DNA變性梯度凝膠電泳實驗步驟及具體方法變性梯度凝膠電泳（DGGE）是一種根據DNA片段的熔解性質而使之分離的凝膠系統。核酸的雙螺旋結構在一定條件下可以解鏈，稱之為變性。核酸50%發生變性時的溫度稱為熔解溫度（Tm）oTm值主要取決于DNA分子中GC含量的多少。DGGE將凝膠設置在雙重變性條件下：溫度50-60°C,變性劑0-100%。當一雙鏈DNA片段通過一變性劑濃度呈梯度增加的凝膠時，此片段遷移至某一點變性劑濃度恰好相當于此段DNA的低熔點區的Tm值，此區便開始熔解，而高熔點區仍為雙鏈。這種局部解鏈的DNA分子遷移率發生改變，達到分離的效果。Tm的改變依賴于DNA序列，即使一個堿基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此,DGGE可以檢測DNA分子中的任何一種單堿基的替代、移碼突變以及少于10個堿基的缺失突變。為了提高DGGE的突變檢出率，可以人為地加入一個高熔點區GC蕪GC夾（GCclamp）就是在一側引物的5'端加上一個30-40bp的GC結構，這樣在PCR產物的一側可產生一個高熔點區，使相應的感興趣的序列處于低熔點區而便于分析。因此，DGGE的突變檢出率可提高到接近于100%o作為一種突變檢測技術，DGGE具有如下的優點：（1）突變檢出率高。DGGE的突變檢出率為99%以上。（2）檢測片段長度可達lkb，尤其適用于100-500bp的片段。（3）非同位素性。DGGE不需同位素摻入，可避免同位素污染及對人體造成的傷害。（4）操作簡便、快速。DGGE-般在24小時內即可獲得結果。（5）重復性好。但是，該方法需要特殊的儀器，而且合成帶GC夾的引物也比較昂貴。PCR反應其中，上游引物加40bp[GC]Clamp.PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳確認。垂直變性梯度凝膠電泳變性梯度遞增的方向與電泳方向垂直。所使用的膠為6%聚丙烯酰胺凝膠，變性濃度為0-100%。其中，含7M尿素和40%去離子甲酰胺的膠為100%變性，不含尿素和去離子甲酰胺的膠為0%變性。垂直變性梯度凝膠電泳主要是檢測引物的最適解鏈條件（即變性濃度）。PCR產物加上樣緩沖液后上樣,300-400pl/孔，電壓150V，溫度60°C，時間2-4小時。平行變性梯度凝膠電泳變性梯度遞增的方向與電泳方向平行。根據垂直變性梯度凝膠電泳檢測的解鏈區域的變性濃度，制備相應變性濃度的平行變性梯度凝膠，檢測各標本是否存在突變。PCR產物加上樣緩沖液后,25pl-30pl/孔，電壓150V，溫度60°C，時間3-6小時。染色5分鐘,凝膠成像儀分析結果。注意事項在混合和灌膠時應避免產生氣泡。有溶液應保存于4°C棕色瓶中，一般幾個月到一年內有效。電泳時凝膠溫度必須保持f亙定，要達到這一要求，可把膠板浸沒于充分攪拌的溫控緩沖液槽內。對于缺乏變性劑時鼎交容易變性的DNA來說，槽內的遍度選擇在6CTC稍微超過熔點，并且大部分的工作都在6CTC下進行（但溫度稍高或低一點都可采用）。溫度保捺亙定可將電泳緩沖液加熱到60°C,并把膠浸入其中進行電泳即可。該實驗中提取DNA,以及DGGE操作中接觸到得很多藥品都有毒，還有致癌、變性等毒害，一定要嚴格操作，做好防護保護自己。一、實驗過程中的操作細節：1點樣的時候最好用微量進樣器，避免污染和樣品漂浮。為避免邊緣效應，兩邊可以一定點一些樣品。制膠是關鍵。玻璃板一定要洗干凈，在灌膠時，要勻速的轉動滑輪，將凝膠液勻速的灌入玻璃板中，液面要保持水平。二、實驗結果的評估DGGE 圖譜很模糊，只有很少的幾個條帶，可能是因為變性膠濃度不合適而導致