等。哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心五、細胞生長條件（一）營養物質

細胞生長所需的營養物質包括氨基酸、維生素、碳水化合物、無機離子以及各種促生長因子等。血清中含有多種細胞生長所需的營養物質。

哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心（二）生長環境a.溫度:哺乳動物細胞適宜溫度范圍35-37℃。b.pH值：CO2是細胞的代謝產物也是細胞生長的必要條件．細胞培養箱中通入一定量的CO2（一般5%）可使培養箱中的PH值保持在7.2-7.4之間。c.濕度：相對濕度100%。CO2培養箱中要放置水槽，用以防止培養瓶（皿）中液體蒸發。d.環境清潔無污染

哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心（三）細胞培養所需的液體A水：細胞培養所需純凈水包括蒸餾水和離子交換水兩種。B平衡鹽液：它是等滲液體，不含鈣鎂離子。用于沖洗細胞。包括：HanKs液，D-HanKs液及PBS液等。C消化液：胰蛋白酶液：一般濃度0.25%EDTA液：常用濃度是0.02%胰酶-EDTA混合液：將上述兩種液體按1：1混合即可。兩種消化液聯合使用可提高消化效率。哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心E抗生素在離散細胞或培養細胞過程中，加入適量抗生素，可預放操作不慎而產生的污染。常用的有：青霉素100ug/ml鏈霉素100ug/ml卡那霉素50ug/ml慶大霉素50ug/ml二性霉素2.5ug/ml等。常配成1:100倍或1:200倍使用濃度的鹽溶液內，分裝小瓶，冷凍保存。使用前加入到培養液內，每小瓶最好一次用完。

哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心（一）無菌操作前準備；1進入無菌室前，應洗手以保持清潔。在緩沖間換無菌室專用拖鞋和穿無菌服。2將廢液桶放入超凈臺內，然后將超凈臺的紫外燈打開，殺菌20-30分鐘，重復步驟1。3培養基等液體最好恢復室溫，如是較難培養的細胞，在操作前液體一定要預溫。4實驗用品：做好計劃、按需領取并做好登記。注意：紫外燈打開時，不要將培養基、消化液等放在室內和超凈臺內。六、細胞培養流程

※※※哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心6吸管的使用：拿吸管用執筆的方法，吸管在酒精燈上過火時間不要太長，以免造成培養基中的生物活性物質和消化液中酶活性失效。吸過液體的吸管不能再在酒精燈上過火。吸管操作要穩，向培養瓶加液體時不要滴在瓶口或瓶外壁，以免造成污染。7如果培養兩種以上細胞時要分批操作，避免交叉污染；8從培養箱取出培養瓶時應水平或瓶口上傾；往培養箱放培養瓶前，要檢查瓶壁外是否有液體，如有要用酒精棉擦去。9培養箱要輕開輕關。培養箱水槽內水量要保持在總體積一半以上。哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心10.以原代培養和傳代培養為例介紹培養過程原代培養：是指從組織中分離出細胞后在體外進行的首次培養。原代培養的方法：組織塊法和酶消化法。原代培養的注意事項：（1）原代培養時一定將組織中的血管和外膜等除干凈。（2）組織塊法時，組織不應過大一般剪成1mm3左右大小。然后將組織塊平鋪在培養皿上，先不要加培養液，放置15-30分鐘后加入少量液體，24小時后再補加培養液。

哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心（3）采用消化法時，要將組織塊剪成泥狀，不同組織要用不同的消化液，消化液濃度和消化時間也不相同，如果培養的不是成纖維細胞，要采用差速貼壁的方法去除成纖維細胞。（4）原代培養的細胞需要進一步純化。酶消化法，機械刮除法等。哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心操作步驟：⑴倒掉舊培養液⑵用平衡鹽液（多用PBS）沖洗細胞后棄掉;⑶加入消化液，要使消化液浸過細胞層面，然后棄掉;⑷消化2-3分鐘（禁止放入培養箱）;⑸鏡下觀察，當細胞變圓變亮時應終止消化。胰酶消化時可直接加含有血清的培養基吹打細胞后分瓶；如用EDTA消化需用Hanks液終止，混合液需先終止后離心然后分瓶;注意：

無論是在培養瓶中還是在離心管中操作都要用吸管吹打細胞，使其成為單個細胞懸液，然后均勻的分到兩個瓶中。哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心細胞培養中可能遇到的問題：1.細胞不貼壁或少貼壁2.細胞成團或分散不均勻3.細胞生長緩慢4.培養瓶中出現殘渣5.細胞污染（細菌、真菌等）哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心

哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心（三）無菌操作后無菌操作結束后，將廢液桶等物品取出，用酒精綿擦拭臺面并將臺內物品擺放整齊，關閉通風、照明，將臺內紫外打開；查看顯微鏡、離心機等設備電源是否關閉；將掉到地面上的廢棄物撿起，如果有液體撒在地面上，要用清水擦拭。哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心（四）無菌室清掃依據科研實驗中心《細胞培養間清潔規范》進行安排值日哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心七、細胞凍存與復蘇（一）細胞凍存：1.細胞凍存時機：貼壁率為85%-95%的對數生長期細胞。2.凍存液：含有5%-7%二甲基亞砜的血清液3.凍存要求：凍存前一天換液；凍存液中細胞的終濃度以1-5x106/ml為宜；凍存時溫度應逐漸降低；首次凍存時應復蘇一支觀察其凍存效果。哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心（二）細胞復蘇

細胞復蘇時應在37℃水浴鍋中迅速融解，操作如下：準備好培養液（預溫）和離心管將凍存管從液氮中取出迅速放入純凈的37℃水中，待融解到還有黃豆粒大小冰塊時取出；將含有細胞的凍存管用酒精消毒后，將細胞懸液吸出放入離心管；加一管常溫的培養液混勻；800-1000轉/分離心，棄上清后加培養液，混合后移入培養瓶中。哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心細胞培養的核心原則是什么？

無菌操作哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心相關實驗儀器使用哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心

天平的使用1.調水平：每天平開機前，應觀察天平后部水平儀內的水泡是否位于圓環的中央，否則通過天平的地腳螺栓調節，左旋升高，右旋下降。

2.預熱：天平在初次接通電源或長時間斷電后開機時，至少需要30分鐘的預熱時間。因此，實驗室電子天平在通常情況下，不要經常切斷電源。

3.稱量：

——按下ON/OFF鍵,接通顯示器;

——等待儀器自檢。當顯示器顯示零時，自檢過程結束，天平可進行稱量；

——放置稱量紙，按顯示屏兩側的Tare鍵去皮，待顯示器顯示零時，在稱量紙加所要稱量的試劑稱量。

——稱量完畢，按ON/OFF鍵,關斷顯示器。

相關實驗儀器使用哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心注意事項1.為正確使用天平，請您熟悉天平的幾種狀態：

——顯示器右上角顯示O：表示顯示器處于關斷狀態；

——顯示器左下角顯示O：表示儀器處于待機狀態，可進行稱量；

——顯示器左上角出現菱形標志：表示儀器的微處理器正在執行某個功能，此時不接受其他任務。

2.天平在安裝時已經過嚴格校準，故不可輕易移動天平，否則校準工作需重新進行。

3.嚴禁不使用稱量紙直接稱量！每次稱量后，請清潔天平，避免對天平造成污染而影響稱量精度，以及影響他人的工作。相關實驗儀器使用哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心

使用方法

1.以旋轉的方式把PH電極從保護帽中拔出，沖洗后定標。

2.定標后將PH電極用蒸餾水清洗后，將PH電極頭浸入待測樣品中（4cm）并用攪拌棒攪拌進行測樣。

3.停幾分鐘讓PH電極讀數穩定。

4.將顯示靜止在終點數值上讀取數據。

5.測量后，將電極用蒸餾水清洗，旋入保護帽中。

相關實驗儀器使用哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心注意事項

1.每次使用前必須定標：4.017.010.01

2.在將電極從一種溶液移入另一種溶液之前，用蒸餾水清洗電極。用紙巾將水吸干，切勿擦拭電極。

3.小心使用電極，切勿將之用作攪拌棒。在拿放電極時，勿接觸電極膜。

4.隨時留意電極保護液是否干涸，請通知儀器分析技術員填充。將灌有正確保護液的電極豎直放置。

5.做好使用登記。相關實驗儀器使用哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心使用方法

1、打開進水壓力閥。2、儀器顯示：PRE-OPERATE狀態。3、向下扳動操作手柄上的開關，儀器顯示：18.2MΩ.CM系統即可開始工作。注意事項1、隨時注意，進水桶內液面，避免進水管露出水面。2、注意節約用水，不用時及時關閉出水閥。相關實驗儀器使用哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心使用方法:通電前首先在水箱中加入適量水，最好選用蒸餾水，切勿無水或水位低于電熱管、以防電熱管爆損。接通電源，打開開關設置溫度按SET鍵綠色數字閃動按“∧”“∨”鍵到所需溫度后按“﹤”鍵到所需溫度后按SET鍵確認。注意事項:1.水浴鍋在使用時，必須可靠接地、水不可溢入控制箱內以免發生危險。2.必須按規定使用，切不可缺水，否則造成設備損壞。3.使用時必須登記相關實驗儀器使用哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心使用方法：1．打開電源2.調節所需風速3.使用的時候人坐于柜前，將玻璃門盡量放低，手通過門下伸進柜內進行實驗。4.使用后關閉電源相關實驗儀器使用哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心注意事項:1消毒期間嚴禁打開風機，始終保持工作臺內“死屏”即無空氣對流效果。2.工作臺使用后即刻以75%酒精擦凈污漬；紫外燈消毒30分鐘后關機。3.經常用沙布沾上酒精將紫外線殺菌燈表面揩擦干凈，保持表面清潔，以免影響紫外燈消毒效果。4.使用時必須登記相關實驗儀器使用哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心1準備1.1檢查離心腔體有無異物1.2通電前應檢查儀器電源線是否連接正常.2.開機設定參數：1）按設定鍵“SET”2）將離心參數輸入。按“▼”“▲”鍵后按確定鍵“ENTER”以示確認。3.運行相關實驗儀器使用哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心注意事項：1每次修改參數后，必須按一次“設定確認”鍵，否則離心機將保持原有工作狀態，對設定的參數不予理睬。2把經過平衡的樣本放入離心機，按運行鍵“STARE”，離心機將自動運行。3清理系統和關機4清理離心腔雜物，關閉電源。5.使用時必須登記。相關實驗儀器使用哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心開機，接連電源。打開鏡體下端的電控開關。(1)準備：將待觀察對象置于載物臺上。旋轉三孔轉換器，選擇較小的物鏡。觀察，并調節鉸鏈式雙目目鏡，舒適為宜。(2)調節光源：推拉調節鏡體下端的亮度至適宜。通過調節聚光鏡下面的光柵來調節光源的大小。(3)調節像距：轉三孔轉換器，選擇合適倍數的物鏡;更換并選擇合適的目鏡;同時調節升降，以消除或減小圖像周圍的光暈，提高了圖像的襯度。(4)觀察：通過目鏡進行觀察結果;調整載物臺，選擇觀察視野。(5)關機取下觀察對象，推拉光源亮度調節器至最暗。關閉鏡體下端的開關，并斷開電源。旋轉三孔轉換器，使物鏡鏡片置于載物臺下側，防止灰塵的沉降。相關實驗儀器使用哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心1.所有鏡頭表面必須保持清潔，落在鏡頭表面的灰塵，可用吸耳球吹去，也可用軟毛刷輕輕的撣去掉。2.當鏡頭表面沾有油污或指紋時，可用脫脂棉蘸少許無水乙醇和乙醚的混合液(3:7)輕輕擦拭。3.不能用有機溶液清擦其它部件表面，特別是塑料零件，可用軟布蘸少量中性洗滌劑清擦。4.在任何情況下操作人員不能用棉團、干布塊或干鏡頭紙擦試鏡頭表面，否則會刮傷鏡頭表面，嚴重損壞鏡頭，也不要用水擦試鏡頭，這樣會在鏡頭表面殘留一些水跡，因而可能滋生霉菌，嚴重損壞顯微鏡。5.儀器工作的間歇期間，為了防止灰塵進入鏡筒或透鏡表面，可將目鏡留在鏡筒上，或蓋上防塵塞，或用防塵罩將儀器罩住。6.微鏡盡可能不移動，若需移動應輕拿輕放，避免碰撞。7.不允許隨意拆卸儀器，特別是中間光學系統或重要的機械部件，以免降低儀器的使用性能。相關實驗儀器使用哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心注意事項：1.嚴格遵守操作要求2.在儀器使用記錄上簽字3.遇到問題及時與老師聯系哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心相關實驗儀器使用細胞學相關實驗哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心一、細胞計數

細胞計數是細胞實驗中的一項基本技術，在細胞轉染、生長曲線測定、腫瘤細胞遷移實驗、腫瘤細胞侵襲實驗、抗腫瘤藥物的篩選等很多實驗中都用到此項技術。分類：細胞計數板計數法電子細胞計數儀計數法。細胞學相關實驗哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心（一）步驟1、制備細胞懸液：用胰酶消化貼壁細胞或直接收集懸浮培養的細胞制成單個細胞懸液。2、加樣：用移液器吸取少許細胞懸液在計數板上蓋玻片的雙側加微量細胞懸液，加樣時不要溢出蓋玻片也不要溢到計數板的凹槽內。加樣過程中不能產生氣泡。3、計數：在顯微鏡下，用10×物鏡觀察計數板四角大方格中的細胞數。細胞壓線時本著計左不計右、計上不計下的原則準確的計數細胞。4、將計算結果代入公式得出細胞密度：細胞數/毫升原液=（4大格細胞數之和/4）×104細胞學相關實驗哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心（二）注意事項1、細胞懸液中的細胞一定是單個的細胞。2、在加樣前一定將細胞懸液充分混勻。3、計數時，如遇上2個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計數。細胞團的數量不應超過計數細胞的10%。細胞學相關實驗哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心二、細胞生長曲線（一）原理及應用細胞生長曲線是觀察細胞生長基本規律的重要方法。通過此實驗我們除了能夠得到正常組織細胞、腫瘤細胞的生長規律外，同時我們還應用于體外藥物敏感性的測定以及多種抑癌基因的研究。常用方法有細胞計數法和MTT法。（二）操作步驟（略）細胞學相關實驗哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心（三）注意事項1、細胞計數法一般用24孔板，MTT法用96孔板。2、加入的細胞總數和培養基的量都要一致。3、細胞計數要準確，接種的數量要適中，以7天剛好長滿為宜。不能使細胞增殖緩慢，也不能使細胞產生生長抑制。一般情況下，24孔板每孔接種1萬~2萬，設三個副孔分別計數，取平均值；96孔板每孔接種1000~2000個，要設兩個副孔。4、細胞計數法時，直接加1ml胰酶.5、根據時間和細胞數量的關系繪制曲線。注意：本實驗有20~30％的誤差。為了數據準確最好重復一次。細胞學相關實驗哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心三、克隆（集落）形成實驗（一）概念及應用克隆形成實驗是測定單個細胞增殖能力的有效方法。所謂克隆是指單個細胞在體外持續增殖6代以上其后所形成的細胞群.通過計數克隆形成率可對受檢細胞的增殖潛力作定量分析。常用于抗腫瘤藥物敏感性測定、基因治療、腫瘤放射生物學等方面的研究。方法：平板克隆形成實驗和軟瓊脂克隆形成實驗。細胞學相關實驗哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心克隆形成率%=克隆數——————接種細胞數×100細胞學相關實驗（二）公式哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心（三）操作方法：

1.平板法:適用于貼壁生長的細胞（細胞生長快慢均可）。具體操作如下：將受檢細胞經胰酶消化制成單個細胞懸液-細胞計數-細胞按倍數稀釋接種于24孔板或6孔板中培養2~3周-終止培養PBS沖洗-吉姆薩液染色-計數克隆數。注意：（1）要根據細胞增殖能力設計梯度。一般每孔按50、100、200個細胞的梯度密度設計。（2）終止培養時間以不少于2周而且克隆之間不發生融合為標準。細胞學相關實驗哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心2.瓊脂法：適用于懸浮生長的細胞以及繁殖較快的貼壁細胞。具體操作如下：將1.2%的瓊脂與2×培養基按1：1混合-6板中加1.5ml/孔成底層瓊脂-徹底冷凝后-用培養基配成0.35％瓊脂作為上層瓊脂且內加細胞（200或400)-培養2周-計數克隆數。注意：（1）瓊脂法所用瓊脂應為低熔點瓊脂。配好的瓊脂要放在水中預溫，下層瓊脂水溫在50-60度之間，上層瓊脂水溫不要超過42度；（2）應使下層瓊脂充分凝固后,再澆上層瓊脂，以避免上層瓊脂培養基中的細胞進入下層瓊脂中；（3）澆上層瓊脂時操作要迅速，以免液體過涼導致上下分離；（4）操作中不能產生氣泡。細胞學相關實驗哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心四、基底膜侵襲實驗Transwell小室法:1.Transwell小室法的特點及原理Transwell小室其外形為一個可放置在孔板里的小杯子，孔徑大小有0.1－12.0μm，根據不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜.將小室放入培養板中，小室內稱上室，培養板內稱下室，上室內盛裝的培養液其血清濃度較低，下室內盛裝的培養液其血清濃度較高，上下層培養液以聚碳酸酯膜相隔。我們將細胞種在上室內，細胞會往高營養的培養液里面跑，但是有膜擋著，所以要穿過膜才行。我們在膜上涂上一層基質膠，模仿細胞的基底膜，經一定時期培養后，我們計數通過聚碳酸酯膜細胞的數量來判斷受檢細胞的侵襲能力。細胞學相關實驗哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心2.實驗步驟：Transwell小室的準備：購買的小室有兩種，一種是已鋪好基質膠的，買來就可以用很方便，但也比較貴；另一種要自己鋪膠（層黏連蛋白和Ⅳ型膠原），價格較便宜。（1）從-20℃冰箱中取出小室在超凈臺內將其放入24孔板，室溫放置。（2）在24孔板和小室內各加入500L預熱的無血清培養基，37℃孵箱中水化2h。（3）水化后，在超凈臺內用移液器小心地將小室液體移出，不要碰到基底膜。細胞學相關實驗哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心（4）將受檢細胞全培養基終止消化，細胞計數，將細胞稀釋到10萬/mL濃度備用（培養液含0.2-1%血清）。（5）在24孔板內另一排孔中加入750L全培養基（培養液含10-15%血清），將小室移入上孔中，注意小室膜下不要產生氣泡，如產生氣泡應去除。（6）在小室內加入500L以備細胞懸液（5萬個細胞/孔），每組細胞設3個復孔。吹打均勻，鏡下觀察。（7）37℃孵箱中，培養24h。（8）從24孔板中取出小室，去掉液體用棉簽蘸無血清培養基擦干凈膜的內表面，去掉未發生侵襲的細胞。（9）膜在無水甲醇中固定1min，水洗2遍；蘇木素染色5min，水洗干凈（至無色）；伊紅染色20sec，水洗干凈。細胞學相關實驗哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心（10）將膜完全晾干。（11）用手術刀將膜完整地切下，中性樹膠將膜粘到載玻片上，蓋上蓋玻片。（12）光鏡下觀察，計數，拍照。細胞學相關實驗哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心五、細胞轉染技術（一）簡述：1原理：是指通過不同的載體和不同的導入方法將外源基因送入細胞內，并使其在細胞內表達。2導入方法：物理介導、化學介導和生物介導三類。物理介導有電穿孔法、顯微注射和基因槍等；化學介導有磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染方法、和多種陽離子物質介導等；生物介導最常用是病毒介導的轉染技術。細胞學相關實驗哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心3轉染類型：瞬時轉染和穩定轉染（1）瞬時轉染是指外源基因進入受體細胞后，存在于游離的載體上，不整合到細胞的染色體上，在外源基因導入細胞1-4天后收獲細胞進行分析。（2）穩定轉染需要外源基因整合到細胞的染色體上，從而得到穩定的轉染細胞株。細胞學相關實驗哈爾濱醫科大學附屬第二醫院科研實驗中心（二）細胞轉染的注意事項：目前最常用的是脂質體轉染方法。影響細胞轉染的因素很多，根據我們的實踐經驗總結如下：1用于轉染的質粒DNA必須無蛋白質，無RNA和其了化學物質的污染，用OD260/280比值驗證純度其值應在1.6-1.8之間。2選擇容易轉染的細胞系：貼壁細胞較懸浮細