1、熒光定量PCR技術原理及應用 REAL-TIME PCR郭 衛武漢大學醫學研究中心復習普通PCRRT-PCR熒光探針雜交技術PCR技術熒光定量PCR熒光What is Real-Time PCR? 熒光實時定量PCR技術的產生1992年由Higuchi等人第一次報告：使用EB加入PCR反應體系，經改裝的帶有冷CCD的PCR儀檢測樣品的熒光強度核酸 染料熒光后來用與雙鏈DNA有更強結合力的SYBR Green I 取代 EB.熒光探針雜交技術What is Real-Time PCR? cap PCR vessel thermal block sampleWhat is real-time PC

2、R? Links an optical system to a thermal cycler Signals captured at every reaction step Direct electronic results Quantitative or qualitative (i.e.+/) resultslens樣品處理瓊脂糖電泳PCR反應中 實時檢測EB染色自動 數據分析熒光染料常規PCR人工 數據分析熒光定量PCR與普通PCR的比較如 何 定 量 ?擴增曲線圖： 橫坐標：擴增循環數（Cycle）； 縱坐標：熒光強度 每個循環進行一次熒光信號的收集擴增曲線分成三個階段：背景信號階段，

3、熒光信號指數擴增階段和平臺期。為了達到定量的目的，熒光定量技術引入兩個非常重要的概念：熒光閾值（Threshold）和CT。定量PCR擴增曲線概念Baseline是背景曲線的一段，范圍從反應開始不久熒光值開始變得穩定，直到所有反應管的熒光都將要，但是還未，超出背景。Threshold熒光超過本底，達到可檢測水平時的臨界數值CTthreshold cycle，臨界循環數(熒光信號達到閾值所經過的循環數）。threshold 橫線與擴增曲線相交，所得交點所對應的循環數。 為什么CT 起始DNA濃度?線性關系模板DNA量越多，熒光達到閾值的循環數越少根據樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量CT

4、Log of DNA concentration熒 光 染 料Commonly Used Fluorescent ProbesDetection Chemistries2%3%9%9%15%19%78%0%10%20%30%40%50%60%70%80%TaqMan probesMolecular BeaconsFRET probesLUX fluorogenic primersMGB Eclipse probesOtherScorpion probes5353SGExcitationSGSGSGSGEmission內摻式染料 SYBR-Green I 5353SGSGSGSGSGExcita

5、tionEmission內摻式染料 SYBR-Green I 熔解曲線PCR過程中，可控制溫度緩慢升高 (ie. 60oc to 95oc, 0.2oc/sec)雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNASYBR Green I被釋放，熒光信號消失以熒光信號強度對溫度作圖，即為熔解曲線對熔解曲線求一階導數，峰值代表斜率改變最大值，即TmTm值：50%DNA變成單鏈時的溫度，此溫度與雙鏈DNA的長度、GC含量有關，可部分代表序列的特異性。溫度熒光強度TmTm值：DNA解鏈一半時的溫度融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準確融解曲線分析，出現雜峰其他產物出現非特異性熒光，因此定量不準確非特異性產物非特異性產物

6、SYBR Green 法 -PCR反應的建立SYBR Green 使用濃度:太高抑制Taq酶活性，太低，熒光信號太弱，不易檢測Primer：引物的特異性高，否則擴增有雜帶，定量不準MgCl2的濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產物反應Buffer 體系的優化反應溫度和時間參數:由酶和引物決定其他與常規PCR相同SYBR Green 法應用范圍 起始模板的測定 基因型的分析 融解曲線分析：可以優化PCR反應的條件，對常規PCR有指導意義，如對primer的評價；可以區分單一引物、引物二聚體、變異產物、多種產物。TaqMan探針TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴增有

7、關。探針5端連接熒光基團，3端連接淬滅基團。利用了PCR延伸反應時，聚合酶的5外切酶活性，使熒光基團和淬滅基團分離。水解型雜交探針TaqMan ProbeTaqMan Probe 原理TaqMan Probe 原理TaqMan Probe 原理RQ53535353ExcitationRQQRQRExcitation雙標記探針（Taqman Probe） 對目標序列的高特異性 -陰性結果確定 設計相對簡單 -與目標序列某一區域互補 重復性比較好優 點 只適合一個特定的目標 委托公司標記，價格較高 不易找到本底低的探針缺 點TaqMan 法 PCR反應的建立1、引物、探針的設計： 探針Tm為68-

8、70 ，30 bp, 5不能有G，G可能會淬滅熒光素， 引物盡量靠近探針，擴增片段400 bp，引物Tm為59-60 2、反應參數的確定： 一般為：94 ，10-20S 60， 30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高）也可通過溫度梯度優化退火溫度 72 ，45 S3、優化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號/背景比值 引物濃度：50-900nM 探針濃度：50-250nM4、其他與常規PCR相同TaqMan 法 應用范圍 起始模板的定量 基因型分析 目的基因定量 產物鑒定 SNP分析分子信標（Molecular Beacon）分子信標是一種在靶DNA不存在時，形成莖環結構的雙

9、標記寡核苷酸探針。發夾結構的兩端分別連接熒光基團和淬滅基團。利用分子構象的改變使得熒光基團和淬滅基團分開。發夾型雜交探針Molecular Beacon分子信標的莖環結構中，環一般15-30nt，與靶序列互補；莖一般5-7nt，相互配對。RQExcitationXRQQRExcitationEmission分子信標（Molecular Beacon Probe） 高特異性：對目標序列 檢測SNP最靈敏的試劑之一 熒光背景低優 點 只能用于一個特定目標 設計困難 價格比較高缺 點Oligo 1: FluoresceinOligo 2: LC Red 640ExcitationEmissionTr

10、ansfer熒光共振能量傳遞（FRET Probe）535353533RQ5RQRQ35QRRREmissionExcitationQR引物特異性探針（Amplifluor Probe）SETUP1 Template (DNA or cDNA)2 Commercial MasterMix3 Individual assay primer/probe mix follow design guidelines use a design service use a pre-existing design use ready-made assaysDESIGNRUNAny combination of

11、different assays run at the same time探針設計指南 絕對保守 長度2532bp，Tm應在68-70 之間 確保探針的Tm值要比引物的Tm值高出10度 探針的5端不能為G 避免多個重復堿基出現，尤其要避免4個以上的G 探針應靠近上游引物 擴增子的長度應不超過400bp，理想的最好能在100150bp內 引物長度1825bp，Tm值在58-60 ，GC含量30-80% 引物3端（最后5個堿基）不能有超過2個的G或C引物設計指南| | | | |template| | |polymerisationprimer35引物設計指南 上下游引物間Tm值差小于4 避免引物

12、錯誤引發（特別是3端與靶基因不配對） 避免引物內和引物間的互補（避免形成發夾結構和引物二聚體） 跨一個或多個內含子設計引物（避免對基因組DNA的擴增） 使用Blast檢查引物特異性（/blast) 熒光定量PCR的應用領域基礎研究中基因表達豐度的測定基因型分析（野生型、雜合型、突變型分析）基因表達調控分析臨床醫療領域病原體的檢測和基因診斷環境監測，包括水質、空氣的污染檢驗檢疫工作，食品衛生檢驗，轉基因作物的檢驗法醫的遺傳學鑒定新藥的開發和研究基因表達分析上的應用基因表達的絕對定量分析病原微生物或病毒含量的檢測，轉基因動植物基因拷貝數檢測基因表達的相對定量分析不同處理樣本間特定基因表達差異，特定

13、基因不同時相表達差異基因分型SNP分析，甲基化分析兩種定量目標病毒感染的定量監測 HIV感染后，潛伏期長短和臨床癥狀輕重與血液中的病毒量顯著相關。病毒載量是預測HIV異性戀間傳播風險的主要因素，在HIV RNA水平小于1500個拷貝/ml時的傳播很少發生。因此，采用熒光定量PCR的方法檢出HIV RNA對臨床有重要的意義。絕對定量分析實時定量PCR 檢測 HBV 絕對定量細胞因子的表達分析 細胞因子是調節蛋白，它通過調節免疫反應在免 疫系統中起著核心作用。為了闡明在許多炎癥反應，自身免疫性疾病和器官移植排異中的免疫致病途徑，細胞因子mRNA表達譜的可靠定量是很重要的。盡管被檢樣本中細胞因子含量

14、往往極低，然而real-time反轉靈PCR（RT-PCR）以其高敏感性和準確性在細胞因子的定量中越來越受到青睞。腫瘤耐藥基因表達的研究 real-time反轉錄PCR（RT-PCR）是了解腫瘤耐藥，指導臨床治療策略的有用手段，它能觀測用藥前后及復發時腫瘤細胞的耐藥基因mRNA表達變化，從而及時調整治療方案和評價疾病的預后。相對定量分析絕對定量的標準樣品 已知拷貝數的質粒DNA和體外轉入的RNA 相對定量中的內標 內標通常是18S、-actin、GAPDH基因等看家基因 在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數恒定，受環境 因素影響小 內標定量結果代表了樣本中所含細胞或基因組數量用于生成標準曲線的

15、樣品如何設定？含有和待測樣品相同擴增片段的克隆質粒含有和待測樣品相同擴增片段的cDNA紫外分光光度計或熒光酶標測定濃度根據質粒或cDNA分子量換算成拷貝數，做系列稀釋TaqMan SNP分析雙Taqman探針法檢測野生型和突變型 在基因型分析中，可采用兩種不同的Taqman探針（分別針對野生型和突變型)，即一個探針以一種熒光素（Flr）標記，而另一個探針則用不同的熒光物（Tet）標記。如果只有一種信號被擴增出來，則樣本為對應的基因型（野生型或突變型）的純合子；如二者都被有效地擴增出來，則樣本為雜合型。雜合體個體的DNA擴增產物則可同時與Tet和Flr標記的探針結合同型突變型個體的擴增DNA只與

16、Tet或Flr標記的探針結合DNA pol HSVHSV-1HSV-2mismatchHybridisation probes (to HSV-1)no mismatchAmpliconPrimers commonto HSV 1 & 2利用溶解曲線檢測基因型 FRET探針與模板結合時，因共振能量的傳遞而信號增強，而當在Tm 值時，FRET探針與PCR產物分開，熒光信號減弱。發生點突變的PCR產物有特定的Tm 值，通過測定Tm值，確定樣品的基因型。HSV 2 HSV 1Melting Curve AnalysisHSV 1HSV 255oCHSV 1HSV 273oCHSV 1HSV 267oC556773DNA甲基化檢測影響定量PCR結果的因素產物特異性 Real time PCR 使用 SYBR Dye 的話，對 PCR 產物的特