9/9植物細胞工程HUAZHONGAGRICULTURAL

UNIVERSITY

煙草葉片愈傷組織誘導與植株再生的研究ResearchonCallusInductionandPlant

RegenerationofTobaccoLeaves

姓名:黃金波

CANDIDATE：Huang-JinBo

學號:2012304200510

STUDENTID：2012304200510

課程:植物細胞工程實驗CURRICULUM：PlantCellEngineeringExperiment

班級:MAJOR:生技1201班Biotechnology1201

指導老師：SUPERVISOR：柳俊齊迎春陳浩

Liu-JunQi-YingChunChen-Hao

中國武漢

WUHAN，

CHINA

二○一四年十二月DEC,2014

煙草葉片愈傷組織誘導與植株再生的研究

黃金波

華中農業大學生命科學技術學院生技1201班

[

darkcondition;Buddifferentiationstatushavecertaindifferenceindarkandlightconditions,differentiationofplantseedlingsininducedtherewasnosignificantdifferencebetweenlightanddarkconditions.[Conclusion]theilluminationconditionandundertheconditionofdarkinductioncanaffectthebuddifferentiationofcallusbudnumberandstatus.

[KeyWords]TobaccoLeaves；Callus；CellEngineeringDifferentiation；Induce；

PlantRegeneration

1.前言

細胞工程是指應用細胞生物學、分子生物學、遺傳學、發育生物學等學科的原理和方法，通過某種工程學的手段，在細胞水平或細胞器水平上，按照人們的意愿對細胞進行改造，從而得到目的產物的一門綜合科學技術（柳俊等，2011）。近年來，由于包括遺傳學、分子生物學、生理學、工程學、生物物理學等學科的快速發展和融合，細胞工程再綜合了各大學科的優勢以及利用自身的特點后，也得到了極大的發展。

細胞工程技術根據對象分類，可以將其分為植物細胞工程、動物細胞工程和微生物細胞工程。它們之間的原理和方法都是相通的，但是又有微小的區別。植物細胞工程技術的發展源頭可以追溯到上世紀初，發展到現在，其實它的應用已經非常的廣泛。目前來說，它已被廣泛用于醫學、能源、制藥、農業育種、食品等方面的科學研究和生產應用。下面就主要對動物細胞工程和植物細胞工程技術在生產生活中的一些應用做一些簡單的介紹。

1.1動物細胞工程技術及其應用

動物細胞工程主要是應用細胞生物學和工程學的研究手段和原理，通過細胞培養、細胞融合、細胞核移植、胚胎移植、基因轉移等技術而發展起來的一門生物技術（葉敏，1984）。目前在細胞工程制藥、細胞治療、干細胞培養、細胞核移植等方面有著非常廣泛的應用（李剛等，2002；唐紅等，2011；馬瑞麗，2007；）。下面就以下幾個方面對動物細胞工程技術的一些應用做一些簡單的介紹。1.1.1生產單克隆抗體和細胞因子

自1975年英國劍橋大學的科學家利用

動物細胞融合技術首次獲得單克隆抗體以來，現在針對各種抗原的單克隆抗體已被廣泛應用于生命科學的各個領域，而細胞工程技術的發展對于單克隆抗體的生產無疑是

提供了強大的技術支持。用單克隆抗體可以檢測出多種病毒中非常細微的株間差異，尤其在鑒別菌種型及亞型、病毒的變異株以及寄生蟲不同生活周期的抗原性等方面更具

獨特優勢。這些都是傳統血清法或動物免疫法所做不到的，而且利用細胞工程技術生產的單克隆抗體具有靈敏度高、特異性強的特點，所以診斷非常準確，誤診率與傳統血

清學手段相比大大降低（唐紅，2011）。

不僅如此，近年來的發展也將細胞工程帶入了腫瘤診斷的領域，利用生產的特異性單克隆抗體為腫瘤的檢測和治療提供了新

的思路和方法。比如就有這樣的報道，有科學家利用單克隆抗體耦聯放射性核素，在腫瘤局部產生足夠的電離輻射生物學效應，這在治療卵巢癌的實驗與臨床研究已取得較

大進展，給卵巢癌特別是術后復發及化療耐藥患者的治療帶來新的希望（吳嘉涵，2009）。

1.1.2細胞融合技術

細胞融合指在誘導劑或促融劑作用下，兩個或兩個以上的異源細胞或原生質體相

互接觸，進而發融合并形成雜種細胞的現象。細胞融合技術作為細胞工程的核心基礎技

術之一，不僅在農業、工業的應用領域不斷擴大，而且在醫藥領域也取得了開創性的研究成果。這其中其實也主要包括有單克隆技

術（馬瑞麗，2007）。但是，不僅是單克隆技術，細胞核移植技術也得到了很好的發展。自從1997年克隆羊多利誕生以來，相繼在很多國家都報道出來已經克隆出各種動物，比如說我國的克隆牛、克隆豬、克隆鼠等。

克隆動物的技術最大的發展前景莫過

于將它與轉基因生物反應器結合起來，發展為類似于動物工廠的優勢雜種細胞用于生

產各種藥物。這其中比較成熟的比如有利用轉基因動物乳腺作為生物反應器,生產基因

工程人類蛋白質藥物，它可以使成本較微生物發酵、動物細胞培養生產基因工程藥物大大降低（李剛等，2002）。

1.2植物細胞工程技術及其應用

植物細胞工程是以細胞的全能性和體

細胞分裂的均等性作為理論依據，在細胞水平上對植物進行操作的育種新技術。植物細胞工程包括染色體工程技術、原生質體培養、花藥培養、細胞培養與無性系篩選、組織培養與體系胞雜交、器官與胚胎培養、植物脫毒快速繁殖與人工種子生產技術等（李培夫等，2006）。

植物細胞工程技術目前應用十分廣泛，其中在作物育種方面的應用報道的最多。下面做些簡單的介紹。

1.2.1在植物作物育種中的應用

我們知道，傳統的雜交育種在自交5代

以后可以產生一些同質配子結合的純合植株，需要經6-8代才可選育出新品系。對于

一年一季的植物，這之間需要花費最少5-8

年的時間，甚至更久。而單倍體育種是通過單倍體培養迅速獲得純合二倍體，從而大大縮短了育種年限，有些單倍體育種只需要兩年左右的時間就可以得到純種，為育種提供了極大的方便，而且選出的品種純種率高（柳成蔭，2011；李培夫等，2006）。

目前我國在植物育種中的應用在很多

方面都有建樹。比如說在水稻育種、菊花育種、茶樹育種、棗樹育種等等都有比較深入的研究（王婷婷，2009；白瑞霞,2007;鄺琦,2010;邱濤濤,2010）。

1.2.2在農業生產中的應用

在農業生產方面，目前，根據人們的需要已經相繼完善和發展了一些具有特色的

植物細胞工程實用技術，包括植物細胞組織培養技術、無性快繁技術及單倍體育種技術等，這些技術在脫毒苗生產、經濟植物快繁、植物新品種選育及有用次生代謝產物生產

方面發揮了重要作用。

植物細胞工程在脫毒苗生產方面的應

用主要是想提高農產品的產量和質量。目前主要采用的方法和手段是莖尖剝離的方法。這在我國都已經得到了很大的推廣。我國相繼在黑龍江、內蒙古、湖南、湖北、河南和甘肅等地建立了生產脫毒種薯的原種場，目前，草莓、蘋果、柑橘和葡萄等經濟植物都已建立了脫毒苗生產技術（柳成蔭，2011）。在其他方面，植物細胞工程在經濟植物快繁方面的應用的技術也十分成熟。例如利用植物快繁技術可以使生根困難的名貴花卉大

量繁殖，還可應用于雜合植物材料的快速繁殖，因為很多優良的觀賞植物和經濟植物都是雜種，一旦有性繁殖，其后代性狀會發生分離。而通過無性繁殖則能夠保持其雜合性，并可以大量生產性狀均一的商品苗。目前已在木薯、馬鈴薯、咖啡、橡膠、菠蘿、甘蔗和蘋果等經濟植物上建立了植物快繁技術（楊賀，2010）。

1.2.3培養生產次生代謝物

植物細胞培養作為一種有效生產有重

要價值次生代謝物的技術.與其他方法相比,應用植物細胞培養技術生產次生代謝

產物具有以下優點:

(1)有利于研究植物的代謝途徑,還

可以利用某些基因工程手段探索與創造新

的合成路線,得到價值更高的產品；

(2)所獲得產物可從培養體系內直接

提取,快速、高效的回收與利用,簡化了分

離與純化步驟；

(3)節省大量用于種植原料的土地,

以便土地資源得到高效利用；

(4)能夠減少各種環境因素對產物的

影響,確保在一個限定的生產系統中連續、均勻生產；

(5)有利于細胞篩選、生物轉化，合成新的有效成分；

(6)可以在生物反應器中進行大規模培養,并通過控制環境條件提高代謝物產量。

目前植物細胞工程技術應用于生產次

生代謝的產物有植物生長過程中產生的一

些酚類、萜類、含氮化合物（羅凱，2007；谷榮輝等，2013）。這其中很多對于我們有著非常重要的商業價值和藥用價值。例如，一些重要的植物代謝產物具有抗癌防癌的

藥用功效；我國通過細胞培養已經用于商業化生產的次生代謝物主要有小檗堿、紫杉醇等,具有很好的抗癌、抑菌消炎活性(張玲華，2006)。除了藥用外,許多次生代謝產物還是食品、化工和農業化學的重要原料,如用作殺蟲劑、染料、調味品和香料等。

總之,次生代謝物不僅是植物生命活

動不可或缺的物質,而且對人類社會的生

存發展也起著重要的作用。

1.3本次實驗的目的及意義

1.3.1實驗目的

通過實驗課程，掌握細胞工程的核心技術無菌操作技術和植物個體再生技術；通過實驗課程和理論課程的學習，了解特殊器官離體發生調控技術；最后，通過整個過程，能夠初步掌握本領域的實驗設計、結果分析及其報告/論文的撰寫。

1.3.2實驗意義

隨著各個學科之間的深入融合和快速發展，細胞工程技術也得到了極大的發展，盡管動物細胞工程與植物細胞工程在技術和原理上都存在一定的差異，但其核心技術和原理是相通的，都是利用無菌操作技術和細胞的全能性等。所以通過植物細胞工程實驗課程，可以讓我們對于細胞工程技術有較為深入的了解和掌握，可以使我們學習到相關關鍵的操作技術。同時，在整個細胞工程實驗過程中，我們還學習到了一些其他的技術，比如制作試管花卉、人工種子等，轉基因水稻gus報告基因的瞬時表達和檢測等等這些實驗，使我們對其中一些的實驗非常感興趣。總之，本次實驗既讓我們學習到了相關的技術和原理，還激起了我們對其中的一些實驗極大興趣。

2.實驗材料與方法

2.1實驗材料

2.1.1材料：無菌煙草苗

2.1.2培養基

誘導培養基：MS培養基+0.25mg/LNAA+0.25mg/LBA+8g/L瓊脂

分化培養基：MS培養基+0.25mg/LNAA+1.0mg/LBA+8g/L瓊脂

2.1.3其他器材與試劑

器材：天平、電磁爐、燒杯、移液管、三角瓶、滅菌鍋、超凈工作臺、恒溫（25℃）培養室等

試劑：蔗糖、瓊脂、MS培養基母液等

2.2實驗方法

2.2.1無菌苗的培養（老師準備）

2.2.2培養基的配置

按配方加入各培養基成份。

i.取一大的容量瓶，配制1000ml培養基母液備用。1000ml容量瓶中順序加入已配好的培養基母液（齊迎春等，2014）：大量元素25ml，微量元素5ml，鐵鹽5ml，維生素5ml，肌醇5ml，甘氨酸5ml；其中，誘導培

養基中再加入0.25mg/LNAA、0.25mg/LBA；分化培養基中加入0.25mg/LNAA、1.0mg/LBA。

ii．加好后，加水至總體積的3/4左右，加入20g蔗糖攪拌使溶化，用0.5N的NaOH和0.5N的HCl調整pH至5.8-6.0。

iii.加入8g瓊脂，置于電磁路爐上加熱，攪拌使瓊脂完全溶化，再用蒸餾水定容至終體積1000ml；繼續加熱幾分鐘使充分混均，分裝于三角瓶中，每瓶20ml左右；用記號筆表明培養基類型。

iv.滅菌（老師準備）。將分裝好的培養基置于高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，滅菌條件：溫度121℃，壓力1.1kg/cm2，時間20min。滅菌后的培養基置于無菌室保存備用。

2.2.3愈傷組織的誘導培養

將煙草葉片用剪刀剪成1cm2大小的小立方塊，接種于已滅菌含誘導培養基的三角瓶中。每個三角瓶接種4-6片，注意不要太多；另外，在選取葉片時盡量不要選取葉片的頂芽和芽尖，因為頂芽和芽尖的生長素濃度較高，不利于葉片的誘導；并且，將小葉片的四邊都剪一下，以使葉片充分接觸培養基。全程都在超凈工作臺中進行，嚴格控制無菌操作。

每人接種六個三角瓶，三個放于光照條件（實際為每天十二小時光照）下培養，另外三個置于黑暗條件（全天黑暗）下培養。培養三周。

2.2.4器官的分化培養

在誘導培養基中培養三周后，取出，將污染的材料廢棄，將沒有污染的材料接種到含分化培養基的三角瓶中，原則上是將原來一個三角瓶中材料轉移到對應的一個含分化培養基的三角瓶中。因為光照條件下和黑暗條件下各有兩瓶被污染了，而剩下的材料每個三角瓶又長得太多，所以將剩下的光照條件下的材料轉移到了兩個分化三角瓶中，將黑暗條件下的材料轉移到了三個分化三角瓶中。做好光照誘導和黑暗誘導的標記，置于光照下培養兩個月左右，觀察結果。

3.實驗結果與分析

3.1實驗結果統計

3.1.1煙草葉片誘導結果統計

煙草葉片誘導成愈傷組織統計表

Statisticforcallusinductionoftobaccoleaves

編號Number

接種數

Inoculation

number

愈傷組織形成數

Callusnumber

誘導率

Induction

rate

是否污染

Pollution

愈傷組織生長狀態

Growthstateofcallus

L16583.33%是被污染，沒形成愈傷組織

L255100.00%是被污染，但均形成愈傷組織，2個

長根

L366100.00%否均長根，形成愈傷組織

D15240.00%是被污染，有一個愈傷組織，且長根D2500.00%是被污染，無愈傷組織形成

D355100.00%否2個長根，4個形成愈傷，1個沒

長

3.1.2煙草葉片分化結果統計

煙草葉片愈傷組織植株再生情況統計表

Statisticforcallusdifferentiationandregenerationoftobaccoleaves

編號Number愈傷組

織來源

Source

of

callus

分化率

Differentiation

rate

愈傷分

化芽數

Number

of

sprout

分化芽狀態

Stateofsprout

愈傷植

株數

Number

of

callus

plant

株苗狀

態

State

of

plant

污染率

Pollution

是否有

芽

Is

there

大小

Size

密集程度

Density

L1-1光照100%23有+++++++++1+0L1-2光照100%18有+++++++++3+0L1-3光照100%27有++++2+0L1-4光照100%34有+++++++++0o0L2-1光照100%78有++++++8+++0L2-2光照100%26有+++++3++++0D1-1黑暗100%13有++2++++0D1-2黑暗100%12有+++++3++++0D1-3黑暗100%16有+++++3++0D2-1黑暗100%12有+++++3++++0D2-2黑暗100%25有++++++2++0D2-3黑暗100%11有+++++1+++++0D3-1黑暗100%7有+++++1++0D3-2黑暗100%16有+++++7++++0D3-3黑暗100%9有++++2++0D3-4黑暗100%12有++++++++0o0說明：i.L表示光照條件下誘導，D表示在黑暗條件下誘導。

ii.對于分化芽狀態，在大小一欄，“+”、“++”、“+++”、“++++”、“+++++”分別表示小、較小、適中、較大、

大；在是否密集一欄，“+”、“++”、“+++”、“++++”、“+++++”分別表示稀疏、較稀疏、適中、較密集、密

集。對于株苗狀態，“+”、“++”、“+++”、“++++”、“+++++”分別表示短小、較短小、適中、較大、大；o

表示無。

Note：i.Lmeansinducedundertheconditionoflight；Dmeansinducedundertheconditionofdark；

ii.Forthestateofsprout，inthesizecolumn，“+”、“++”、“+++”、“++++”、“+++++”standforsmall、lesssmall、

moderate、lesslarge、large，respectively；inthedensitycolumn，“+”、“++”、“+++”、“++++”、“+++++”stand

forsparsity、lesssparsity、moderate、lessdenseness、densenessrespectively。TotheStateofplant，“+”、“++”、

“+++”、“++++”、“+++++”standforsmall、lesssmall、moderate、lesslarge、large；omeansnoplant。

3.2結果分析

對煙草葉片愈傷組織分化再生進行統計分析，以對比光照和黑暗條件下誘導對于植株再生的影響，整理出以下結果。

3.2.1對分化率的影響

由統計分析可知，不管是在光照條件還是在黑暗條件下誘導，最終分化率都達到了100%，所以光照條件和黑暗條件對于愈傷組織分化率沒有影響。

3.2.2對愈傷組織分化芽數的影響

由統計數據可知，在光照條件下誘導總計分化芽數為206顆，在黑暗條件下誘導分化芽數為133顆，平均每個愈傷組織分別誘導出的芽數為34.33顆和13.30顆，經方差分析可得：

光照和黑暗對愈傷組織分化芽數的影響方差分析

差異源SSdfMSFP-valueFcrit行1140.7511140.757.6380.039666.607891列1817.4175363.48332.4340.1756445.050329誤差746.755149.35

總計3704.91711

根據方差分析可以得到P值小于0.05，所以在光照條件和在黑暗條件下誘導對愈傷組織分化芽數的影響達到了顯著差異，在光照條件下誘導比在黑暗條件下誘導更有利于愈傷組織長芽。

3.2.3對分化芽狀態的影響

對于分化芽狀態，不管是在光照條件下還是在黑暗條件下誘導都不影響分化出芽，均能達到100%；對于分化芽的大小，同樣可以做方差分析，可以得到光照和黑暗條件下誘導對分化芽的大小沒有明顯區別；對分化芽的密集程度進行分析，結果顯示在黑暗條件下分化芽趨向密集生長，在光照條件下誘導相對長得更稀疏。

3.2.4對形成植株的影響

由統計表進行方差分析可以得到光照條件下誘導和黑暗條件下誘導對形成植株數以及對于株苗形成的狀態均沒有顯著的影響。

3.3實驗結果分析與討論

在誘導培養實驗中，結果有66.7%的材料被污染了，分析其原因有一下幾點：①操作不規范，在操作過程中沒有嚴格地按照無菌