第2節(jié)微生物培養(yǎng)與應(yīng)用

1.微生物的分離和培養(yǎng)。2.某種微生物數(shù)量的測定。3.培養(yǎng)基對微生物的選擇作用。

考綱考情一、微生物的實驗室培養(yǎng)1.培養(yǎng)基（1）概念：人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配置出供其生長繁殖的營養(yǎng)物質(zhì)。（2）成分：一般包括碳源、氮源、水、無機(jī)鹽，還要滿足不同微生物生長對PH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的需求（3）分類：固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)點(diǎn)梳理

（1）含義：指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。（2）獲得純凈培養(yǎng)物關(guān)鍵：防止外來雜菌入侵3.純化大腸桿菌以及菌種的保藏（1）制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的步驟：計算-稱量-溶化-調(diào)pH-分裝-滅菌-倒平板（2）純化大腸桿菌原理：在培養(yǎng)基上將細(xì)菌稀釋或分散成單個細(xì)胞，使其長成單個菌落，這個菌落就是一個純化的細(xì)菌菌落。2.無菌技術(shù)（3）方法：平板劃線法和稀釋涂布平板法(4)菌種的保藏：短期保存：固體斜面培養(yǎng)基上4OC保存，菌種易被污染或產(chǎn)生變異長期保存：甘油瓶中，置于－20OC的冷凍箱中保存。二、土壤中分解尿素細(xì)菌的分離和計數(shù)1.菌種的篩選：

使用尿素是唯一氮源的選擇培養(yǎng)基2.統(tǒng)計菌落數(shù)目：

常用方法稀釋涂布平板法、顯微鏡直接計數(shù)法3.細(xì)菌分離與計數(shù)的實驗流程：

土壤取樣-制備培養(yǎng)基-微生物的培養(yǎng)與觀察-細(xì)菌計數(shù)三、分解纖維素的微生物的分離（1）組成：

纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認(rèn)為它至少包括三種組分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶1.纖維素酶纖維素纖維二糖葡萄糖C1酶Cx酶葡萄糖苷酶（2）作用（1）篩選纖維素分解菌方法：______________。該方法可以通過_____反應(yīng)直接篩選。剛果紅染色法顏色2.菌種的篩選（2）原理：剛果紅可以與纖維素形__________，當(dāng)纖維素被_________分解后，紅色復(fù)合物無法形成，出現(xiàn)以_____________為中心的________，我們可以通過___________來篩選纖維素分解菌。紅色復(fù)合物纖維素酶纖維素分解菌

透明圈是否產(chǎn)生透明圈土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上挑選產(chǎn)生透明圈的菌落3.篩選流程：重難點(diǎn)整合一．培養(yǎng)基的種類及用途(一）按物理狀態(tài)分類培養(yǎng)基種類特點(diǎn)用途液體培養(yǎng)基不加凝固劑工業(yè)生產(chǎn)固體培養(yǎng)基加凝固劑(如瓊脂)微生物分離、鑒定、活菌計數(shù)、菌種保藏(二)按功能分類種類制備方法原理用途舉例選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)基中加入某些化學(xué)物質(zhì)依據(jù)某些微生物對某些物質(zhì)的抗性而設(shè)計從眾多微生物中分離所需的微生物加入青霉素分離得到酵母菌和霉菌鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品依據(jù)微生物產(chǎn)生的某種代謝產(chǎn)物與培養(yǎng)基中的特定指示劑或化學(xué)藥品反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征變化而設(shè)計鑒別不同種類的微生物伊紅－美藍(lán)培養(yǎng)基可以鑒別大腸桿菌

幾種典型微生物的篩選方法(1)培養(yǎng)基中加入青霉素可以分離出酵母菌和霉菌。(2)培養(yǎng)基中加入高濃度的食鹽可得到金黃色葡萄球菌。(3)培養(yǎng)基中缺乏氮源時，可以分離固氮微生物。(4)當(dāng)培養(yǎng)基的某種營養(yǎng)成分為特定化學(xué)成分時，也具有分離效果。如當(dāng)石油是唯一碳源時，可以抑制不能利用石油的微生物生長，使能夠利用石油的微生物生存，達(dá)到分離能消除石油污染的微生物的目的。

(5)改變微生物的培養(yǎng)條件，也可以達(dá)到分離微生物的目的，如將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境中只能得到耐高溫的微生物。二.微生物的純化培養(yǎng)——平板劃線法與稀釋涂布平板法(1)接種環(huán)的灼燒：①第一次劃線前：殺死接種環(huán)上的微生物，避免污染培養(yǎng)物；②以后每次劃線前：殺死殘留菌種，保證每次劃線菌種來自上次劃線末端；③劃線結(jié)束后：殺死殘留菌種，避免污染環(huán)境和感染操作者。（一）平板劃線法

目的：在培養(yǎng)基上形成由單個細(xì)胞繁殖而來的子細(xì)胞群體——菌落

(2)灼燒接種環(huán)之后，要冷卻后再進(jìn)行操作，以免溫度太高殺死菌種。(3)劃線時最后一區(qū)域不要與第一區(qū)域相連。(4)劃線用力要大小適當(dāng)，防止用力過大將培養(yǎng)基劃破（二）稀釋涂布平板法

(1)稀釋操作時：每支試管及其中的9mL水、移液管等均需滅菌；操作時，試管口和移液管應(yīng)在離火焰1～2cm處。(2)涂布平板時：①涂布器用體積分?jǐn)?shù)為70%酒精消毒，取出時，讓多余酒精在燒杯中滴盡，然后將沾有少量酒精的涂布器在酒精燈火焰上引燃；②不要將過熱的涂布器放在盛放酒精的燒杯中，以免引燃其中的酒精；③酒精燈與培養(yǎng)皿距離要合適，移液管管頭不要接觸任何物體區(qū)分平板劃線法和稀釋涂布平板法(1)平板劃線法和稀釋涂布平板法都能使細(xì)菌純化，但平板劃線法不易分離出單個菌落，不能計數(shù)；稀釋涂布平板法能使單菌落分離，便于計數(shù)。(2)稀釋涂布平板法的缺點(diǎn)：稀釋涂布平板法統(tǒng)計樣品中菌落的數(shù)目往往比實際數(shù)目低。這是因為當(dāng)兩個或多個細(xì)胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。三.消毒和滅菌的比較條件結(jié)果常用方法應(yīng)用范圍消毒較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部的部分對人體有害的微生物煮沸消毒法日常用品巴氏消毒法不耐高溫的液體化學(xué)藥劑消毒法用酒精擦拭雙手，用氯氣消毒水源滅菌強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼燒滅菌法接種工具干熱滅菌法玻璃器皿、金屬工具高壓蒸汽滅菌法培養(yǎng)基及容器的滅菌三.消毒和滅菌的比較條件結(jié)果常用方法應(yīng)用范圍消毒較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部的部分對人體有害的微生物煮沸消毒法日常用品巴氏消毒法不耐高溫的液體化學(xué)藥劑消毒法用酒精擦拭雙手，用氯氣消毒水源滅菌強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼燒滅菌法接種工具干熱滅菌法玻璃器皿、金屬工具高壓蒸汽滅菌法培養(yǎng)基及容器的滅菌四．篩選菌株(1)原則：人為提供有利于目的菌生長的條件，同時抑制或阻止其他微生物的生長。(2)菌株篩選原理的比較土壤中分解尿素的細(xì)菌分解纖維素的微生物①選擇培養(yǎng)基的成分：尿素作為唯一的氮源②鑒定方法：在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，若指示劑變紅，pH升高，說明細(xì)菌能分解尿素①選擇培養(yǎng)基的成分：纖維素作為唯一的碳源②鑒定方法：剛果紅染色法，即剛果紅與纖維素形成紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被分解后，培養(yǎng)基出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈五.微生物的計數(shù)(1)兩種計數(shù)方法的比較比較項目間接計數(shù)法(稀釋涂布平板法)直接計數(shù)法(顯微計數(shù)法)原理當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌利用特定細(xì)菌計數(shù)板或血細(xì)胞計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積的樣品中微生物的數(shù)量比較項目間接計數(shù)法(稀釋涂布平板法)直接計數(shù)法(顯微計數(shù)法)公式每克樣品中的菌落數(shù)：(C÷V)×MC：某稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)；V：涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)；M：稀釋倍數(shù)每毫升原液所含細(xì)菌數(shù)：每小格平均細(xì)菌數(shù)×400×10000×稀釋倍數(shù)缺點(diǎn)當(dāng)兩