1、10/6/2022中藥鑒定學專論丹參分子生藥研究10/6/2022一、丹參的傳統鑒別方法與分子生藥鑒別二、丹參分子基因組的分析及構建三、不同產地丹參分子生藥基因組的分析四、高質量的丹參葉片DNA的提取方法研究10/6/2022第一部分：丹參的傳統鑒別方法與分子生藥鑒別。10/6/20221丹參形態學鑒別植物學特性鑒別傳統方法大多根據丹參的形態方面對藥材的真偽進行鑒別。丹參為多年生草本,根磚紅色,莖高4080 cm,多分枝,被長柔毛。葉常為奇數羽狀復葉。葉柄長17 cm,小葉37,頂端小葉較大。小葉卵形或橢圓狀卵形。長1. 58 cm,寬0. 85cm,先端鈍,邊緣具圓鋸齒,兩面被柔毛,下面較密

2、,花序頂生或腋生輪傘花序有花6至多花,組成假總狀花序,密被腺毛及長柔毛;小苞片披針形;花萼鐘狀,長11. 3 cm,先端二唇形,萼筒喉部密被白色柔毛;花冠藍紫色,二唇形,長22. 7 cm,花冠筒外伸,彎曲,上長達2 cm,筒內有毛環;雄蕊2,藥隔長,花絲短,上臂藥室發育, 2下臂的藥室不育且聯合;小堅果4,橢圓形,花期58月,果期89月。10/6/2022 丹參形態10/6/2022丹參藥材根部形態10/6/2022水試鑒別法：用水浸泡丹參根的方法對丹參進行鑒別,正品丹參根浸泡后的溶液無色,藥材稍膨脹,顏色稍微變淺。偽品丹參溶液顯紅色藥材變為淡紅色。水浸后續斷會被染成紅色,粉末中有草酸鈣簇晶

3、;丹參水浸不染成紅色,粉末中無草酸鈣簇晶,但有石細胞及紅棕色物為丹參。從而將兩者進行區分。10/6/2022根的橫切面顯微結構鑒別根據丹參橫切面顯微結構特征與紫丹參進行區分,丹參(Salvia miltiorrhizaBge. )木栓層37列,木栓細胞長方形,切向延長,壁非木化或微木化;外側有時可見落皮層。皮層窄,纖維單個散在或26個成群,孔溝放射狀,層紋細密。韌皮部較窄,由篩管群和薄壁細胞組成。形成層明顯成環。木質部寬廣, 412 mm呈放射狀排列。有些相鄰的束在內側合并,導管類圓形或多角形,有的沿徑向延長,直徑1565 mm,單個散在或212個成群,徑向排列或切向排列;木纖維發達,多成群分

4、布于大導管周圍;有的本質部束內有12群木化薄壁細胞;木射線寬廣,射線細胞多木質化增厚。紫丹參根莖表皮細胞1列,內含紫紅色物質;皮質薄壁細胞有的具紋孔;髓部薄壁細胞壁呈連珠狀增厚或稍增厚,具紋孔。根本質部束常較小,導管也少。10/6/2022根粉末的顯微結構鑒別丹參粉末呈紅棕色。木栓細胞黃棕色,表面觀呈類方形或多角形,壁稍厚,胞腔內常含紅棕色色素,色素溶解后,斷面觀細胞類長方形,排列較整齊。木纖維多成束,長梭形,紋孔斜裂縫狀或十字狀,孔溝稀。導管主要為網紋和具斜紋孔導管。石細胞呈類圓形、類三角形、類梭形、類長方形或不規則形,也有延長呈纖維狀,有的胞腔內含棕色。10/6/2022花粉形態學特征對丹

5、參及同屬藥用植物的鑒別一定的植物具有一定形態的花粉,因此花粉形態研究也是植物分類鑒別的依據之一。丹參的花粉以外壁較薄、紋飾網眼較淺、網脊較粗、溝較寬、溝底具顆粒而區別于其他種。10/6/2022薄層色譜鑒別采用薄層色譜定性鑒別的方法比較后指出在同一展開系統的條件下,無論是野生還是栽培品種,丹參的一些主要成分相同,以此可以作為識別丹參藥材真偽的參考依據。10/6/2022紫外吸收光譜鑒別丹參在253, 277 nm兩處有吸收特征峰,而甘西鼠尾在264,248, 218, 203 nm 4處有吸收特征峰。作丹參使用的藥材紫外吸收光譜的范圍不同,據此可以對兩者進行鑒別。丹參粉末處理后置紫外燈(365

6、nm)下現察顯亮藍灰色熒光。10/6/2022分子生物學鑒別方法1RAPD鑒別法：隨機擴增的多態性DNA(RAPD)技術已經被廣泛應用于物種鑒別。2DNA遺傳標記技術隨著分子生物學和基因工程技術的日趨成熟,從遺傳DNA分子水平檢測生物遺傳多樣性并進行分類與鑒定已成為可能。DNA分子遺傳標記技術具有快速、微量、特異性強的特點,且不受生長發育階段、供試部位、環境條件的影響,已在中藥鑒定學研究中展示了良好的應用前景,并保持強勁的發展勢。10/6/2022第二部分 丹參分子基因組的分析及構建10/6/20221丹參主要居群DNA指紋圖譜的建立2丹參EST序列中SSR信息的分析及建立10/6/2022丹

7、參主要居群DNA指紋圖譜的建立基因組DNA的提取編號 名稱 來源 花顏色Al 大葉丹參 四川中江 紫色A2 商洛丹參 陜西商洛 紫色A3 首縣紫花丹參 山東芭縣 紫色A4 四倍體丹參 中國藥科大學 紫色A5 芭縣白花丹參 山東芭縣 紫色A6 北京丹參 中國中醫藥研究院 紫色A7 毫州丹參 安徽亳州 紫色A8 丙城丹參 山西茵城 紫色A9 江蘇丹參 江蘇射陽 紫色A10 小葉丹參 四川中江 紫色A11 安國丹參 河北安國 紫色A12 甘西鼠尾草 甘肅 紫色A13 一串紅 陜西省雜交油菜研究中心 紅色A14 油菜 陜西省雜交油菜研究中心 黃色A15 小麥 陜西省雜交油菜研究中心 注:Al一Al，為

8、各居群編號，以下同。10/6/2022RAPD一PCR擴增反應體系及擴增程序的優化別設計M擴+、Taq酶、模板DNA的濃度及退火溫度等單因子試驗，同時保持擴增體系的其它成分濃度及擴增程序其它環節不變，以優化、確證適宜的M擴+、Taq酶、模板DNA的濃度及退火溫度。10/6/2022鑒別丹參與其近緣和遠緣植物的特征引物及其DNA指紋圖譜引物s2035、s222擴增結果不僅穩定、條帶明亮，而且采用引物s2035、s232建立的指紋圖譜丹參主產區的n個居群丹參的PCR擴增帶型幾乎相同(1一n泳道)，其中有200一1100bp的七條共同的特異條帶，即圖6的條帶Cl、CZ、C3、C4、圖7的CS、C6、

9、C7，各丹參居群完全相同。10/6/2022丹參EST序列中SSR信息的分析及建立丹參EST序列中SSR信息的分析 微衛星（Microsatellite）又稱簡單重復序列(Simplesequence repeat)，指的是基因組中由 16 個核苷酸組成的基本單位重復多次構成的一段 DNA，廣泛分布于基因組的不同位置，長度一般在 200bp 以下SsR 分子標記具有數量豐富，多性高，多等位基因，共顯性，重復性高等優點。根據建立 SSR 標記的序列性質不同可分為基因組 SSR （Genomic SSR,gSSR） 和表達序列標簽 SSR（Expressed sequence tag SSR，ES

10、T-SSR）。EST 及表達序列標簽是通過從 cDNA 文庫中隨機挑選的克隆進行大規模測序所獲得的 5或 3端序列，長度一般在 150500bp。10/6/2022丹參 EST-SSR 引物情況表 引物編號 重復基元 GeneBank EST 編號 預期產物bp 引物序列 退火溫度（）SSR001 (TACA)5 CV172410 241 GAGGCTACTTCGTGGAGG 52.3 GAAACTAAAGCAACAAACCC 52.1SSR002 (CA)16 CV172134 176 CCGTGGTGTTCCCTCTTT 55 TGCCGATTCTAACCTGTATG 53.7SSR003

11、 (CT)10 CV171877 137 AGAGGCTGCTGCTTCATT 52.7 TCAAGTCATAGGCGTGGC 54.5SSR004 (AAC)6 CV171649 222 AGGCAGACAGACCTCATA 46.7 CTTCCCACCAAATAACTC 46.8SSR005 (GTG)6 CV171565 153 CTCAGCACCTACTACCACAT 49.6 CTTATCCCAACACTTCTTCT 48.5SSR006 (ATC)5 CV171563 155 AAACAGAGCGACGAAGCAG 56.210/6/2022丹參的 EST-SSR 分布頻率與特點丹

12、參 EST-SSR 中共包含 77 種重復基元。單核苷酸重復有 1 種 A/T。二核苷酸重復也為 3 種，以 AG/CT為主，占 64.21%。三核苷酸重復為 10 種 丹參 EST-SSR 信息情況表 重復類型 基元種數 SSR 數 占全部SSR 比例 出現頻率單核苷酸重復 1 1069 53.08 10.45二核苷酸重復 3 380 18.87 3.72三核苷酸重復 10 450 22.34 4.40四核苷酸重復 6 15 0.74 0.15五核苷酸重復 9 13 0.65 0.13六核苷酸重復 48 87 4.32 0.85總計 77 2014 100.00 19.6910/6/2022

13、 丹參二、三核苷酸重復基元情況表重復類型 基元 數量 占該類型比例 出現頻率單核苷酸重復 A/T 1069 100.00 10.45二核苷酸重復 AC/GT 60 15.79 0.59 AG/CT 244 64.21 2.39 AT/AT 76 20.00 0.74三核苷酸重復 AAC/GTT 8 1.78 0.08 AAG/CTT 79 17.56 0.77 AAT/ATT 9 2.00 0.02 ACC/GGT 14 3.11 0.03 ACG/CTG 123 27.33 1.20 ACT/ATG 41 9.11 0.40 AGC/CGT 36 8.00 0.35 AGG/CCT 25 5

14、.56 0.24 AGT/ATC 95 21.11 0.93 CCG/CGG 20 4.44 0.2010/6/2022 第三部分 不同產地丹參分子生藥基因組的分析10/6/2022不同產地丹參遺傳關系的DNA標記分析利用RAPD與ISSR標記對不同產地的野生與栽培丹參的遺傳變異進行分析,以期為丹參藥材的引種栽培與科學選育提供科學依據。不同產地丹參野生與栽培藥材RAPD與ISSR標記的遺傳變異 藥材 取樣個體 多態條帶數 多態條帶比率 基因多樣性 原產地 P (% ) 指數(Ht) 栽培藥材S-AHBZ 8 22 21. 57 0. 075 安徽亳州 S-SXYC 8 21 20. 59 0.

15、 0708 山西運城 S-JSBH 5 9 8. 82 0. 0361 江蘇濱海 S-SCZJ 5 13 12. 75 0. 0518 四川中江 S-JSSY 8 4 3. 92 0. 0129 江蘇射陽 S-JSRG 6 15 14. 71 0. 0474 江蘇如杲 物種水平 40 87 85. 29 0. 1934 野生藥材 S-SDYS 3 7 6. 86 0. 0314 山東沂水 S-SD 3 11 3. 57 0. 0078 山東 S-SDPY 2 12 11. 76 0. 0439 山東平邑 S-SX 2 17 16. 67 0. 0675 陜西 物種水平 10 62 60. 78

16、 0. 1738 總計 50 97 95. 10 0. 238910/6/2022結論：不同產地丹參的遺傳分化根據POPGENE計算不同產地丹參間Nei無偏遺傳距離與遺傳一致性見表3。10個產地的丹參間,產自山西運城的丹參(S-SXYC)與來自江蘇濱海的丹參(S-JSBH)的遺傳距離最小,為0. 099 6;而來自山西運城的丹參(S-SXYC)與來自山東的丹參(S-SD)的遺傳距離最大,為0. 377 7;遺傳一致性正好與遺傳距離相反,遺傳距離最小的兩個產地的丹參,遺傳一致性表現的最大, S-SXYC與S-JSBH之間的遺傳一致性最大,為0. 905 2,表明它們之間的親緣關系最近。江蘇3個產

17、地居群的遺傳一致性介于0. 826 7與0. 838 9之間,平均0. 833 9;山東3個產地的丹參遺傳一致性介于0. 689 8與0. 808 8之間,平均0. 759 7,表明不同產地的丹參間存在明顯的遺傳分化。10/6/2022 第四部分 高質量的丹參葉片DNA的提取方法研究10/6/2022材料和方法樣品的采集及預處2004年7月9月份在泰山采集白花丹參的成熟葉片,涼干保存1個月。試劑和儀器1試劑CTAB(上海生工),Vc(北京鼎國),SDS (上海生工), PVP (上海生工),-mercap-toethanol(上海生工),Taq酶(Takara),AFLP corereagen

18、t kit(invitrogen,Cat No 1084-016)。2儀器PTC-100基因擴增儀(MJ公司),Al-legra TM 64R centrifuge(BECKMAN)離心機,DNA離心真空干燥器(Savant),EC-600-90 (E-C appara-tus corporation)高壓電泳儀10/6/2022方法改良CTAB法:用常規CTAB法作為基本方法,添加一些抗氧化劑和提高CTAB的比例。處理A:提取液中加Vc干粉末30 mg (15mg/mg葉片)。處理B(PVP預洗法):加PVP粉末(干葉量的10%),與干葉共同在液氮下研碎。加入4預冷的CTAB-free bu

19、ffer(02 M Tris-cl pH80, 005 MEDTA,025 M NaCl,內含4%-mercaptoethanol),冰上放置10 min,7000 rpm(不能太高,否則膜破,DNA損失),4,離心10 min,棄上清。然后加Vc干粉末(1 mg/mg干葉片)于4CTAB提取液中,調pH值為6065DNA瓊脂糖電泳及濃度和純度的測定用08%瓊脂糖電泳和紫外分光光度計測定OD260/OD280的方法判定DNA的質量。AFLP進一步分析DNA質量取250 ngDNA用EcoRI/Mse I消化,限制酶切片段經T4DNA連接酶與接頭連接及PCR擴增,變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,銀染顯色,以構建出重復性好、多態性豐富的基因組DNA AFLP指紋圖譜來進一步評價DNA質量。具體方法參照試劑盒說明書進行。引物組合為(E-AAG: GAC TGC GTA CCAATT CAA G; M-CCC:GAT GAG TCC TGA GTAACC C)。10/6/2022結果泰山白花丹參干葉片DNA質量分別采用常規CTAB法、高鹽低PH法和改良的CTAB法提取白花丹參成熟干葉片DNA,結果表明,常規CTAB法、高鹽低pH法,改良CTAB中的處理A得到的總DNA都呈淺黃色至淺棕色,其余處理顏色較好(表1);高鹽低pH法,改良C