犬細小病毒VP2基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達犬細小病毒VP2基【關鍵詞】犬細小病毒vp2基因畢赤酵母真核表達lningfvp2genefanineparvvirusandexpressininpihiapastris(1.llegefveterinaryediinefhineseagriultureuniversity，beijing100094；2.natinalveterinarydiagnstienterfinistryfagriulture，beijing100094，hina)【keyrds】pvvp2gene;pihiapastris;eukarytiexpressin犬細小病毒〔anineparvvirus，pv〕是細小病毒科細小病毒屬成員。犬感染可引起犬出血性腹瀉和心肌炎，血液中的白細胞大量減少，病癥與貓泛白細胞減少癥相似，在幼犬中的發病率和死亡率都很高，是危害我國養犬業最為嚴重的傳染病之一，可造成成宏大的經濟損失。病毒基因組主要編碼兩種構造蛋白：vp1和vp2，vp1基因全長2256nt，vp2基因全長1755nt，vp1端氨基酸和vp2蛋白的n端氨基酸序列互相重疊。vp1和vp2蛋白在病毒感染過程中起著極為重要的作用。vp2基因編碼pv的主要抗原決定簇，可誘導機體產生中和抗體，vp2蛋白具有血凝活性［1］。說明vp2蛋白具有用于pv病預防免疫的潛能，同時還可能在pv病的診斷與免疫評價上具有重要作用。本研究利用pihiapastris酵母表達系統表達pvvp2蛋白。將為pv病的診斷和疫苗研究奠定基矗1材料和方法1.1材料1.1.1毒株、菌株和載體：本文所用的pv北京毒株由農業部獸醫診斷中心保存。e.lij109感受態細胞購自prega公司，表達載體ppizαa、畢赤酵母gs115菌株及抗生素zeint購自invitrgen公司。1.1.2主要試劑、試劑盒及培養基：限制性內切酶erⅱxbaⅱsaⅱdnaaker購自大連寶生物技術；taqdnaplyerase、dntp、t4dna連接酶購自prega公司。小量膠回收試劑盒、酵母基因組dna提取試劑盒購自上海華舜生物工程公司，質粒純化試劑盒購自博大泰克公司，低鹽lb、ypd、dh、h、bgy、by等培養基均按照invitrgen公司畢赤酵母表達說明書配制［2］。辣根過氧化酶標記羊抗犬酶標二抗購自中杉公司。1.2方法1.2.2pr擴增vp2基因：以上步提取的dna為模板，利用特異性引物vp2f/vp2r擴增vp2基因。pr反響體系20μl：ddh28μl，10×prbuffer2μl，2.5l/ldntp2μl，15l/lg2+2μl，10pl/μl目的基因上下游引物混合液2μl，0.5u/μltaqdna聚合酶2μl，pvdna模板2μl。反響條件為95℃預變性8in；94℃變性2in，54℃退火1in，72℃延伸2in，30個循環后，72℃延伸10in。95℃預變性8in后立即參加taqdna酶。pr產物在1%瓊脂糖凝膠中電泳。1.2.4重組表達質粒的pr鑒定:反響體系為20μl，引物為5′ax1和3′ax1；反響條件為：94℃預變性3in，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環后，72℃延伸10in。1.2.6重組表達質粒的序列測定:重組表達質粒的序列測定由北京生物工程技術完成。1.2.8酵母轉化子的表型挑選:在h平板上與dh平板上生長速度一致的重組子為甲醇利用正表型〔ut+表型〕；在dh平板上生長速度快，而在h平板上生長速度慢的重組子為甲醇利用慢表型〔uts表型〕。將轉化子進展表型篩眩1.2.9酵母轉化子的pr鑒定:挑取數個重組子，按酵母dna提取試劑盒說明書抽提酵母轉化子基因組dna作為模板，進展pr鑒定。1.2.10重組酵母菌株的表達及鑒定:1.2.10.1重組酵母菌株的表達:將挑選的陽性轉化子接種到酵母菌100lbgy培養基中29.5℃，280r/in，振蕩培養至菌液濃度a600值達3～6時，25℃、3000r/in，離心5in后收獲菌體沉淀，用10lby重懸酵母菌體進展誘導表達。每隔12h取樣并同時補加0.5%的甲醇和0.004%的組氨酸。2結果2.1vp2基因的擴增2.3vp2基因在酵母菌中的表達分析3討論【參考文獻】［1］殷震，劉景華.動物病毒學〔第2版〕［］.北京:科學出版社，1997：1145-1163.［2］invitrgen.pihiaexpressinkit［］.alifrnia:invitrgen，2002，53-58.［3］薩母布魯克j，拉塞爾d，著.黃培堂，譯.分子克隆實驗指南(第3版)［］.科學出版社，2002:32-99.［4］隋少飛，陳松林.巴氏畢赤酵母表達系統的特點及其研究進展［j］.生物技術通報，2022，3:1-4.［8］kjeldsent.yeastseretryexpressinfinsulinpreursrs［j］.applirbilbitehnl.2000，54(3):277-286.［9］yasuharat，takait，yuukit，etal.bilgiallyativerebinantfrsfaajrhusedustitegrup1allergenderf1ithfullativitiesfbthysteineprteaseandigebinding［j］.linexpallergy.2001，31(1):116-124.［10］丁銀巧，張劍銳，張云霞，等.口蹄疫病毒非構造蛋白3ab在畢赤酵母中的表達［j］.中國人獸共患病學報，2022，22(12):1100-1103.［11］楊玲，徐向明，殷俊等.犬細小病毒別離株vp2基