實驗三鞭毛染色法及活細菌

運動性的觀察

一、實驗目的：1.學習細菌的鞭毛染色法,觀察細菌鞭毛的形態特征;2.學習用懸滴法觀察細菌的運動性.二、實驗原理：細菌的鞭毛極細，直徑一般為10—20nm，只有用電子顯微鏡才能觀察到。但是，如采用特殊的染色法，則在普通光學顯微鏡下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染劑處理，讓它沉積在鞭毛上，使鞭毛直徑加粗，然后再進行染色。常用的媒染劑由丹寧酸和氯化高鐵或鉀明礬等配制而成。三、實驗器材1.菌種：培養12-16h小時的普通變形桿菌。2.標本片：周鞭毛（傷寒桿菌）3.試劑：硝酸銀鞭毛染色液、生理鹽水、蒸餾水、香柏油、二甲苯。4.器材：凹載玻片、蓋玻片、鑷子、擦鏡紙、吸水紙、接種環，顯微鏡等。四、實驗方法（一）鞭毛染色

硝酸銀染色法：1.清洗玻片：選擇光滑無裂痕的玻片，最好選用新的。然后將玻片置洗衣粉過濾液中（洗衣粉煮沸后用濾紙過濾，以除去粗顆粒），煮沸20min。取出稍冷后用自來水沖洗、晾干，再放入濃洗液中浸泡5—6天，使用前取出玻片，用自來水沖去殘酸，再用蒸餾水洗。將水瀝干后，放入95%乙醇中脫水。新的載片雖沒有油污、劃痕，但含游離堿較多，所以要用2％鹽酸浸泡幾小時，用自來水沖洗干凈，然后再用蒸餾水洗凈，瀝干后再用效果較好。

2.菌液的制備：菌齡較老的細菌容易失落鞭毛，所以在染色前應將待染細菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培養基斜面上連續移接3-5代，以增強細菌的運動力。最后一代菌種放恒溫箱中培養12—16h。①取菌要取菌落邊緣的幼齡菌體。②取菌后的接種環在載片上的蒸餾水中輕輕沾幾下即可，不要用力太猛，更不能用接種環大幅度涂開；否則鞭毛易脫落，造成染色失敗。③鞭毛染色的玻片只能自然干燥，不能用熱風吹干，不能熱固定，這是由于加熱后菌體易變形，鞭毛易脫落，影響觀察。④A、B染液染完后用蒸餾水（自來水效果差）沖洗時一定要充分，背景很臟，鞭毛不易被觀察到，影響實驗效果。⑤加B染液后，將玻片稍加熱（但不能太熱，更不能沸騰或蒸干）使其微冒蒸汽，染色效果較不加熱為好。染色用玻片干凈無油污是鞭毛染色成功的先決條件。注意事項（二）細菌的運動性觀察懸滴法：1.制備菌液：在幼齡菌斜面上，滴加3-4滴生理鹽水，制成輕度混濁的菌懸液。2.滴加菌液：加1滴菌液于蓋玻片的中央，也可用接種環挑取一環菌液于玻片中央，并用記號筆在菌液的邊緣做一記號，以便在顯微鏡觀察時，易于尋找菌液的位置。4.鏡檢：

先用低倍鏡找到標記，再稍微移動凹玻片即可找到菌滴的邊緣，然后將菌液移到視野中央換高倍鏡觀察。由于菌體是透明的，鏡檢時可適當縮小光圈增大反差，便于觀察。鏡檢時要仔細辨別是細菌的運動還是分子運動（即布朗運動），前者在視野下可見細菌自一處游動至他處，而后者僅在原處左右擺動。細菌的運動速度依菌種不同而異，應仔細觀察。注意事項1、檢查細菌運動的載玻片和蓋玻片都要潔凈無油，否則將影響細菌的運動。2、制水封片時菌液不可加得太多，過多的菌液會在蓋玻片下流動，因而在視野內只見大量的細菌朝一個方向運動，從而影響了對細菌正常運動的觀察。3、若使用油鏡觀察，應在蓋玻片上加香柏油一滴。五、實驗作業：1.繪出鞭毛菌（自制片子或傷寒桿菌）的形態圖.2.用鞭毛染色法準確鑒定一株細菌是否具有鞭毛，要注意哪些環節？3.懸滴法中，為什么加的菌液不能大多？如果發現顯微鏡視野內大量細菌向一個方向流動，你認為是什么原因造成的？