第二十四章

疾病相關基因的鑒定與基因功能研究生物化學與分子生物學第二十四章生物化學與分子生物學疾病相關基因是醫學分子生物學最重要的領域，因為幾乎所有的疾病都與基因結構或表達變化有關，都是遺傳因素和環境因素相互作用的結果。疾病相關基因

致病基因：一種疾病的表型和一個基因型呈直接對應的因果關系，即該基因結構或表達的異常是導致該病發生的直接原因疾病易感基因：環境因素和遺傳因素均起著一定作用，表現為2個以上基因的“微效作用”的相加，或者多基因間的相互作用，而單一基因變異僅增加對疾病的易感性疾病相關基因是醫學分子生物學最重要的領域，因為幾乎所有的疾病第一節

鑒定疾病相關基因的原則

第一節一、鑒定疾病相關基因的關鍵是確定疾病表型和基因間的實質聯系正確的診斷是鑒定疾病基因的先決條件

確定疾病的遺傳因素，即通過孿生子分析，領養分析和同胞罹患率分析等確定遺傳因素是否在疾病發病中的作用及其作用程度。

一、鑒定疾病相關基因的關鍵是確定疾病表型和基因間的實質聯系正二、鑒定克隆疾病相關基因需要多學科多途徑的綜合策略疾病相關基因鑒定克隆策略示意圖二、鑒定克隆疾病相關基因需要多學科多途徑的綜合策略疾病相關基三、確定候選基因是多種克隆疾病相關基因方法的交匯有許多途經能夠達到最終鑒定疾病相關基因的目的，這些方法最終將交匯在候選基因上。一旦候選基因被鑒定，即可篩檢患者中該基因的突變。候選基因可不依賴其在染色體位置而予以鑒定，但常用的策略仍然是首先找出候選染色體區域，然后在此區域內鑒定候選基因。

三、確定候選基因是多種克隆疾病相關基因方法的交匯有許多途經能第二節

疾病相關基因克隆的策略和方法第二節一、不依賴染色體定位的疾病相關基因克隆策略

不依賴染色體定位的疾病相關基因克隆策略包括功能克隆、表型克隆及采用位點非依賴的DNA序列信息和動物模型來鑒定和克隆疾病基因。一、不依賴染色體定位的疾病相關基因克隆策略不依（一）從已知蛋白質的功能和結構出發克隆疾病基因功能克隆（functionalcloning）采用的是從蛋白質到DNA的研究路線，針對的是一些對影響疾病的功能蛋白具有一定了解的疾病1．依據蛋白質的氨基酸序列信息鑒定克隆疾病相關基因

2．用蛋白質的特異性抗體鑒定疾病基因

（一）從已知蛋白質的功能和結構出發克隆疾病基因功能克?。╢u（二）從疾病的表型差異出發發現疾病相關基因表型克?。╬henotypecloning）基于對疾病表型和基因結構或基因表達的特征聯系已經有所認識的基礎上來分離鑒定疾病相關基因（二）從疾病的表型差異出發發現疾病相關基因表型克?。╬hen1.從疾病的表型出發，比較患者基因組DNA與正常人基因組DNA的不同，直接對產生變異的DNA片段進行克隆，而不需要基因的染色體位置或基因產物的其他信息。

2.針對已知基因。如果高度懷疑某種疾病是由于某個特殊的已知基因所致，可通過比較患者和正常對照間該基因表達的差異來確定該基因是否為該疾病相關基因。3.針對未知基因的，可通過比較疾病和正常組織中的所有mRNA的表達種類和含量間的差異，從而克隆疾病相關基因。這種差異可能源于基因結構改變，也可能源于表達調控機制的改變。依據DNA或mRNA的改變與疾病表型的關系，可有幾種策略：

1.從疾病的表型出發，比較患者基因組DNA與正常人基因組D針對未知基因常用的技術有mRNA差異顯示（mRNAdifferentialdisplay，mRNA-DD）抑制消減雜交（suppressivesubstractivehybridization，SSH）基因表達系列分析（SAGE）

cDNA微陣列（cDNAmicroarray）基因鑒定集成法（integratedprocedureforgeneidentification）針對未知基因常用的技術有mRNA差異顯示（mRNAdiffRDA技術原理和基本過程示意圖RDA技術原理和基本過程示意圖mRNA-DD技術原理和基本過程示意圖mRNA-DD技術原理和基本過程示意圖（三）采用動物模型鑒定克隆疾病相關基因人類的部分疾病，已經有相應的動物模型。如果動物某種表型的突變基因定位于染色體的某一部位,而具有相似人類疾病表型的基因很有可能存在于人染色體的同源部位。另外，當疾病基因在動物模型上已完成鑒定，還可以采用熒光原位雜交來定位分離人的同源基因。

（三）采用動物模型鑒定克隆疾病相關基因人類的部分疾病，已經有二、定位克隆是鑒定疾病相關基因的經典方法定位克?。╬ositionalcloning）：僅根據疾病基因在染色體上的大體位置，鑒定克隆疾病相關基因。定位克隆的起點是基因定位，即確定疾病相關基因在染色體上的位置，然后根據這一位置信息，應用DNA標記將經典的遺傳學信息轉換為遺傳標記所代表的特定基因組區域，再以相關基因組區域的相連重疊群（contig）篩選候選基因，最后比較患者和正常人這些基因的差異，確定基因和疾病的關系。二、定位克隆是鑒定疾病相關基因的經典方法定位克?。╬osit（一）基因定位的方法1．體細胞雜交法通過融合細胞的篩查定位基因2．染色體原位雜交是在細胞水平定位基因的常用方法3.染色體異常有時可提供疾病基因定位的替代方法4．連鎖分析是定位疾病未知基因的常用方法（一）基因定位的方法1．體細胞雜交法通過融合細胞的篩查定位基（二）定位克隆的基本程序包括三大步驟1．盡可能縮小染色體上的候選區域2．構建目的區域的物理圖譜3.疾病相關基因的確定（二）定位克隆的基本程序包括三大步驟1．盡可能縮小染色體上的（三）假肥大型肌營養不良基因的克隆是定位克隆的成功例證首先，根據患病女性X染色體與第21號常染色體的易位，以及男患兒發生小的Xp21.2缺失并伴發三種其他X連鎖隱性遺傳病，再運用RFLP連鎖分析將DMD基因定位于Xp21。然后，分別克隆得到了基因的2個不同的片段，分別命名為XJ系列探針和pERT87系列探針，根據兩片段的比較，證明DMD基因約為2300kb，占X染色體的1%以上，該基因編碼肌營養不良蛋白（dystrophin），影響橫紋肌和心肌的結構和收縮功能。假肥大型肌營養不良（DMD）（三）假肥大型肌營養不良基因的克隆是定位克隆的成功例證首先，三、確定常見病的基因需要全基因組關聯分析和全外顯子測序全基因組的關聯研究（genome-wideassociationstudy,GWAS）全外顯子測序（wholeexonsequencing）三、確定常見病的基因需要全基因組關聯分析和全外顯子測序全基因四、生物信息數據庫貯藏豐富的疾病相關基因信息人類基因組計劃和多種模式生物基因組測序的完成,生物信息學的發展,計算機軟件的開發應用和互聯網的普及，人們通過已獲得的序列與數據庫中核酸序列及蛋白質序列進行同源性比較，或對數據庫中不同物種間的序列比較分析、拼接，預測新的全長基因等，進而通過實驗證實，從組織細胞中克隆該基因，這就是所謂的電子克隆（insilicocloning）。四、生物信息數據庫貯藏豐富的疾病相關基因信息人類基因組計劃和第三節

疾病相關基因的功能研究第三節基因的功能實際是基因產物的功能，也就是編碼基因的蛋白質功能和非編碼基因RNA的功能，前者是本節討論的重點?；虍a物之一蛋白質的功能可以從三個不同水平來描述：①生物化學水平，主要描述基因產物參與了何種生化過程，如屬于激酶、轉錄因子等；②細胞水平,主要論述基因產物在細胞內的定位和參與的生物學途徑，例如，某蛋白質定位于核內，參與DNA的修復過程，有可能并不了解確切的生物化學功能；③整體水平,主要包括基團表達的時空性及基因在疾病中的作用。基因的功能實際是基因產物的功能，也就是編碼基因的蛋白質功能和一、基因比對及功能詮釋常用的兩大雙序列比對工具是BLAST和FASTA,分別由美國國立生物技術信息中心（NCBI）和歐洲生物信息學研究所（EBI）開發和維護。NCBI的主頁是/；EBI的主頁是http://www.ebi.ac.uk/。

一、基因比對及功能詮釋常用的兩大雙序列比對工具是BLAST二、利用工程細胞研究基因功能

（一）采用基因重組技術建立基因高表達工程細胞系（二）基因沉默技術抑制特異基因的表達二、利用工程細胞研究基因功能（一）采用基因重組技術建立基因三、研究生物大分子間的相互作用可確定基因功能

在一些情況下,即使對基因的序列、結構和表達模式有清楚的認識，但仍然難以闡明基因所表達的蛋白質的功能。此時通過研究該蛋白質與已知功能蛋白質的相互作用，無疑將非常有助于對該蛋白質功能的了解。常用的高通量篩查蛋白質間相互作用的方法是酵母雙雜交技術（見第二十章）和噬菌體展示技術。三、研究生物大分子間的相互作用可確定基因功能在一些情況下,四、利用基因修飾動物整體研究基因功能

盡管在體外對基因功能的研究可提供大量信息，但是只有在整體內的研究才能真實反映該基因在體內的真正作用。通過在實驗動物，持別是小鼠體內進行相關的基因操作，獲得基因修飾動物品系，已成為在體研究基因功能的重要手段，常用的有轉基因動物和基因敲除動物。

四、利用基因修飾動物整體研究基因功能盡管在體外對基因功能的第二十四章

疾病相關基因的鑒定與基因功能研究生物化學與分子生物學第二十四章生物化學與分子生物學疾病相關基因是醫學分子生物學最重要的領域，因為幾乎所有的疾病都與基因結構或表達變化有關，都是遺傳因素和環境因素相互作用的結果。疾病相關基因

致病基因：一種疾病的表型和一個基因型呈直接對應的因果關系，即該基因結構或表達的異常是導致該病發生的直接原因疾病易感基因：環境因素和遺傳因素均起著一定作用，表現為2個以上基因的“微效作用”的相加，或者多基因間的相互作用，而單一基因變異僅增加對疾病的易感性疾病相關基因是醫學分子生物學最重要的領域，因為幾乎所有的疾病第一節

鑒定疾病相關基因的原則

第一節一、鑒定疾病相關基因的關鍵是確定疾病表型和基因間的實質聯系正確的診斷是鑒定疾病基因的先決條件

確定疾病的遺傳因素，即通過孿生子分析，領養分析和同胞罹患率分析等確定遺傳因素是否在疾病發病中的作用及其作用程度。

一、鑒定疾病相關基因的關鍵是確定疾病表型和基因間的實質聯系正二、鑒定克隆疾病相關基因需要多學科多途徑的綜合策略疾病相關基因鑒定克隆策略示意圖二、鑒定克隆疾病相關基因需要多學科多途徑的綜合策略疾病相關基三、確定候選基因是多種克隆疾病相關基因方法的交匯有許多途經能夠達到最終鑒定疾病相關基因的目的，這些方法最終將交匯在候選基因上。一旦候選基因被鑒定，即可篩檢患者中該基因的突變。候選基因可不依賴其在染色體位置而予以鑒定，但常用的策略仍然是首先找出候選染色體區域，然后在此區域內鑒定候選基因。

三、確定候選基因是多種克隆疾病相關基因方法的交匯有許多途經能第二節

疾病相關基因克隆的策略和方法第二節一、不依賴染色體定位的疾病相關基因克隆策略

不依賴染色體定位的疾病相關基因克隆策略包括功能克隆、表型克隆及采用位點非依賴的DNA序列信息和動物模型來鑒定和克隆疾病基因。一、不依賴染色體定位的疾病相關基因克隆策略不依（一）從已知蛋白質的功能和結構出發克隆疾病基因功能克?。╢unctionalcloning）采用的是從蛋白質到DNA的研究路線，針對的是一些對影響疾病的功能蛋白具有一定了解的疾病1．依據蛋白質的氨基酸序列信息鑒定克隆疾病相關基因

2．用蛋白質的特異性抗體鑒定疾病基因

（一）從已知蛋白質的功能和結構出發克隆疾病基因功能克隆（fu（二）從疾病的表型差異出發發現疾病相關基因表型克隆（phenotypecloning）基于對疾病表型和基因結構或基因表達的特征聯系已經有所認識的基礎上來分離鑒定疾病相關基因（二）從疾病的表型差異出發發現疾病相關基因表型克隆（phen1.從疾病的表型出發，比較患者基因組DNA與正常人基因組DNA的不同，直接對產生變異的DNA片段進行克隆，而不需要基因的染色體位置或基因產物的其他信息。

2.針對已知基因。如果高度懷疑某種疾病是由于某個特殊的已知基因所致，可通過比較患者和正常對照間該基因表達的差異來確定該基因是否為該疾病相關基因。3.針對未知基因的，可通過比較疾病和正常組織中的所有mRNA的表達種類和含量間的差異，從而克隆疾病相關基因。這種差異可能源于基因結構改變，也可能源于表達調控機制的改變。依據DNA或mRNA的改變與疾病表型的關系，可有幾種策略：

1.從疾病的表型出發，比較患者基因組DNA與正常人基因組D針對未知基因常用的技術有mRNA差異顯示（mRNAdifferentialdisplay，mRNA-DD）抑制消減雜交（suppressivesubstractivehybridization，SSH）基因表達系列分析（SAGE）

cDNA微陣列（cDNAmicroarray）基因鑒定集成法（integratedprocedureforgeneidentification）針對未知基因常用的技術有mRNA差異顯示（mRNAdiffRDA技術原理和基本過程示意圖RDA技術原理和基本過程示意圖mRNA-DD技術原理和基本過程示意圖mRNA-DD技術原理和基本過程示意圖（三）采用動物模型鑒定克隆疾病相關基因人類的部分疾病，已經有相應的動物模型。如果動物某種表型的突變基因定位于染色體的某一部位,而具有相似人類疾病表型的基因很有可能存在于人染色體的同源部位。另外，當疾病基因在動物模型上已完成鑒定，還可以采用熒光原位雜交來定位分離人的同源基因。

（三）采用動物模型鑒定克隆疾病相關基因人類的部分疾病，已經有二、定位克隆是鑒定疾病相關基因的經典方法定位克隆（positionalcloning）：僅根據疾病基因在染色體上的大體位置，鑒定克隆疾病相關基因。定位克隆的起點是基因定位，即確定疾病相關基因在染色體上的位置，然后根據這一位置信息，應用DNA標記將經典的遺傳學信息轉換為遺傳標記所代表的特定基因組區域，再以相關基因組區域的相連重疊群（contig）篩選候選基因，最后比較患者和正常人這些基因的差異，確定基因和疾病的關系。二、定位克隆是鑒定疾病相關基因的經典方法定位克?。╬osit（一）基因定位的方法1．體細胞雜交法通過融合細胞的篩查定位基因2．染色體原位雜交是在細胞水平定位基因的常用方法3.染色體異常有時可提供疾病基因定位的替代方法4．連鎖分析是定位疾病未知基因的常用方法（一）基因定位的方法1．體細胞雜交法通過融合細胞的篩查定位基（二）定位克隆的基本程序包括三大步驟1．盡可能縮小染色體上的候選區域2．構建目的區域的物理圖譜3.疾病相關基因的確定（二）定位克隆的基本程序包括三大步驟1．盡可能縮小染色體上的（三）假肥大型肌營養不良基因的克隆是定位克隆的成功例證首先，根據患病女性X染色體與第21號常染色體的易位，以及男患兒發生小的Xp21.2缺失并伴發三種其他X連鎖隱性遺傳病，再運用RFLP連鎖分析將DMD基因定位于Xp21。然后，分別克隆得到了基因的2個不同的片段，分別命名為XJ系列探針和pERT87系列探針，根據兩片段的比較，證明DMD基因約為2300kb，占X染色體的1%以上，該基因編碼肌營養不良蛋白（dystrophin），影響橫紋肌和心肌的結構和收縮功能。假肥大型肌營養不良（DMD）（三）假肥大型肌營養不良基因的克隆是定位克隆的成功例證首先，三、確定常見病的基因需要全基因組關聯分析和全外顯子測序全基因組的關聯研究（genome-wideassociationstudy,GWAS）全外顯子測序（wholeexonsequencing）三、確定常見病的基因需要全基因組關聯分析和全外顯子測序全基因四、生物信息數據庫貯藏豐富的疾病相關基因信息人類基因組計劃和多種模式生物基因組測序的完成,生物信息學的發展,計算機軟件的開發應用和互聯網的普及，人們通過已獲得的序列與數據庫中核酸序列及蛋白質序列進行同源性比較，或對數據庫中不同物種間的序列比較分析、拼接，預測新的全長基因等，進而通過實驗證實，從組織細胞中克隆該基因，這就是所謂的電子克隆（insilicocloning）。四、生物信息數據庫貯藏豐富的疾病相關基因信息人類基因組計劃和第三節

疾病相關基因的功能研究第三節基因的功能實際是基因產物的功能，也就是編碼基因的蛋白質功能和非編碼基因RNA的功能，前者是本節討論的重點?；虍a物之一蛋白質的功能可以從三個不同水平來描述：①生物化