1、葛根抗氧化有效部位的提取分離Extraction and Isolation of Antioxidative Principle from Radix Puerariae lobataeZHONG Wei-yan1, JIANG Hai-qiang1, WANG Jian-ping1*, ZHANG Tao2, YU Peng-fei1(1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;2. Academy of Military Medical Sciences, Beijing 1008

2、50, China)：Objective To investigate the extraction and isolation of antioxidative principle from Radix Puerariae lobatae and probe into the best extraction plan. Methods By Fenton ultraviolet spectrophotometry, the antioxidative activity were compared amongthe rinsed part by distilled water, the rin

3、sed part by 70 % ethanol and total extraction part. The L9(34) orthogonal experimental design was used to optimize the extraction condition. Results The factors in the preliminary test had obvious influences on the extraction and separation. The best extraction and separation method was as follows:

4、hot reflux after crushing, purifying by macroporous adsorption resin and eluting with 70 %ethanol. The activity of antioxidation was the rinsed part by 70 %ethanol total extraction part the rinsed part by distilled water. The optimal technological condition was as follows:extractionwith 8 times of 7

5、0 %ethanol at 100 Cfor 3 times （1.5 hours each time）. Conclusion This study confirms the flavones have evident antioxidative activity and the optimal technological condition is stable, simple and feasible.葛根為豆科植物野葛 Pueraria lobata （Wiled.） Ohwi的根， 主要成分為葛根素、大豆苷元、大豆苷等異黃酮類化合物。現代 藥理研究表明，葛根總黃酮具有降血壓、減慢心率、

6、擴張冠狀動 脈、降低心肌耗氧量、改善心、腦血液供應等作用，治療高血壓 引起的頭痛、頭暈、耳鳴等癥狀有明顯療效。我們研究了葛根總 黃酮的提取工藝，用大孔樹脂法分離總黃酮，并用紫外分光光度 計測定了總黃酮含量 1 。1儀器與試藥儀器721型分光光度計（上海精密實驗儀器廠）； ZK-28 真空干 燥器（上海實驗儀器廠） ； UV-3010 型紫外可見分光光度計（日 立）。試藥葛根（購自山東淄博鼎立中藥材公司， 經山東中醫藥大學藥學院周鳳琴老師鑒定）；葛根素標準品（中國藥品生物制品鑒定 所)；D101型大孔吸附樹脂；所用試劑均為分析純。實驗方法2.1 提取工藝流程 2葛根稱重溶劑提取抽濾濃縮定容上柱洗

7、脫液 濃縮真空干燥粗提物抗氧化活性的測量221原理 根據Fen ton方法產生？OH自由基的模型， H2O2與Fe2+反應生成？OH自由基,該反應式為：Fe2+ +H2O2 Fe3+ ?Oh+ 0H-水楊酸能有效地捕捉？OH自由基且生成有色產物，在 510 nm 處被較強吸收， 從而可在反應一定時間后， 測定吸光度值 (A0)。 若在該體系中再加入黃酮類化合物，由于它能清除？OH自由基，從而使有色物質的濃度降低。在此條件下測定體系的吸光度值(Ax)則可用于計算黃酮類化合物對 ？OH自由基的清除效率，清 除效率(% = (A0- Ax) /AO X 100 %。抗氧化活性體外測定方法 3在25

8、mL刻度試管中依次移取 2 mmol/L FeSO4溶液2 mL 6 mmol/L H2O2溶液2 mL,混合均勻后加入 6 mmol/L水楊 酸溶液6 mL,在3637 C恒溫水浴中保溫 15 min，用分光光 度計測其A值，即得A0值。在A0測定體系中，分別加入一定濃度的供試品溶液，在3637 C恒溫水浴中保溫15 min,用分光光度計測 A值，即得 Ax 值2.3 紫外分光光度法測總黃酮含量 4以葛根素標樣， 用外標一點法， 測定葛根粗提物中總黃酮的 含量。2.3.1標準曲線的繪制精密稱取標準品葛根素2 mg置于10mL量瓶中，加95 %乙醇溶解定容，搖勻后分別取0.1 , 0.2 ,0

9、.3，0.4，0.5，0.6 mL 置于 10 mL 量瓶中，各加乙醇 1.0 mL， 再用蒸餾水定容，搖勻。以乙醇作為空白對照，在250 nm波長處測吸光度（A），以吸光度值為縱坐標，標準品濃度為橫坐標， 繪制標準曲線 5 ，見圖 1。運用最小二乘法得線性回歸方程為： y =70.114 x + 0.104 9， R2= 0.994 6 ，呈良好的線性關系。2.3.2樣品溶液的配制精密稱取粗提物10 mg置 于10 mL量瓶中，加95 %乙醇溶解定容，搖勻后精密取1 mL置于25 mL量瓶中定容，同時吸取1 mL乙醇同法處理作為空白對照，于250nm處測吸光度，由回歸方程計算總黃酮含量6。2

10、.4 預實驗影響葛根中總黃酮化合物提取的因素有上柱純化方法 （聚酰 胺與大孔樹脂）、溶媒（水與 70 %乙醇），分別對這幾項因素 做預實驗，以初步確定各因素的影響程度及適用范圍 6 。取 10 g同粒度藥材分別用水和 70 %乙醇提取，上大孔樹脂柱收集洗脫 部位，用2.3的方法測250 nm處的吸光度，結果是 70 %乙醇提取效果好。然后再取 10 g 同樣藥材用 70 %乙醇提取，同樣條件 下分別上聚酰胺和大孔樹脂柱收集洗脫部位，測250 nm處的吸光度，結果是大孔樹脂柱分離純化效果好。再取10 g 相同藥材，70 %乙醇提取，大孔樹脂柱分離，分別測定水洗脫部位、70 %乙醇洗脫部位、 總提

11、取部位的自由基清除率， 結果對自由基的清 除效果為醇洗脫部位 總提取部位 水洗脫部位。因此用 70 %乙 醇提取，大孔吸附樹脂分離純化 7 ，醇洗脫部位的抗氧化活性 較高。正交試驗 以上討論了各因素對葛根總黃酮得率的影響，但實際操作 中，其他因素也影響黃酮的得率，且各因素之間相互交叉影響。 為全面考察各影響因素， 我們設計了 4 因素 3 水平正交試驗 8 ， 見表13。通過對各因素的綜合評價，由極差大小可見，A、B、C、D4因素影響黃酮得率的主次順序為：A D C Bo由表4可見最佳提取工藝為： A2B2C1D，3 即用 8倍于原材料的 70 %乙醇熱回流 提取 3 次，每次 1.5 h 。結論 本實驗以葛根素為對照品用紫外分光光度法比較各分離部 位的抗氧化活性： 醇洗脫部位 總提取部位 水洗脫部位。 紫外分 光光度法測定葛根總黃酮含量的方法可行且操作簡單。 提取分離 的最佳工藝為：用 8倍于原材料的 70 %乙醇回流提取 3次，每次 1.5 h預實驗結果表明， 不同溶劑提取、 上柱方法均可影響總黃酮 得率。70 %乙醇提取要好于水煮液， 可能是因水煮液中