1、相對定量方法實際操作（三種常用方法）本人用的是相對熒光定量PCR法，在分子水平上比較課題中5種新基因的表達差異。實驗進行很多次，感受頗深，同時遇到了 -些問題：擴增效率,標準品選擇（及賦值）標準曲線、重復 性等問題，希望有同行朋友一起探討和指教。Comparative Delta-delta Ct 法定流程（RG6000 軟件設置）1）.先對樣品中的目的基因與看家基因分別做標準曲線，通過標準曲線確定兩個基因的擴增效率是否一致或接近；將擴增效率優化為一致。2）.同一樣品分別進行看家基因和目的基因的擴增，分列在兩頁中P1P21 I 1 相同的樣品在兩頁里命名成相 同的名稱，并定義為unknownI

2、分別分析P1和P2頁選 delta-delta Ct 選項T依次填入，并定義對照樣品完成分析公式：F=2-r待檢樣品目_待檢樣品看- F=2-r待檢樣品目_待檢樣品看- 的基因平均-家基因平均ct值 ct值對照組目的L基因平均ct 值對照組看家q 基因平均ct值Comparative Delta-delta Ct法的特點，注意事項及實際應用. Comparative Delta-delta Ct法是很常用的一種相對定量方法，其最大特點是，當優化的體系已經建立后，在每次實驗中無需再對看家基因和目的基因 做標準曲線，而只需對待測樣品分別進行PCR擴增即可。.其缺點是，每次實驗都默認目的基因和看家基

3、因的擴增效率一致，而并非真實擴增情況的反映，這里勢必存在一定的誤差。. Comparative Delta-delta Ct法展開定量實驗前，在預實驗中，必需對目的基因和看家基因做兩組標準曲線。Rotor-Gene的軟件會自動給出兩組標準曲 線的R值、擴增效率等信息，如果兩組標準曲線的斜率，即M值的差小于 0.1，那么后續實驗中就可以用Comparative Delta-delta Ct法進行相對定量 分析。反之，如果M差值大于0.1,就無法用該方法進行相對定量分析。此 時的解決方法有兩種，一是優化實驗，使兩組標準曲線的斜率差值小于0.1, 二是換用其它的相對定量方法。應用實例:腫 Quant

4、 - Result x 腫 Quant - Result x - Cjclxng FAM/Sjrhr ( _ | O | X | Slandar d Curve -A-FAV/Sj-br NdNarriETjpe | 口| GivenCmc |匚口口Cdc Cmc |Ci3j *1ijenraHrterest 1SlandaidE4 47LOOTTO2ijenraHrterest 1Slandaid&3LEOO3ijenraHrterest 1SlandaidW41 .roo124GBtiBaf lute rest 2Standard38.1210D!5GBtiBaf lute rest 2S

5、tandard27.9310D116GBtiBaf lute rest 2Standard10D17如Eufldtei做 3Slanddid32.03ID8如Eufldtei做 3Slanddid3147IDg如Eufldtei做 3Slanddid31.73ID1DGerie al InbsieEf 4-Sla-idsidssea1T|7|_. . . 1 .L. -L 4r i. j. jnj Ti11 ij-ODIW10-0210T13Conccrtrrtion1Q-T21如1Q-T2Ceding A.FVSYtar Page 11：1Q-T21如1Q-T2Ceding A.FVSYta

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8、a-delta Ct 法兩進行相對定量。在完成上述預實驗之后，接下來就可以正式對待測樣品進行定量分析。在該實驗中，分別對待測樣品的看家基因和目的基因進行擴增，下圖即為一個標準的擴增分析結果:TETTn-me-GrriCOTrircfilCeJc Ccfk |Ccpie|Vji |F4p ClRsp. Ct 9id Ffep. Cl 0351 Cl) I RSSrSKep Ol5：由g 1AUri-ncMnIB. 3015960.33 口4.90.1631|1HdLdtketpei G&e A15SflHduttpef Gw AHBjeekttpef fere AUrrKnikfflgHc.qr

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14、n1S5QBUrkncM1652-0UnkiwM17.00-CUrJcnovjn1679cUrl:nwn1&3GJ-Unknwn1S72JLiu-ur 如!女9QHAverw Ampfihcalicri 1.76+0117|娘.如而 dtcswCalitwatof R用敝 r -上圖左下方即相對表達量的結果，其中Rep.Conc為樣品B、C相對于對照組A 的目的基因濃度。右側，可通過修改Calibrator Replicate改變對照組，以獲得 不同的比較結果。在Report中同樣給出拐點圖和相對定量的比值結果：Talks off Graph far Cycling A.FAMfSybrdF2VdECdF2VdEC5111jLu35 Lycfe-NhColour Nam