1、 人工胰島素制備工藝的研究及其進展摘要:據WHO統計，全世界糖尿病患者已接近1.2億，而我國目前糖尿病患者的總數已達到3000萬人，躍居世界第二位，其中數百萬患者長期使用胰島素治療。如今我國經濟發展迅速，同時也帶來了巨大生活的壓力和健康問題，并且帶有一定的遺傳因素，數百萬患者需要長期使用胰島素治療。胰島素是由胰島B細胞受內源性或外源性物質如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一種蛋白質激素。而目前臨床使用的胰島素有三種來源：1、動物胰島素（從豬和牛的胰腺中提取，兩者藥效相同，但與人胰島素相比，豬胰島素中有1個氨基酸不同，牛胰島素中有3個氨基酸不同，因而易產生抗體）。2、半合成胰島素（將豬

2、胰島素第30位丙氨酸，置換成與人胰島素相同的蘇氨酸，即為半合成人胰島素）。3、重組人工胰島素（利用生物工程技術，獲得的高純度的生物合成人胰島素，其氨基酸排列順序及生物活性與人體本身的胰島素完全相同）。可見第三種方法是目前最好的副作用最小，而且簡單安全的方法。所以針對重組人工胰島素的制備做了以下研究。關鍵詞：重組人工胰島素；大腸桿菌；（His）6ArgArg一人胰島素原；在當今世界范圍內，諾和諾德、輝瑞、萬安特以及我們國內的通化東寶、深圳科興等生物技術公司在胰島素的生產技術上已經都是很先進的水平了，也就是重組人工胰島素的制備方法。這種方法是自從動物中提取胰島素和人工合成胰島素的方法以來，最簡便而

3、且是最有效最安全的制備胰島素的方法。它是發酵工程技術和基因工程技術結合的產物，也是造福人類的新一代藥物生產方法。不僅在治療糖尿病方面的作用突出，同時對治療癌癥等嚴重影響人類健康的疾病的治療開創了思路。所以，作為本科生的生物技術專業制藥方向的大學生來說，這種利用基因工程，發酵工程等方法工業制備胰島素的原理和流程的工藝，和這種開拓創新的思維是我們必須要了解和學習得。1重組人工胰島素的生產原理通過基因工程酵母菌發酵生產hPI，經后加工形成hi。酵母系統下游后加工比細菌表達系統簡單，但缺點是生產慢，生產周期長，且重組蛋白分泌量少（150mg/L），產量低。因此，雖然rhi投放市場已久，但人們一直在努力

4、尋求和探索更加有效的表達系統和高效的表達策略I2J，尤其是對E.CO尻表達系統的研究更是越來越深入，用E.coli系統表達hPI的策略也越來越多。另一方面，在胰島素的基因工程生產中，下游處理非常復雜，復雜的下游處理極大地降低了胰島素的最終收率。本研究圍繞著提高重組目的蛋白表達量，簡化下游處理過程等方面進行探索，建立了一套經過優化的高效完整的基因工程E.coli發酵表達(His)6ArgArg一人胰島素原(His)6ArgArghumanproinsulin,PPhPI,后加工成hl的制備工藝。2重組人工胰島素的生產工藝流程菌種的制備目的基因的提取既從人的DNA中提取胰島素基因，可使用限制性內切

5、酶將目的基因從原DNA中分離。主要有如下4種方法：(1)鳥槍法：用一大堆限制性核酸內切酶對附近基因進行剪切，再提取所需要的。至于如何篩選，用DNA分子雜交，即DNA探針(2)人工合成法：根據轉錄蛋白或者mRNA推導出基因序列，然后人工合成，沒有內含子。(3)從基因文庫中提取：也就是事先已經提取完畢的拿來用PCR擴增技術：用于大量生產該段基因片段，用于商業化運作。提取質粒使用細胞工程,培養大腸桿菌，從大腸桿菌的細胞質中提取質粒質粒為環狀。堿裂解法：此方法適用于小量質粒DNA的提取，提取的質粒DNA可直接用于酶切、PCR擴增、銀染序列分析。基因重組將取出目的基因與質粒，先利用同種限制性內切酶將質粒

6、切開，再使用DNA連接酶將目的基因與質粒“縫合”，形成一個能表達出胰島素的DNA質粒。將質粒送回大腸桿菌再大腸桿菌的培養液中加入含有Ca+的物質，如CaCl2,這使細胞會吸收外源基因，此時將重組的質粒也放入培養液中，大腸桿菌便會將重組質粒吸收。將大腸桿菌用氯化鈣處理，以增大大腸桿菌細胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質粒能夠進入受體細胞，此時的細胞處于感受態(理化方法誘導細胞，使其處于最適攝取和容納外來DNA的生理狀態)。胰島素的產生和精制(即菌種的發酵培養)重組人工胰島素的工業生產制備和深加工技術在如今已經是爐火純青。有近百年的發酵工程為基礎，結合現在的基因工程技術的產物，在菌種制備后的發酵

7、培養過程更是可靠和安全的。發酵培養流程見下圖表：菌種擴培對從菌種庫中取出的菌種進行活化及初步擴大培養菌種擴培對從菌種庫中取出的菌種進行活化及初步擴大培養在種子罐中對菌種進行進一步的擴大培養，至菌種到對數生長期時轉入發酵罐培養分兩階段進行控制，第一階段主要通過控制溶氧和補加甘油使菌體達到富集的目的，第二階段通過補加甲醇使菌體進行高密度表達目的產物，HPLC檢測目的產物含量目的產物存在于發酵液上清中，此步驟主要控制目的產物收率通過兩步柱層析，分別去除發酵上清液中的色素和雜蛋白利用紫外檢測儀控制目的產物收率，主要試劑為乙醇與異丙醇調節PH值，使P1沉淀，再經離心干燥，得中間體I固體控溫進行轉肽反應，

8、主要試劑為DMSO與1,4-丁二醇再通過柱層析進行提純，主要試劑為異丙醇調節PH值，使P2沉淀，再經離心干燥，得中間體II固體通過控制濕度與溫度進行脫帽反應，得到終產物胰島素主要試劑為丙酮，產品為半固體經過兩步柱層析對胰島素進行提純，試劑為Tris-HCl和異丙醇通過超濾對提純后的胰島素進行濃縮，通過管道傳遞到下工序通過制備色譜對胰島素粗品進行精制，主要試劑為色譜乙腈然后經兩步結晶后通過管道過濾除菌到百級區對胰島素成品進行一次結晶和水洗對水洗后的胰島素進行過濾除菌后凍干，即得胰島素成品制得的胰島素經過深加工，可以得到片劑，注射劑和肺部吸入制劑等。3藥物檢測這種重組人工胰島素的檢測重點應該是測定

9、生物活性效價測定控制產品中雜質潛在有害物質保證產品安全性和有效性胰島素的生物效應包括許多方面,它是體內唯一能降低血糖的激素。也是唯一時促進糖原、脂肪、蛋白質合成的激素。胰島素的主要靶器官為肝臟、肌肉及脂肪組織,它控制著三大營養物質糖、蛋白質、脂肪的代謝和貯存。最明顯的作用是影響糖的代謝,降低血糖,即促進肝臟及肌肉組織中葡萄糖的利用,激活糖原合成酶和丙酮酸脫氫酶等的活性,促進糖原的合成并抑制糖原的分解。此外,對肝臟來說還有抑制蛋白質分解的作用;在肌肉組織中促進+K從細胞外向細胞內的轉運；在脂肪組織中促進氨基酸由細胞外向細胞內轉運,促進脂肪的合成,抑制脂肪的分解等作用。這些在細胞水平上對代謝系統的

10、作用是基于胰島素與其受體的結合得以實現的。關于效價的測定中華人民共和國藥典指出供試品制成鹽酸溶液，進入高效液相色譜儀進行色譜分離，用紫外吸收檢測器，于波長214nm處檢測重組人胰島素的吸收值，計算出其含量。無數臨床試驗證明，到目前為止，重組人工胰島素是穩定糖尿病最好的選擇，其沒有潛在的危險，并且安全可靠。4問題與展望胰島素在糖尿病治療中具有無可替代的作用和地位，但因注射給藥讓許多患者產生畏懼心理，使其作用發揮受到限制。為了減少不便和疼痛，醫藥界正在全力以赴投入研究，開發更新的胰島素劑型及給藥方式。目前有關新式胰島素產品的研究方向，可歸納為3類:.新的給藥方式，例如:口服、吸入;.改變藥物代謝機

11、制;.改進注射手段，讓使用者無痛;這是國際國內胰島素類藥物研究發展的前沿和趨勢。4.1非注射型胰島素讓胰島素和其他藥物一樣成為非注射型藥品，通過口服、鼻吸等途徑進入人體而免除注射，需要研究解決制劑吸收的問題。由于胰島素本身的療效和安全性已經非常確定，而改變的是給藥途徑，因此吸收程度和速度是需要解決的首要問題。4.2口服胰島素胰島素本身為蛋白質，口服后會被胃腸道降解破壞，所以常規胰島素不能口服。口服給藥受到胃酸、蛋白分解酶、大分子吸收、肝臟首過效應等影響，因此，口服胰島素的研究方向主要在以下幾方面:.選用惰性材料如高分子纖維素，制成了微小包裹球。這種小球在胃中不溶，保護胰島素不被破壞。現階段的研

12、究成果可保持其生物有效性達到皮下注射給藥的一半。.加入酶抑制劑，將蛋白酶抑制劑與胰島素一起包裹在小球中，可有助于提高胰島素的吸收。.加入吸收促進劑，將胰島素與吸收促進劑同時給藥，能進一步促進口服胰島素吸收，其中的螯合劑能與腸粘膜上活性離子結合，造成膜通道通透性增加而促進藥物在腸道吸收。國內外有關口服胰島素研究報道雖然很多，但至今未見到實際應用于臨床。其主要原因是口服生物利用度低、制劑的穩定性、質量標準等問題尚未解決。口服胰島素的成功與否在于如何解決其在胃腸道的活性和穩定性，一旦成功將是胰島素研究的重大突破。經肺吸入胰島素胰島素經肺吸入給藥，是替代注射最有希望的途徑之一。肺部特殊的生理構造是具有

13、極大的肺泡表面積。此點優勢具有決定性，使胰島素這樣的大分子藥物吸收成為可能;藥物可迅速到達;不必經過肝臟首過效應;提高了藥物的生物利用度。另外重要的一點，胰島素在肺部吸收的速度快，符合內源性胰島素的釋放特征和人體的需要，并且可以在進餐的同時應用，而使用藥更加方便。最新的進展是采用干粉劑型，其優于早先的液體氣霧劑。干粉的穩定性好，保質期可達兩年;干粉的載藥量高，僅需吸13次即可滿足劑量要求，而如果用噴霧則需深吸幾十次。胰島素吸入制劑在國外已進入第二、三期臨床試驗，一些制藥公司的專家相信在不久的將來就會投入使用。此項技術已經引起了廣泛的關注，但其面臨尚待解決的問題是:藥物吸收的穩定性、成本高以及對

14、肺功能的影響等，通過臨床試驗和上市的時間尚屬未知。吸入胰島素相對于傳統的注射方式的優越性不言而喻，且理論上頗具可行性，我們的醫生和患者都在熱切盼望中。其他非注射給藥方式正在研究中的其他非注射胰島素給藥途徑包括:口腔噴霧、鼻腔給藥、直腸栓劑給藥、滴眼劑、透皮或口腔粘膜給藥。這些非注射給藥途徑都有一些難以克服的問題，如吸收緩慢、藥峰濃度低、生物利用度低等，均不能達到注射劑的效果，目前尚無法適合糖尿病臨床治療的需要。胰島素非注射給藥是醫藥界的重大和熱門研究課題，其結果對糖尿病治療產生深遠影響。國內外的專家學者正致力于相關的研究開發。參考文獻:1李曉紅，朱慧玲，余榮，李紅霞.重組人工胰島素制備工藝M.四川大學學報，2007,39卷第4期.王瓊慶，馮