問題討論

燒傷病人的治療通常是取燒傷病人的健康皮膚進行自體移植，但對于大面積燒傷病人來講，健康皮膚很有限，使用他人皮膚來源不足，而且會產生排斥反應。請同學們想一想如何來治療該病人？取該患者的皮膚進行細胞培養,獲得足量的細胞后再移植動物細胞工程專題2細胞工程動物細胞培養動物細胞融合單克隆抗體技術核移植技術動物細胞工程常用技術(基礎技術)概念過程原理動物細胞培養組織離體,分散細胞、培養基、細胞生長和增殖細胞增殖條件應用細胞貼壁接觸抑制原代培養傳代培養細胞株細胞系動物細胞培養細胞貼壁接觸抑制原代培養傳代培養細胞株細胞系剪碎胰蛋白酶洗滌、稀釋、分離原代培養貼壁生長接觸抑制傳代培養

細胞在貼壁生長過程中,隨著細胞分裂,數量不斷增加,最后形成單層細胞,此時細胞間相互接觸,細胞分裂和生長停止。接觸抑制細胞貼壁現象思考題2.為何動物細胞培養過程將組織分散成單個細胞的呢？3.如何將動物組織分散成單個的細胞呢？4.胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可說明細胞間的物質是什么成份？成塊的組織細胞靠在一起,彼此限制了細胞的生長和增殖先用剪刀剪碎,后用胰蛋白酶處理胰蛋白酶水解蛋白質細胞間的成份是蛋白質1.動物細胞培養取材時，一般是取胚胎組織或幼齡動物的組織或器官，請解釋原因？胚胎組織或幼齡動物的組織或器官分裂、增殖旺盛5.胰蛋白酶能將細胞消化掉嗎？為什么？6.既然胰蛋白酶能將細胞消化掉，那將動物組織分散成單個細胞要注意什么問題呢？7.能夠用胃蛋白酶代替胰蛋白酶嗎？為什么？胰蛋白酶除了可以消化細胞間的蛋白質外，長時間的作用也會消化細胞膜蛋白，對細胞有損傷作用。注意必須控制好胰蛋白酶的消化時間不能。胃蛋白酶作用的適宜pH約為2，當pH大于6時，胃蛋白酶就會失去活性。而多數動物細胞培養的適宜pH為7.2~7.4，胃蛋白酶在此環境中沒有活性。8.動物細胞培養瓶內表面為何要光滑、無毒？9.培養瓶中的細胞培養到什么時候就不再分裂、增殖？易于培養細胞貼壁，進行生長增殖當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞分裂就會停止分裂增殖，這種現象叫接觸抑制。10.如何理解原代培養和傳代培養？上述過程中，在第一培養瓶中培養就是原代培養，之后轉移到其它培養瓶中培養就是傳代培養11.人類一般保存的是哪類細胞呢？為什么？10代以內的細胞，以保持細胞正常的二倍體核型。因為10~50代部分細胞的細胞核型可能發生變化，有少部分還發生突變向癌細胞方向發展多細胞動物和人體的細胞都生活在內環境中，根據你所學的內環境的知識，思考以下問題：1.體外培養細胞時需要提供哪些物質？

2.體外培養的細胞需要什么樣的環境條件？

討論葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素、促生長因子和動物血清等。適宜溫度、PH和氣體環境；無菌無毒環境動物細胞培養條件：1、無菌、無毒的環境添加一定量的抗生素，定期更換培養液2、營養葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素、動物血清等3、溫度和pH

36.5±0.5度,7.2~7.44、氣體環境：

O2和CO2（95%空氣和5%CO2

）保證細胞順利的生長增殖防止培養過程中的污染清除代謝產物，防止細胞內代謝產物積累對細胞自身造成危害維持培養液的pH動物細胞培養的應用1.大規模生產生物制品（病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體）2.獲得大量自身的皮膚細胞，用于植皮3.培養的動物細胞可以用于檢測有毒物質，判斷某種物質的毒性4.為治療和預防癌癥及其他疾病提供理論依據5.為基因工程提供受體細胞。植物組織培養和動物細胞培養的比較比較項目植物組織培養動物細胞培養原理培養基性質培養基特有成分培養結果培養目的植物體細胞株、細胞系快速繁殖、培育無病毒植株等獲得細胞或細胞產物蔗糖、植物激素葡萄糖、動物血清固體培養基液體培養基細胞的全能性細胞增殖克隆1、什么是克隆?2、以前學習過動物克隆的實例嗎？3、請簡述多莉克隆的過程？多莉羊卵細胞Ａ母綿羊Ｂ母綿羊乳腺細胞細胞質細胞核細胞核移植早期胚胎卵裂C母綿羊子宮胚胎移植多莉羊分娩妊娠多莉羊的培育過程融合后的卵細胞１、動物的克隆與植物克隆一樣嗎？２、用動物體細胞進行克隆的過程,其實際操作過程是什么？動物克隆過程的實際是細胞核移植不一樣３、閱讀課本P48，簡述高產牛體細胞核移植過程

電激處理使供體核進入受體卵母細胞構建重組胚胎卵母細胞采集、培養MⅡ期卵母細胞供體牛供體細胞注入去核卵母細胞代孕母牛克隆牛體細胞培養去核卵母細胞去核胚胎移植討論1.在體細胞的細胞核移植到受體卵母細胞之前，為什么必須先去掉受體卵母細胞的核？為使核移植的胚胎或動物的遺傳物質最大程度來自有重要利用價值的動物提供的體細胞，在供體細胞的細胞核移至受體細胞之前，必須將受體細胞的遺傳物質去掉或將其破壞。培養的動物細胞一般當傳代至10～50代左右時，部分細胞核型可能會發生變化，其細胞遺傳物質可能會發生突變，而10代以內的細胞一般能保持正常的二倍體核型。因此，在體細胞核移植中，為了保證供體細胞正常的遺傳基礎，通常采用傳代10代以內的細胞。2.用于核移植的供體細胞一般都選用傳代10代以內的細胞，想一想，這是為什么？3.你認為用上述體細胞核移植方法生產的克隆動物，是對體細胞供體動物進行了100%的復制嗎？為什么？絕大部分DNA來自于供體細胞核，但其核外還有少量的DNA，即線粒體DNA是來自于受體卵母細胞。此外，即便動物的遺傳基礎完全相同，但動物的一些行為、習性的形成與所處環境有很大關系，核供體動物生活的環境與克隆動物所生活的環境不會完全相同，其形成的行為、習性也不可能和核供體動物完全相同，從這一角度看，克隆動物不會是核供體動物100%的復制。概念過程原理動物體細胞核移植細胞核、去核卵母細胞、動物個體應用細胞核的全能性1.克隆動物作為生物反應器，生產醫用蛋白2.改良動物品種

3.治療人類疾病，作為供體4.保護瀕危動物體細胞核移植技術存在的問題許多克隆動物表現出遺傳和生理缺陷，如體型過大，異常肥胖，發育困難，臟器缺陷，免疫失調等。動物細胞細胞核移植技術中的3個易錯點1、動物細胞核移植技術，體現了動物細胞核的全能性而非細胞的全能性。2、克隆屬于無性繁殖，產生新個體的性別、絕大叔性狀與供核親本一致。3、核移植技術獲得的動物與供體動物性狀不完全相同的原因：

①克隆動物線粒體中的DNA來自去核卵母細胞；

②性狀受環境的影響；

③在個體發育過程中有可能發生基因突變。1、概念：也稱____________，是指兩個或多個動物細胞結合形成一個細胞的過程，融合后形成的具有原來兩個或多個細胞遺傳信息的______細胞，稱為雜交細胞。2、原理：動物細胞融合與植物原生質體融合的基本原理相同，都是磷脂分子重新排布。動物細胞融合細胞雜交單核細胞A細胞B雜種細胞滅活的病毒物理法：電激化學法：PEG仙臺病毒皰疹病毒新城雞瘟病毒動物細胞融合3、誘導方式物理方法：振動、離心、電激化學方法：聚乙二醇(PEG)動物細胞融合4、過程滅活的病毒顆粒黏附于細胞表面細胞膜被病毒顆粒穿通細胞膜連接細胞融合，形成雜種細胞細胞膜具有一定的流動性）5、意義：

細胞融合技術突破了有性雜交方法的局限，使____________成為可能。至今種間、屬間、科間，甚至動物和植物之間的細胞融合都已獲得了成功。目前，這一技術已經成為研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和生物新品種培育等的重要手段。特別是利用細胞融合技術而發展起來的雜交瘤技術，為制造__________開辟了新途徑。遠緣雜交單克隆抗體植物細胞雜交與動物細胞融合的比較比較項目植物體細胞雜交動物細胞融合細胞融合原理使用的酶誘導方法主要用途細胞膜的流動性細胞膜的流動性纖維素酶、果膠酶胰蛋白酶物理（離心、振蕩、電刺激）；化學（聚乙二醇）物理、化學方法（同左）；滅活的病毒獲得雜種植株制備單克隆抗體1．傳統抗體的獲得(1)方法：①向動物體內反復注射某種_____，使動物產生抗體；②從動物血清中分離所需_____。(2)特點：_______、純度低、_________。抗原抗體產量低特異性差制備單克隆抗體傳統抗體是多克隆抗體B1B2B312細菌32、單克隆抗體制備的原理◆利用

產生特異性抗體的功能。◆利用

無限增殖的特性。◆利用

技術將兩種細胞融合獲得雜交瘤細胞。◆利用

技術大量培養雜交瘤細胞。B淋巴細胞骨髓瘤細胞動物細胞融合動物細胞培養3、單克隆抗體的制備制備單克隆抗體骨髓瘤細胞免疫小鼠單克隆抗體篩選克隆、篩選體內培養體外培養B淋巴細胞（選擇培養基）（抗體檢測）

細胞融合多種雜交細胞雜交瘤細胞注射特定蛋白免疫小鼠培養小鼠骨髓瘤細胞B淋巴細胞骨髓瘤細胞（A）多種細胞多種雜交瘤細胞能分泌所需抗體的雜交瘤細胞選擇培養基篩選克隆化培養專一抗體檢測注射到小鼠腹腔內增殖體外培養單克隆抗體融合4．單克隆抗體的應用(1)優點：_________、_________、產量大。(2)應用：①作為診斷試劑，具有準確、高效、簡易、快速的優點。②用于_________和_________。特異性強靈敏度高治療疾病運載藥物抗（人絨毛膜促性腺激素）單克隆抗體

在受精后不久，胎盤滋養層細胞就會分泌人絨毛膜促性腺激素(HCG)，是由受孕婦女體內胎盤產生的一種糖蛋白類激素，在孕婦的尿液中大量存在。而在非妊娠婦女尿液中幾乎不含有。AB1、AB2、AB3。。。。。。專一抗體檢驗陽性：有限稀釋法多孔細胞培養板抗體檢測板

思考1：一種細菌進入實驗動物內環境后，為什么會有多種B淋巴細胞都能特異性識別該細菌？

分析：細菌表面有多種糖蛋白分子（如圖中的123）都可以作為______刺激實驗動物的B淋巴細胞，而一種B淋巴細胞只識別細菌表面的__________________并產生一種對應的抗體。因此實驗動物血液中會出現______種針對該細菌的抗體，但每一種抗體只能特異性的和細菌表面的一種____________________結合。

思考2：為什么會出現未融合的細胞和融合的具有同種核的細胞？分析：________________________________________________。抗原一種特定的糖蛋白多特異的糖蛋白分子因為融合的成功率不是百分之一百，并且融合是隨機的思考4：融合的雜交瘤細胞是一種嗎？為什么？分析：是多種，因為從小鼠脾臟中分離的____________是多種。思考5：如何從多種雜交瘤細胞中選出我們需要的那種？分析：通常用有限稀釋法，其原理是：將雜交瘤細胞培養液稀釋后滴入多孔板，如果稀釋度足夠高，多孔板的一個孔里就可能只有1個雜交瘤細胞，培養之后，用_____________等檢測每個小孔上清液里是否含有我們需要的特異性的抗體。這樣經過多次克隆化培養以及有限稀釋法的篩選，就能選出需要的那種雜交瘤細胞。B淋巴細胞標記的抗原

下圖為某同學根據雜交瘤技術的方法，設計的生產破傷風桿菌的實驗方案2、該方案能達到預期效果嗎？為什么？4、圖中B為________過程，常用_________作為誘導劑，該細胞繼承___________的遺傳特性，既能__________,又能___________。1、該實驗方案的目的是__________3、A是從小鼠的脾臟中取得_______,該細胞能夠產生______5、C過程指細胞培養，該過程包括_____培養和_____培養兩個階段，其中_____代以內的的細胞屬于細胞株。制備單克隆抗體B細胞抗體細胞融合滅活病毒雙親細胞分泌抗體無限增殖原代傳代50B體外培養骨髓瘤細胞雜交瘤細胞足夠數量的細胞群注射到小鼠腹腔AC練一練A、B細胞為動物細胞,請據圖回答問題:A細胞B細胞C細胞D細胞(1)若A細胞為骨髓瘤細胞B細胞為淋巴細胞,那么D細胞稱為