第一篇分子與細胞生物學基礎(chǔ)

第三章植物蛋白質(zhì)組學第一篇分子與細胞生物學基礎(chǔ)1

目錄

1.蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)組學

2.蛋白質(zhì)組和基因組

3.植物蛋白質(zhì)組的研究方法

3.1蛋白質(zhì)雙向電泳

3.2氨基酸序列測定

3.3質(zhì)譜

3.4生物信息學

4.植物蛋白質(zhì)組學的研究進展

4.1植物發(fā)育蛋白質(zhì)組學的研究

4.2植物環(huán)境蛋白質(zhì)組學的研究

4.3磷酸化蛋白質(zhì)組學的研究

5.植物蛋白質(zhì)組學研究的前景和挑戰(zhàn)

5.1表達的整體分析以及蛋白質(zhì)組編目

5.2大規(guī)模的蛋白質(zhì)功能研究

5.3建立完整的蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)目錄

1.蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)組學2

1.蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)組學蛋白質(zhì)組：由一個基因組所表達的所有蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學：研究在特定時間或環(huán)境下某個細胞或某種組織的基因組所表達的全部蛋白質(zhì)。它不是按照傳統(tǒng)的方式孤立地研究某種蛋白質(zhì)分子的功能,而是應(yīng)用各種蛋白質(zhì)組學技術(shù)研究某種蛋白質(zhì)在復雜的細胞環(huán)境中的功能。

蛋白質(zhì)組學分為表達蛋白質(zhì)組學和細胞圖譜蛋白質(zhì)組學。前者利用各種先進技術(shù)研究蛋白質(zhì)表達的整體變化,即研究在機體的生長發(fā)育、疾病和死亡的不同階段中,細胞與組織的蛋白質(zhì)組分的變化;后者主要通過分離蛋白質(zhì)復合物系統(tǒng)地研究蛋白質(zhì)間的相互作用1.蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)組學蛋白質(zhì)組：由一個基因組所表達的所32.蛋白質(zhì)組和基因組

蛋白質(zhì)組和基因組的關(guān)系：它們在概念上有相關(guān)性，代表某一蛋白質(zhì)組的蛋白質(zhì)是由基因組編碼的，而基因的功能是通過蛋白質(zhì)表現(xiàn)出來的。蛋白質(zhì)組學研究遠比基因組研究復雜：（1）蛋白質(zhì)組的復雜性遠遠高于基因組一個基因≠一個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物≠一個蛋白質(zhì)基因→不同的轉(zhuǎn)錄起始和mRNA的剪切→不同的mRNA→不同的翻譯起始→不同的蛋白質(zhì)→翻譯后修飾→蛋白質(zhì)的功能、穩(wěn)定性、細胞定位發(fā)生變化2.蛋白質(zhì)組和基因組蛋白質(zhì)組和基因組的關(guān)系：它們在4

（2）基因組的組成是固定的，蛋白質(zhì)組的組成是動態(tài)的。基因組在所有細胞中幾乎都是相同的，與之不同，蛋白質(zhì)組具有很高的細胞和組織特異性。基因組是相對穩(wěn)定的，蛋白質(zhì)組處于高度動態(tài)變化之中。（3）細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的拷貝數(shù)（108）遠比基因拷貝數(shù)大（105）。（4）基因可采用PCR擴增和自動測序，而蛋白質(zhì)還沒有這些技術(shù)。

（2）基因組的組成是固定的，蛋白質(zhì)組的組成是動態(tài)的。5

3.1蛋白質(zhì)雙向電泳

3.2氨基酸序列測定

3.3質(zhì)譜技術(shù)

3.4生物信息學3.植物蛋白質(zhì)組的研究方法3.植物蛋白質(zhì)組的研究方法6蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)路線流程圖蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)路線流程圖73.1蛋白質(zhì)雙向電泳

蛋白質(zhì)雙向電泳(2-DE)：根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點和相對分子質(zhì)量的不同，分別通過第一維等電聚焦和第二維SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳對蛋白質(zhì)混合物進行分離。

電泳后對蛋白質(zhì)進行染色，常用的染色方法有考馬斯亮藍染色、銀染以及蛋白質(zhì)熒光檢測方法。

蛋白質(zhì)雙向電泳圖3.1蛋白質(zhì)雙向電泳蛋白質(zhì)雙向電泳(2-DE)：根據(jù)83.1.1利用雙向電泳研究植物蛋白質(zhì)組的基本流程

蛋白樣品提取→雙向電泳分離蛋白→蛋白質(zhì)染色→雙向電泳圖譜分析

→蛋白點切割→蛋白酶解和鑒定

該流程最關(guān)鍵的步驟是蛋白質(zhì)樣品的提取，它關(guān)系到下游蛋白質(zhì)的分離和鑒定是否能夠成功。好的蛋白質(zhì)樣品要求從某一個細胞、組織或器官中提取盡可能多的蛋白質(zhì)，以最大限度地反應(yīng)這個蛋白質(zhì)組的全貌。3.1.1利用雙向電泳研究植物蛋白質(zhì)組的基本流程93.1.2雙向電泳的缺陷和解決方法

解決方法：

1.對樣品進行前期分級

2.對不同的細胞器官或組織進行分離

3.使用寬膠條，符合重疊窄IPG凝膠

4.雙向熒光差異凝膠電泳

5.多塊膠垂直二維SDS系統(tǒng)

6.雙向電泳工作站缺陷分辨率低重復性差耗時、自動化程度低蛋白質(zhì)定量困難3.1.2雙向電泳的缺陷和解決方法缺陷分辨率低重復10

通過使用不同強度的離液劑和表面去垢劑，并進行分步溶解分離，可以獲得更多的蛋白質(zhì)，同時降低蛋白質(zhì)樣品的復雜性，提高2-DE的分辨率。如：ReadyPrep順序抽提試劑盒。

ReadyPrep試劑盒所需樣品量較少，不需要額外的設(shè)備，是一種既節(jié)省時間又節(jié)省設(shè)備的好方法。

ReadyPrep

產(chǎn)品線包含一系列2-DE樣品制備試劑盒，不僅適用于通用樣品（總蛋白）處理，而且可以將復雜樣品按特定方法分級。處理通用樣品的試劑盒包括總蛋白抽提和蛋白凈化（clean-up）。樣品分級試劑盒可用來降低樣品復雜程度，同時有助于低豐度蛋白的富集和鑒定。這類試劑盒又分為兩種，一種是基于蛋白不同的亞細胞定位來分離，另一種是對細胞總蛋白進行分級。下面的流程圖將幫您確定哪種試劑盒對您更適合。

一.對樣品進行前期分級ReadyPrep產(chǎn)品線包含一11植物蛋白質(zhì)組學課件12

順序抽提試劑盒可將樣品分離成3個遞增溶解度組份。這3個分離份依次分離，使我們能觀察到其它方法觀察不到的蛋白。通過對每一分離份逐級使用更強的去垢劑，可提供遞增的溶解度.

試劑一試劑二試劑三順序抽提試劑盒可將樣品分離成3個遞增溶解度組份。這13

二、對不同的細胞或組織進行分離

通過亞細胞分類，比如單獨提取細胞壁、細胞核、細胞膜、線粒體和葉綠體等的蛋白質(zhì)組分。優(yōu)點：降低蛋白質(zhì)樣品的復雜性，提高分辨率，了解蛋白質(zhì)的定位。

三、使用寬膠條，符合重疊窄IPG凝膠

2-DE的分辨率通常認為與有效的分離面積成正比，使用寬分離距離的IPG膠和長距離的二維SDS可以提高2-DE的分辨率。選用不同pH范圍的膠條，通過重疊幾次窄范圍的IPG凝膠電泳結(jié)果，可以提高在某一區(qū)段尤其是蛋白質(zhì)集中區(qū)段內(nèi)的分辨率

二、對不同的細胞或組織進行分離通過亞細胞分類，14pH范圍3—104—75.0—6.0上樣量40ug80ug120ugpH范圍3—1015四.雙向熒光差異凝膠電泳原理：雙向熒光差異凝膠系統(tǒng)（DIGE）在傳統(tǒng)雙向電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合了多重熒光分析的方法，在同一塊膠上共同分離多個分別由不同熒光標記的樣品，分析它們之間的差異性。極大地提高了結(jié)果的準確性，可靠性和重復性。

五.多塊膠垂直二維SDS系統(tǒng)

優(yōu)點：提高二維電泳效率和實驗重復性

六.2-DE工作站優(yōu)點：提高以2-DE為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組研究的自動化程度和工作效率

四.雙向熒光差異凝膠電泳163.2氨基酸序列測定

氨基酸測序主要使用的是N端測序Edman化學降解法。降解反應(yīng)分三步進行：第一步：偶聯(lián)反應(yīng)，降解試劑（PITC）與多肽鏈的游離氨基作用，形成PCT-肽。第二步：環(huán)化斷裂反應(yīng)，PCT-肽在無水強酸介質(zhì)如三氟乙酸中，最靠近PTC基的肽鍵將發(fā)生斷裂，同時PTC-氨基酸殘基環(huán)化成ATZ衍生物。第三步：轉(zhuǎn)化反應(yīng)，首先水解生成PTC-氨基酸，然后環(huán)化成PTH-氨基酸，其在紫外區(qū)有很強的吸收峰。它可以被各種技術(shù)層析出來，然后鑒定。每輪Edman反應(yīng)，可以鑒定一個氨基酸，剩下的減少一個殘基的肽鏈便在它的N端暴露一個新的氨基，又可參與第二輪反應(yīng)。3.2氨基酸序列測定氨基酸測序主要使用的是N端測序17偶聯(lián)反應(yīng)環(huán)化斷裂反應(yīng)轉(zhuǎn)化反應(yīng)偶聯(lián)反應(yīng)環(huán)化斷裂反應(yīng)轉(zhuǎn)化反應(yīng)183.3質(zhì)譜質(zhì)譜儀離心源質(zhì)量分析器離子檢測器基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）電噴霧電離（ESI）飛行時間（TOF）四級桿（Q）離子阱（IT）常用的質(zhì)譜儀有：MALDI-TOF-MSESI-Q-MSESI-IT-MS傅里葉變換離子回旋共振么質(zhì)樸（FTMS）3.3質(zhì)譜離心源質(zhì)量分析器離子檢測器基質(zhì)輔助激光解吸電離（19進樣系統(tǒng)離子源質(zhì)量分析器檢測器

質(zhì)譜分析原理進樣系統(tǒng)離子源質(zhì)量分析器檢測器質(zhì)譜分析原理20TypicalresultfromMALDI-TOFTypicalresultfromMALDI-TOF21Peptidefingerprinting(PMF)withMALDI-TOF

trypticdigestionGelProteinDatabase?123compare:??isidenticalto??massspectrometrystoreddataortheoretical?peptidesPeptidefingerprinting(PMF)w22各種質(zhì)譜儀的適用范圍：MALDI-TOF-MS：分析鑒定一些相對比較簡單的多肽混合物和進行高通量蛋白質(zhì)組的研究。ESI-MS：分析復雜的蛋白質(zhì)樣品，鑒定組成蛋白質(zhì)的氨基酸序列和蛋白質(zhì)的翻譯后修飾。FTMS：鑒定氨基酸的序列和分析蛋白質(zhì)修飾。Bottom-up蛋白質(zhì)組學：需要將蛋白質(zhì)樣品進行蛋白酶水解。如：MALDI-TOF-MSESI-Q-MSESI-IF-MSTop-down蛋白質(zhì)組學：可以直接分析完整的蛋白質(zhì)樣品，不需要經(jīng)過2-DE的前處理。如：FTMS各種質(zhì)譜儀的適用范圍：Bottom-up蛋白質(zhì)組學：需要將蛋233.4生物信息學3.4.1蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)組包括大量的信息：蛋白質(zhì)的序列信息、加工和修飾信息、表達結(jié)構(gòu)功能信息、與其他蛋白質(zhì)形成復合物的信息。

蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫擬南芥數(shù)據(jù)庫擬南芥蛋白數(shù)據(jù)庫PAT苜蓿數(shù)據(jù)庫DOME3.4.2蛋白質(zhì)鑒定分析軟件

例如：2-DE成像分析軟件：Melanie,QUEST

蛋白質(zhì)鑒定軟件：MASCOT,PROWL3.4生物信息學3.4.1蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)244.植物蛋白質(zhì)組的研究進展4.1發(fā)育蛋白質(zhì)組學的研究

發(fā)育蛋白質(zhì)組：指植物在某一特定的生長發(fā)育時期，在特定的生長條件下，特定的細胞、組織或器官中所表達的所有蛋白質(zhì)。

發(fā)育蛋白質(zhì)組學：它揭示了在每一個特定時期所表達的蛋白質(zhì)和這些蛋白質(zhì)在特殊的生長時期可能發(fā)揮的作用，是進一步了解和深入研究蛋白質(zhì)功能的基礎(chǔ)。雙子葉植物：開展了根、莖、葉、花、種子和果實的蛋白質(zhì)組學組研究課題。單子葉植物：增加了葉鞘、花藥、胚、胚乳等蛋白質(zhì)組的研究課題細胞器：細胞壁、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞膜、葉綠體、線粒體等4.植物蛋白質(zhì)組的研究進展4.1發(fā)育蛋白質(zhì)組學的研究雙子254.2植物環(huán)境蛋白質(zhì)組學的研究

4.3磷酸化蛋白質(zhì)組學的研究

環(huán)境因素非生物因素：厭氧、冷、熱、干旱、鹽、重金屬等生物逆境：植物真菌、病毒植物激素：生長素、赤霉素、脫落酸、乙烯等

研究與環(huán)境因素相關(guān)的蛋白質(zhì)，觀察它們在逆境環(huán)境條件下表達量的變化，并研究它們是如何抵抗外界不利的生長環(huán)境，維持細胞的生命活動環(huán)境蛋白質(zhì)組學：4.2植物環(huán)境蛋白質(zhì)組學的研究環(huán)境因素非生物因素：厭氧、26

蛋白磷酸化是植物細胞將外界信號傳遞到細胞內(nèi)的一個重要手段，磷酸化可以改變蛋白質(zhì)的生物活性、亞細胞定位，影響蛋白質(zhì)之間的相互作用，更重要的是這種變化是雙向的，及蛋白質(zhì)的活性、細胞定位等可以通過磷酸化和去磷酸化來調(diào)節(jié)。

研究現(xiàn)狀：植物磷酸化蛋白質(zhì)組的研究還是以單個蛋白質(zhì)為主，采用的技術(shù)手段有Westernblot,2-DE,用MS/MS分析磷酸化酯酶處理后的蛋白質(zhì)樣品等。近年來隨著各種新技術(shù)的發(fā)展，植物磷酸化蛋白質(zhì)組的研究也有了很大的進展。比如用2-DE和MS/MS聯(lián)用，堅定了馬鈴薯線粒體內(nèi)14個磷酸化蛋白，擬南芥的質(zhì)膜磷酸化蛋白質(zhì)組研究共鑒定了300多個磷酸化位點。蛋白磷酸化是植物細胞將外界信號傳遞到細胞內(nèi)的一個重275.植物蛋白質(zhì)組學研究的前景和挑戰(zhàn)

植物蛋白質(zhì)組學的研究與應(yīng)用面臨3個主要問題：

1.表達的整體分析以及蛋白質(zhì)組編目大規(guī)模整體性的分析蛋白質(zhì)在某一個細胞或組織中的含量以及動態(tài)表達是蛋白質(zhì)組學的研究目標之一。

2.大規(guī)模的蛋白質(zhì)功能研究蛋白質(zhì)最大的挑戰(zhàn)是鑒定每一個蛋白質(zhì)以及它們的異構(gòu)體的功能，一個較有前景的策略是通過酵母雙雜交系統(tǒng)整體性研究植物蛋白質(zhì)之間的相互作用。

3.建立完整的蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)建立蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)，不僅可以提供蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系的信息，而且還可以和基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、代謝組學等信息聯(lián)系起來。

5.植物蛋白質(zhì)組學研究的前景和挑戰(zhàn)植物蛋白質(zhì)組學的研究與28

謝謝謝謝29

基因組(DNA)

轉(zhuǎn)錄組(RNA)蛋白質(zhì)組(PROTEIN)CitrateCycle代謝組(biochemicalmolecular)基因組(DNA)轉(zhuǎn)錄組(RNA)蛋白質(zhì)組(PR30蛋白質(zhì)組學解決的問題細胞中蛋白質(zhì)的含量蛋白質(zhì)活性蛋白質(zhì)的修飾蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系蛋白質(zhì)的定位蛋白質(zhì)組學細胞中蛋蛋白質(zhì)活性蛋白質(zhì)的修飾蛋白質(zhì)的定位31實例植物組織2-DE分析pH3

pH10100KD10KD物種：水稻組織名稱：根部制備方法：液氮研磨+TCA-丙酮沉淀法上樣量：500μg電泳種類：pH值3-10NL，13cm，12.5%染色方法：膠體考馬斯亮藍染色法IPG←實例植物組織2-DE分析pH332常見顯色方法比較顯色方法靈敏度優(yōu)點缺點考染200ng操作簡便，價格低廉，便于后續(xù)鑒定靈敏性差，所需上樣量大銀染0.1ng靈敏性好，所需樣品少操作復雜，不利于后續(xù)鑒定熒光法1ng線性動態(tài)范圍大，定量及定性較好，便于后續(xù)鑒定儀器及試劑昂貴常見顯色方法比較顯色方法靈敏度優(yōu)點缺點考染200ng操作簡便33消除蛋白質(zhì)疏水基團之間的相互作用，增強蛋白質(zhì)在其PI值處的溶解性兼性離子型去污劑：CHAPS，濃度2-4%；SB3-10、ASB-14

非離子型去污劑：NP-40和Triton-X-100

陰離子型去污劑：SDS，濃度低于0.25%（一）離液劑也稱變性劑，主要為尿素和硫脲，破壞蛋白分子間形成的氫鍵，防止由氫鍵引起的蛋白質(zhì)聚集及蛋白遷移中二級結(jié)構(gòu)的形成。（二）表面去垢劑消除蛋白質(zhì)疏水基團之間的相互作用，增強蛋白質(zhì)在其PI值處的溶34DIGE結(jié)果1，表達量一致，綠色熒光與紅色熒光重疊后表現(xiàn)為黃色2.表達量不同的，仍顯示紅色和綠色樣品1樣品2DIGE結(jié)果1，表達量一致，綠色熒光與紅色熒光重疊后表現(xiàn)為黃352-DE工作站圖像分析酶解Digester點切取Spotpicker膠hotel點樣Spotter質(zhì)譜2-DE膠2-DE工作站圖像分析酶解Digester點切取膠hotel36第一篇分子與細胞生物學基礎(chǔ)

第三章植物蛋白質(zhì)組學第一篇分子與細胞生物學基礎(chǔ)37

目錄

1.蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)組學

2.蛋白質(zhì)組和基因組

3.植物蛋白質(zhì)組的研究方法

3.1蛋白質(zhì)雙向電泳

3.2氨基酸序列測定

3.3質(zhì)譜

3.4生物信息學

4.植物蛋白質(zhì)組學的研究進展

4.1植物發(fā)育蛋白質(zhì)組學的研究

4.2植物環(huán)境蛋白質(zhì)組學的研究

4.3磷酸化蛋白質(zhì)組學的研究

5.植物蛋白質(zhì)組學研究的前景和挑戰(zhàn)

5.1表達的整體分析以及蛋白質(zhì)組編目

5.2大規(guī)模的蛋白質(zhì)功能研究

5.3建立完整的蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)目錄

1.蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)組學38

1.蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)組學蛋白質(zhì)組：由一個基因組所表達的所有蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學：研究在特定時間或環(huán)境下某個細胞或某種組織的基因組所表達的全部蛋白質(zhì)。它不是按照傳統(tǒng)的方式孤立地研究某種蛋白質(zhì)分子的功能,而是應(yīng)用各種蛋白質(zhì)組學技術(shù)研究某種蛋白質(zhì)在復雜的細胞環(huán)境中的功能。

蛋白質(zhì)組學分為表達蛋白質(zhì)組學和細胞圖譜蛋白質(zhì)組學。前者利用各種先進技術(shù)研究蛋白質(zhì)表達的整體變化,即研究在機體的生長發(fā)育、疾病和死亡的不同階段中,細胞與組織的蛋白質(zhì)組分的變化;后者主要通過分離蛋白質(zhì)復合物系統(tǒng)地研究蛋白質(zhì)間的相互作用1.蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)組學蛋白質(zhì)組：由一個基因組所表達的所392.蛋白質(zhì)組和基因組

蛋白質(zhì)組和基因組的關(guān)系：它們在概念上有相關(guān)性，代表某一蛋白質(zhì)組的蛋白質(zhì)是由基因組編碼的，而基因的功能是通過蛋白質(zhì)表現(xiàn)出來的。蛋白質(zhì)組學研究遠比基因組研究復雜：（1）蛋白質(zhì)組的復雜性遠遠高于基因組一個基因≠一個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物≠一個蛋白質(zhì)基因→不同的轉(zhuǎn)錄起始和mRNA的剪切→不同的mRNA→不同的翻譯起始→不同的蛋白質(zhì)→翻譯后修飾→蛋白質(zhì)的功能、穩(wěn)定性、細胞定位發(fā)生變化2.蛋白質(zhì)組和基因組蛋白質(zhì)組和基因組的關(guān)系：它們在40

（2）基因組的組成是固定的，蛋白質(zhì)組的組成是動態(tài)的。基因組在所有細胞中幾乎都是相同的，與之不同，蛋白質(zhì)組具有很高的細胞和組織特異性。基因組是相對穩(wěn)定的，蛋白質(zhì)組處于高度動態(tài)變化之中。（3）細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的拷貝數(shù)（108）遠比基因拷貝數(shù)大（105）。（4）基因可采用PCR擴增和自動測序，而蛋白質(zhì)還沒有這些技術(shù)。

（2）基因組的組成是固定的，蛋白質(zhì)組的組成是動態(tài)的。41

3.1蛋白質(zhì)雙向電泳

3.2氨基酸序列測定

3.3質(zhì)譜技術(shù)

3.4生物信息學3.植物蛋白質(zhì)組的研究方法3.植物蛋白質(zhì)組的研究方法42蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)路線流程圖蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)路線流程圖433.1蛋白質(zhì)雙向電泳

蛋白質(zhì)雙向電泳(2-DE)：根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點和相對分子質(zhì)量的不同，分別通過第一維等電聚焦和第二維SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳對蛋白質(zhì)混合物進行分離。

電泳后對蛋白質(zhì)進行染色，常用的染色方法有考馬斯亮藍染色、銀染以及蛋白質(zhì)熒光檢測方法。

蛋白質(zhì)雙向電泳圖3.1蛋白質(zhì)雙向電泳蛋白質(zhì)雙向電泳(2-DE)：根據(jù)443.1.1利用雙向電泳研究植物蛋白質(zhì)組的基本流程

蛋白樣品提取→雙向電泳分離蛋白→蛋白質(zhì)染色→雙向電泳圖譜分析

→蛋白點切割→蛋白酶解和鑒定

該流程最關(guān)鍵的步驟是蛋白質(zhì)樣品的提取，它關(guān)系到下游蛋白質(zhì)的分離和鑒定是否能夠成功。好的蛋白質(zhì)樣品要求從某一個細胞、組織或器官中提取盡可能多的蛋白質(zhì)，以最大限度地反應(yīng)這個蛋白質(zhì)組的全貌。3.1.1利用雙向電泳研究植物蛋白質(zhì)組的基本流程453.1.2雙向電泳的缺陷和解決方法

解決方法：

1.對樣品進行前期分級

2.對不同的細胞器官或組織進行分離

3.使用寬膠條，符合重疊窄IPG凝膠

4.雙向熒光差異凝膠電泳

5.多塊膠垂直二維SDS系統(tǒng)

6.雙向電泳工作站缺陷分辨率低重復性差耗時、自動化程度低蛋白質(zhì)定量困難3.1.2雙向電泳的缺陷和解決方法缺陷分辨率低重復46

通過使用不同強度的離液劑和表面去垢劑，并進行分步溶解分離，可以獲得更多的蛋白質(zhì)，同時降低蛋白質(zhì)樣品的復雜性，提高2-DE的分辨率。如：ReadyPrep順序抽提試劑盒。

ReadyPrep試劑盒所需樣品量較少，不需要額外的設(shè)備，是一種既節(jié)省時間又節(jié)省設(shè)備的好方法。

ReadyPrep

產(chǎn)品線包含一系列2-DE樣品制備試劑盒，不僅適用于通用樣品（總蛋白）處理，而且可以將復雜樣品按特定方法分級。處理通用樣品的試劑盒包括總蛋白抽提和蛋白凈化（clean-up）。樣品分級試劑盒可用來降低樣品復雜程度，同時有助于低豐度蛋白的富集和鑒定。這類試劑盒又分為兩種，一種是基于蛋白不同的亞細胞定位來分離，另一種是對細胞總蛋白進行分級。下面的流程圖將幫您確定哪種試劑盒對您更適合。

一.對樣品進行前期分級ReadyPrep產(chǎn)品線包含一47植物蛋白質(zhì)組學課件48

順序抽提試劑盒可將樣品分離成3個遞增溶解度組份。這3個分離份依次分離，使我們能觀察到其它方法觀察不到的蛋白。通過對每一分離份逐級使用更強的去垢劑，可提供遞增的溶解度.

試劑一試劑二試劑三順序抽提試劑盒可將樣品分離成3個遞增溶解度組份。這49

二、對不同的細胞或組織進行分離

通過亞細胞分類，比如單獨提取細胞壁、細胞核、細胞膜、線粒體和葉綠體等的蛋白質(zhì)組分。優(yōu)點：降低蛋白質(zhì)樣品的復雜性，提高分辨率，了解蛋白質(zhì)的定位。

三、使用寬膠條，符合重疊窄IPG凝膠

2-DE的分辨率通常認為與有效的分離面積成正比，使用寬分離距離的IPG膠和長距離的二維SDS可以提高2-DE的分辨率。選用不同pH范圍的膠條，通過重疊幾次窄范圍的IPG凝膠電泳結(jié)果，可以提高在某一區(qū)段尤其是蛋白質(zhì)集中區(qū)段內(nèi)的分辨率

二、對不同的細胞或組織進行分離通過亞細胞分類，50pH范圍3—104—75.0—6.0上樣量40ug80ug120ugpH范圍3—1051四.雙向熒光差異凝膠電泳原理：雙向熒光差異凝膠系統(tǒng)（DIGE）在傳統(tǒng)雙向電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合了多重熒光分析的方法，在同一塊膠上共同分離多個分別由不同熒光標記的樣品，分析它們之間的差異性。極大地提高了結(jié)果的準確性，可靠性和重復性。

五.多塊膠垂直二維SDS系統(tǒng)

優(yōu)點：提高二維電泳效率和實驗重復性

六.2-DE工作站優(yōu)點：提高以2-DE為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組研究的自動化程度和工作效率

四.雙向熒光差異凝膠電泳523.2氨基酸序列測定

氨基酸測序主要使用的是N端測序Edman化學降解法。降解反應(yīng)分三步進行：第一步：偶聯(lián)反應(yīng)，降解試劑（PITC）與多肽鏈的游離氨基作用，形成PCT-肽。第二步：環(huán)化斷裂反應(yīng)，PCT-肽在無水強酸介質(zhì)如三氟乙酸中，最靠近PTC基的肽鍵將發(fā)生斷裂，同時PTC-氨基酸殘基環(huán)化成ATZ衍生物。第三步：轉(zhuǎn)化反應(yīng)，首先水解生成PTC-氨基酸，然后環(huán)化成PTH-氨基酸，其在紫外區(qū)有很強的吸收峰。它可以被各種技術(shù)層析出來，然后鑒定。每輪Edman反應(yīng)，可以鑒定一個氨基酸，剩下的減少一個殘基的肽鏈便在它的N端暴露一個新的氨基，又可參與第二輪反應(yīng)。3.2氨基酸序列測定氨基酸測序主要使用的是N端測序53偶聯(lián)反應(yīng)環(huán)化斷裂反應(yīng)轉(zhuǎn)化反應(yīng)偶聯(lián)反應(yīng)環(huán)化斷裂反應(yīng)轉(zhuǎn)化反應(yīng)543.3質(zhì)譜質(zhì)譜儀離心源質(zhì)量分析器離子檢測器基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）電噴霧電離（ESI）飛行時間（TOF）四級桿（Q）離子阱（IT）常用的質(zhì)譜儀有：MALDI-TOF-MSESI-Q-MSESI-IT-MS傅里葉變換離子回旋共振么質(zhì)樸（FTMS）3.3質(zhì)譜離心源質(zhì)量分析器離子檢測器基質(zhì)輔助激光解吸電離（55進樣系統(tǒng)離子源質(zhì)量分析器檢測器

質(zhì)譜分析原理進樣系統(tǒng)離子源質(zhì)量分析器檢測器質(zhì)譜分析原理56TypicalresultfromMALDI-TOFTypicalresultfromMALDI-TOF57Peptidefingerprinting(PMF)withMALDI-TOF

trypticdigestionGelProteinDatabase?123compare:??isidenticalto??massspectrometrystoreddataortheoretical?peptidesPeptidefingerprinting(PMF)w58各種質(zhì)譜儀的適用范圍：MALDI-TOF-MS：分析鑒定一些相對比較簡單的多肽混合物和進行高通量蛋白質(zhì)組的研究。ESI-MS：分析復雜的蛋白質(zhì)樣品，鑒定組成蛋白質(zhì)的氨基酸序列和蛋白質(zhì)的翻譯后修飾。FTMS：鑒定氨基酸的序列和分析蛋白質(zhì)修飾。Bottom-up蛋白質(zhì)組學：需要將蛋白質(zhì)樣品進行蛋白酶水解。如：MALDI-TOF-MSESI-Q-MSESI-IF-MSTop-down蛋白質(zhì)組學：可以直接分析完整的蛋白質(zhì)樣品，不需要經(jīng)過2-DE的前處理。如：FTMS各種質(zhì)譜儀的適用范圍：Bottom-up蛋白質(zhì)組學：需要將蛋593.4生物信息學3.4.1蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)組包括大量的信息：蛋白質(zhì)的序列信息、加工和修飾信息、表達結(jié)構(gòu)功能信息、與其他蛋白質(zhì)形成復合物的信息。

蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫擬南芥數(shù)據(jù)庫擬南芥蛋白數(shù)據(jù)庫PAT苜蓿數(shù)據(jù)庫DOME3.4.2蛋白質(zhì)鑒定分析軟件

例如：2-DE成像分析軟件：Melanie,QUEST

蛋白質(zhì)鑒定軟件：MASCOT,PROWL3.4生物信息學3.4.1蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)604.植物蛋白質(zhì)組的研究進展4.1發(fā)育蛋白質(zhì)組學的研究

發(fā)育蛋白質(zhì)組：指植物在某一特定的生長發(fā)育時期，在特定的生長條件下，特定的細胞、組織或器官中所表達的所有蛋白質(zhì)。

發(fā)育蛋白質(zhì)組學：它揭示了在每一個特定時期所表達的蛋白質(zhì)和這些蛋白質(zhì)在特殊的生長時期可能發(fā)揮的作用，是進一步了解和深入研究蛋白質(zhì)功能的基礎(chǔ)。雙子葉植物：開展了根、莖、葉、花、種子和果實的蛋白質(zhì)組學組研究課題。單子葉植物：增加了葉鞘、花藥、胚、胚乳等蛋白質(zhì)組的研究課題細胞器：細胞壁、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞膜、葉綠體、線粒體等4.植物蛋白質(zhì)組的研究進展4.1發(fā)育蛋白質(zhì)組學的研究雙子614.2植物環(huán)境蛋白質(zhì)組學的研究

4.3磷酸化蛋白質(zhì)組學的研究

環(huán)境因素非生物因素：厭氧、冷、熱、干旱、鹽、重金屬等生物逆境：植物真菌、病毒植物激素：生長素、赤霉素、脫落酸、乙烯等

研究與環(huán)境因素相關(guān)的蛋白質(zhì)，觀察它們在逆境環(huán)境條件下表達量的變化，并研究它們是如何抵抗外界不利的生長環(huán)境，維持細胞的生命活動環(huán)境蛋白質(zhì)組學：4.2植物環(huán)境蛋白質(zhì)組學的研究環(huán)境因素非生物因素：厭氧、62

蛋白磷酸化是植物細胞將外界信號傳遞到細胞內(nèi)的一個重要手段，磷酸化可以改變蛋白質(zhì)的生物活性、亞細胞定位，影響蛋白質(zhì)之間的相互作用，更重要的是這種變化是雙向的，及蛋白質(zhì)的活性、細胞定位等可以通過磷酸化和去磷酸化來調(diào)節(jié)。

研究現(xiàn)狀：植物磷酸化蛋白質(zhì)組的研究還是以單個蛋白質(zhì)為主，采用的技術(shù)手段有Westernblot,2-DE,用MS/MS分析磷酸化酯酶處理后的蛋白質(zhì)樣品等。近年來隨著各種新技術(shù)的發(fā)展，植物磷酸化蛋白質(zhì)組的研究也有了很大的進展。比如用2-DE和MS/MS聯(lián)用，堅定了馬鈴薯線粒體內(nèi)14個磷酸化蛋白，擬南芥的質(zhì)膜磷酸化蛋白質(zhì)組研究共鑒定了300多個磷酸化位點。