1、讓載體構(gòu)建更,分子克隆其實可以么快！每個做過分子實驗的人可能都會有這樣的經(jīng)歷：在經(jīng)過次的、酶切、連接、轉(zhuǎn)化之后，陽性率依舊很低，到底是哪一步出了問題？今天就給大家詳解一下可以一步法快速構(gòu)建同源重組載體，并且陽性率很高的方式：無縫克隆。無縫克隆技術(shù)是一種新的、快速、簡潔的克隆方法，可以在質(zhì)粒的任何位點進行一個或多個目標(biāo)的片斷的插入，而不需要任何限制性內(nèi)切酶和連接酶。突破傳統(tǒng)的雙酶切再加上連接，只需要一步重組法，即可得到高效率克隆的重組載體，大大提高了工作效率。我們先來將傳統(tǒng)克隆與無縫克隆做下比較：目的片院PCR十天半月實險沒進展目的片院PCR十天半月實險沒進展傳統(tǒng)克隆無縫克隆引物設(shè)計需引入載體上

2、的酶只需要一次反應(yīng)即可完成定向克切位點，產(chǎn)物再經(jīng)過酶切、膠隆，省略酶切、酶連等過程；回收、連接后定向克隆到目的載體對酶切位點無要求，可以把目的片上；段插入到任意載體的任意位點；需要查找合適的酶切位點，購買各連接片段之間不會引入任何其他序種內(nèi)切酶；列；陽性率低；可以同時克隆多個片段。多個片段，通常只能分多次拼接。無縫克隆相較于傳統(tǒng)克隆的方式，優(yōu)勢顯而易見，主要體現(xiàn)以下幾點：1、可以不需要任何限制性內(nèi)切酶、連接酶，也不需要磷酸化、末端補平等操作；2可同時連接多個片段，最多可達個；3、不附加任何多余序列，精確定向連接；4體系反應(yīng)時間僅需，快速反應(yīng)。那無縫克隆到底應(yīng)該怎么做呢？下面我們就來詳細(xì)了解下無

3、縫克隆其原理：在基因克隆的引物設(shè)計及目的片段的擴增階段，V常規(guī)法是相同的。唯一的差異在于載體末端和引物末端應(yīng)具有個同源堿基，由此得到的產(chǎn)物兩端便分別帶上了15-個2與0載體序列同源性的堿基。M3羅無降位點區(qū)1般目的片成取M3羅無降位點區(qū)1般目的片成取ICtdHB-infuEicnPCR片段：蹣慳化最粒（曲:g匕j=25:1圖1：無縫克隆原理圖在用無縫克隆方式進行分子克隆時，主要操作步驟分為以下3點：1線性化目的載體（圖左上）：用酶切或是方式1）質(zhì)粒酶切法在目標(biāo)載體質(zhì)粒上選取合適的位點進行單酶切或雙酶切，對酶切后的載體進行割膠純化。）質(zhì)粒法如果沒有合適的酶切位點，你也可以通過方法實現(xiàn)載體的線性化

4、。圖法線性化載體示意圖。在插入位點兩側(cè)設(shè)計一對方向相反的引物對載體進行擴增，通過跑膠回收獲取線性化載體片段獲取目的片段。設(shè)計的引物5端需要和線性化載體末端有的重疊（圖中藍(lán)色和黃色片段）；圖3：目的片段同源的引物設(shè)計針對雙酶切法線性化載體設(shè)計插入片段的引物，其重疊區(qū)域為酶切位點，這樣重組成功的質(zhì)粒上會完好保留此兩個酶切位點。如果是法線性化載體，擴增插入片段的引物5端直接設(shè)計成與線性化載體末端525重疊即可。插入片段的3按照一定比例把二者混合在infusion（無縫克隆試劑盒）的2x預(yù)混液內(nèi)，50反應(yīng)20in后直接轉(zhuǎn)化即可。反應(yīng)體系如下：1-3片段4-6片段陽性對照PCR產(chǎn)物+線性化載體質(zhì)粒XU(G.02-0.5pinols)(0.2-1ptuok)10MlHB-inni$loaMasterMil(2k)1ftpl1O|A1101超純H；OUpto20國Up20pl通過以上三步，就可以完成質(zhì)粒重組。只要再進行后續(xù)的轉(zhuǎn)化感受態(tài)等操作，就可以完成載體構(gòu)建。當(dāng)然，這么簡單高效的分子克隆方式，怎么能少了小山$1。無縫克隆試劑盒呢！無論你是要做簡單的克隆，還是多片段克隆