1、暑期綜合實驗-微生物實驗報告實驗?zāi)康姆肿訉嶒炛?，已將目的基因倒入大腸桿菌，并篩選出能夠表達(dá)目的基因的陽性細(xì)胞。但由于大腸桿菌很容易被噬菌體侵染，故本次微生物實驗選用不易被噬菌體侵染的鹽單胞菌進行發(fā)酵培養(yǎng)。本次實驗主要是學(xué)會微生物發(fā)酵的基本原理；了解并熟悉發(fā)酵罐的使用及發(fā)酵流程；了解發(fā)酵工程相關(guān)知識。另外，要學(xué)習(xí)在實驗室大規(guī)模培養(yǎng)微生物細(xì)胞的方法，學(xué)習(xí)液體培養(yǎng)基的配置及細(xì)菌生長過程中的注意事項，測定細(xì)菌生長曲線。實驗背景廣義的發(fā)酵是指利用微生物制造和生產(chǎn)各種目的產(chǎn)物的過程，包括利用好氧微生物進行的需氧發(fā)酵、利用兼性厭氧微生物進行的兼氧發(fā)酵和利用厭氧微生物進行的厭氧發(fā)酵。發(fā)酵工程是指采用現(xiàn)代工程技

2、術(shù)手段，利用微生物的某些特定功能，為人類生產(chǎn)有用的產(chǎn)品，或直接把微生物應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)過程的一種技術(shù)。發(fā)酵工程的內(nèi)容包括菌種選育、培養(yǎng)基的配置、滅菌、種子擴大培養(yǎng)和接種、發(fā)酵過程和產(chǎn)品的分離提純（生物分離工程）等方面。 微生物發(fā)酵的基本理念就是利用各種人工控制手段為微生物創(chuàng)造最舒適的環(huán)境，促成其進行某種特定的代謝，以最大限度地獲得目的產(chǎn)物。對于微生物生長來說，各種重要的影響因子：水，溫度，鹽，氧氣，碳源，氮源，生長因子等的差異，都有可能造成重要的影響。因此在發(fā)酵過程中，適當(dāng)?shù)目刂乒迌?nèi)的上述因子，以使其適應(yīng)所需，顯得尤為重要。 發(fā)酵的基本過程有：發(fā)酵原料的預(yù)處理，菌種的活化和種子擴大，微生物發(fā)酵和

3、控制，發(fā)酵產(chǎn)物的分離提取。一般而言，發(fā)酵并不僅僅只是單純的細(xì)胞擴增的過程的還包括上游的菌種處理，培養(yǎng)基和滅菌鍋的處理以及下游的目的產(chǎn)物的分離純化過程，很有可能這些上下游的過程的成本或者勞動消耗還要超過在發(fā)酵中的投入。具體的講，其中上游工程包括優(yōu)良種株的選育，最適發(fā)酵條件（pH、溫度、溶氧和營養(yǎng)組成）的確定，營養(yǎng)物的準(zhǔn)備等。發(fā)酵工程中要有嚴(yán)格的無菌生長環(huán)境，包括發(fā)酵開始前采用高溫高壓對發(fā)酵原料和發(fā)酵罐以及各種連接管道進行滅菌的技術(shù)；在發(fā)酵過程中不斷向發(fā)酵罐中通入干燥無菌空氣的空氣過濾技術(shù)；在發(fā)酵過程中根據(jù)細(xì)胞生長要求控制加料速度的計算機控制技術(shù)；還有種子培養(yǎng)和生產(chǎn)培養(yǎng)的不同的工藝技術(shù)。此外，根據(jù)

4、不同的需要，發(fā)酵工藝上還分類批量發(fā)酵：即一次投料發(fā)酵；流加批量發(fā)酵：即在一次投料發(fā)酵的基礎(chǔ)上，流加一定量的營養(yǎng)，使細(xì)胞進一步的生長，或得到更多的代謝產(chǎn)物；連續(xù)發(fā)酵：不斷地流加營養(yǎng)，并不斷地取出發(fā)酵液。下游工程指從發(fā)酵液中分離和純化產(chǎn)品的技術(shù)：包括固液分離技術(shù)（離心分離，過濾分離，沉淀分離等工藝），細(xì)胞破壁技術(shù)（超聲、高壓剪切、滲透壓、表面活性劑和溶壁酶等），蛋白質(zhì)純化技術(shù)（沉淀法、色譜分離法和超濾法等），最后還有產(chǎn)品的包裝處理技術(shù)（真空干燥和冰凍干燥等）。發(fā)酵工程以其生產(chǎn)條件溫和，原料來源豐富且價格低廉，產(chǎn)物專一，廢棄物對環(huán)境污染小和容易處理等特點，而在醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)、農(nóng)業(yè)、冶金工業(yè)、環(huán)境

5、保護等許多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，逐步形成了規(guī)模龐大的發(fā)酵工業(yè)。實驗儀器及藥品儀器超凈工作臺恒溫振蕩培養(yǎng)箱分光光度計分析天平發(fā)酵裝置（包括發(fā)酵罐，溫度、pH控制系統(tǒng)，等）通氣瓶（2個，分別裝高濃度氫氧化鈉溶液和氯化鈣粉末）高溫滅菌鍋高速臺式離心機5ml離心管若干有刻度有蓋試管：若干250mL、500mL三角瓶移液槍另需：試管架、封口膜、橡皮筋、酒精棉、鑷子等藥品種子培養(yǎng)基（LB）： 胰蛋白胨（Tryptone）10g/L,酵母抽提物（Yeast extract）5g/L,氯化鈉（NaCl）60g/L發(fā)酵培養(yǎng)基： 胰蛋白胨（Tryptone）5g/L,酵母抽提物（Yeast extract）10g

6、/L,氯化鈉（NaCl）60g/L磷酸氫二鉀（K2HPO4）磷酸二氫鈉（NaH2PO4）葡萄糖（glucose）氫氧化鈉（NaOH）氯化銨（NH4Cl）硫酸鎂（MgSO4）消泡劑(antifoam)實驗中所用發(fā)酵罐型號NBS Bioflo 110（臺式），其基本構(gòu)造如圖1所示：圖1. NBS Bioflo 110 發(fā)酵罐示意圖實驗流程 實驗的大致流程是： 鹽單胞菌的一級活化（由助教完成）實驗藥品的準(zhǔn)備及發(fā)酵罐的滅菌發(fā)酵罐的安裝及調(diào)試接種發(fā)酵過程中補料及取樣、記錄測量數(shù)據(jù)發(fā)酵終止及下罐測量數(shù)據(jù)下面為具體步驟：（一）實驗準(zhǔn)備1. 試劑配制：（1）種子培養(yǎng)基LB：表 SEQ 表格 * ARABIC

7、1胰蛋白胨Tryptone 10 g/L酵母抽提物Yeast extract 5 g/L氯化鈉NaCl 10 g/L8*100ml，調(diào)pH至9。（2）發(fā)酵培養(yǎng)基： 表 SEQ 表格 * ARABIC 2胰蛋白胨Tryptone 5 g/L 酵母抽提物Yeast extract 10 g/L 氯化鈉NaCl 60 g/L 定容至3.2 L。（3）補料：葡萄糖溶液：88 g葡萄糖加水定容至160 mL；氫氧化鈉溶液：40 gNaOH加水定容至200 ml；氯化銨和硫酸鎂混合液：NH4Cl 2 g/L；MgSO4 0.2 g/L；磷酸氫二鉀和磷酸二氫鈉混合液：K2HPO4 1.5 g/L；NaH2P

8、O4 9.65 g/L（所有配制好的培養(yǎng)基都和發(fā)酵罐一起高溫高壓滅菌）2. 儀器準(zhǔn)備（1）校正pH電極： 打開發(fā)酵罐系統(tǒng)的動力開關(guān)，選擇“fermentation”,“screen”調(diào)至“calibration”，“enter”確認(rèn)。 用“”調(diào)至“zero”。 把pH電極浸入pH值為4.0的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中, 調(diào)至read檔后輸入4.0。 用“”鍵調(diào)到“span”檔。 pH電極用蒸餾水清洗后浸入pH為6.86的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中, 調(diào)至read檔后輸入6.86。 重復(fù)校正2次，直至read的值與所設(shè)值相差在0.02以內(nèi)。（2）發(fā)酵罐的準(zhǔn)備 滅菌前，對發(fā)酵罐進行如下操作：pH電極安裝上。把發(fā)酵罐與外界連通

9、的橡膠管都要用皮筋扎緊，通氣口等用濾膜封口。其中補料孔一共有3孔，因此要用橡膠管把除補堿孔之外的其余兩孔用橡膠管連通，保證不與外界相接觸，補堿口用一頭扎住的橡膠管套住封閉。滅菌前，在發(fā)酵罐內(nèi)加入發(fā)酵原液。進行檢查：發(fā)酵罐不與外界連通，防止漩渦形成的擋板與發(fā)酵罐玻璃壁之間無其他物體，然后可以進行滅菌。（3）高溫滅菌將配制好的培養(yǎng)基、各種試劑、處理好的發(fā)酵罐一起放入高壓滅菌鍋中，高溫滅菌。（4）發(fā)酵裝置的連接和設(shè)置將滅菌后的發(fā)酵罐取出，除去各管封口膜。把pH電極、溶氧電極和溫度傳感器與控制儀器相連，在發(fā)酵罐外壁包上電熱毯，接通冷卻水管和空氣出口處的冷凝器上的冷卻水管。裝上攪拌馬達(dá)。在超凈工作臺上把

10、氫氧化鈉溶液和氯化鈣粉末分別加到兩個通氣瓶里，與進氣口連濾膜的橡膠管相連，是空氣先通過堿瓶，再通過氯化鈣瓶，最后通過濾膜進入發(fā)酵瓶。（5）校正DO電極的滿刻度利用光標(biāo)將攪拌速度調(diào)至800r/min，把通氣量調(diào)節(jié)到4.0L/min/4L發(fā)酵液(1vvm)。調(diào)到calibration界面，光標(biāo)調(diào)至DO處，“span”檔，設(shè)定讀數(shù)為100，反復(fù)調(diào)節(jié)幾次，直至穩(wěn)定至100，轉(zhuǎn)至menu界面，同樣方法校正零點。（6）再次校正PH電極雖然滅菌前已經(jīng)校正過pH，但高溫滅菌時會有變化，在發(fā)酵開始前要再次校正。在發(fā)酵罐中取出一點樣，用pH計測出其pH值，pH電極設(shè)定界面重新設(shè)定PH值。（7）參數(shù)設(shè)定把光標(biāo)調(diào)到A

11、git檔，設(shè)定最小值為200r/min。把光標(biāo)調(diào)到DO檔,設(shè)定參數(shù)為30, 調(diào)整為與溶氧偶聯(lián)檢測。把光標(biāo)調(diào)到Agit檔，設(shè)定最大值為800r/min。 把光標(biāo)調(diào)到pH檔,設(shè)定參數(shù)為8.8，調(diào)整為自動檢測。 把光標(biāo)調(diào)到“Temperature”檔, 設(shè)定溫度為37。打開自動檢測系統(tǒng)。（二）鹽單胞菌的二級活化（即發(fā)酵）1加料和接種帶上防火手套，將蘸滿乙醇的棉花沿加料口圍一圈，將接種口的蓋子旋松。點燃棉花球，用鑷子取掉蓋子，向發(fā)酵罐中倒入配好的兩種鹽混合溶液。接種后，可加入少量（1-2滴消泡劑）用攝子將蓋子在火焰上轉(zhuǎn)一輪后放回原位，旋緊。發(fā)酵過程中的取樣和測量（1）發(fā)酵過程中，每隔半小時記錄轉(zhuǎn)速和A

12、git值，每隔1小時取樣5ml*2放入事先稱好重量并做好標(biāo)記的兩支離心管內(nèi)，待測細(xì)胞干重和發(fā)酵液糖含量變化。注意：每次取樣，前半管丟棄，再取一管才進行留樣和測量。（2）測定OD600（用留樣后取樣瓶中剩余的液體，測前吹打均勻）。注意：這里是根據(jù)濁度測量，測量值在0.2-0.7之間比較準(zhǔn)確，若測量值超過0.7，可用去離子水稀釋。（3）用糖試紙粗測糖含量，葡萄糖濃度小于10 g/L時，補加葡萄糖，注意也是在火上操作，并且加糖前后都要取樣。（4）若發(fā)酵過程中氣泡過多，（超過發(fā)酵罐空氣體積的一半），加入消泡劑（一次1-2滴），火上操作。約10 h后（從9點到19點），發(fā)酵結(jié)束，下罐，清洗裝置，把細(xì)菌用

13、強堿溶液殺死后再倒入水池（6）將離心管中的樣品離心，上清液倒入干凈的離心管中保存測糖，細(xì)胞干燥待測干重。發(fā)酵動力學(xué)曲線測定及分析葡萄糖的測定3,5-二硝基水楊酸溶液的配制（由助教完成）標(biāo)準(zhǔn)曲線配置10 g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液100ml，分別取配置好的葡萄糖溶液0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mL，補水至1 mL，于25mL刻度清晰地有蓋試管中，配置成有梯度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液： 表 SEQ 表格 * ARABIC 3葡萄糖濃度g/L 0 1 2 3 4 5 67葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液mL 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.60.7H2O mL1.0 0.9 0.

14、8 0.7 0.6 0.5 0.40.3各加入2.0ml的3,5-二硝基水楊酸反應(yīng)液，每四個試管用橡皮筋捆成一捆，戴上絕熱手套，按住玻璃塞，同時在沸水加熱2min，迅速水冷，定容至25ml，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)樣。以0 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（加過3,5-二硝基水楊酸溶液）調(diào)零，測定標(biāo)樣的OD540，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意：配置葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)整個過程應(yīng)由一個人操作，以保證標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性在0.99以上。并且加樣過程中盡量不要把樣品加到試管壁上，影響曲線的線性。（3）樣品測定在每個離心管中，取0.25 ml發(fā)酵上清液，0.75 ml H2O，置于25ml刻度清晰地有蓋試管中。各加入3,5-二硝基水楊酸溶液2.0

15、ml，每四個試管捆成一捆，置于沸水中煮2分鐘，迅速水冷，用水定容到25ml，搖勻，作為待測樣。測定OD540由此計算發(fā)酵液中的糖含量。 注意：由于要加的試管比較多，可流水線作業(yè)，每人負(fù)責(zé)加一種液體，定容時，一人負(fù)責(zé)粗定容，一人負(fù)責(zé)最后定容。加樣時不要把樣品加到試管壁上。細(xì)胞干重的測定發(fā)酵過程中收集的樣品，8000rpm，離心min（上清轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中），在細(xì)胞沉淀的離心管中加入5 ml去離子水，用移液槍攪勻，再次離心，出去上清液，然后真空冷凍干燥約12h除去細(xì)胞中水分，測量每個離心管中的細(xì)胞干重。實驗數(shù)據(jù)處理和結(jié)果分析繪制溶氧、轉(zhuǎn)速、OD600、細(xì)胞干重、葡萄糖濃度隨時間變化的曲線圖，分

16、析細(xì)菌生長的各個階段（遲滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期）的細(xì)菌生長狀況與底物、溶氧的關(guān)系。分析計算鹽單胞菌在對數(shù)生長期的代時，與理論值比較。實驗數(shù)據(jù)處理及分析鹽單胞菌生長曲線實驗過程中的事件和OD600測量，及結(jié)果的分析與討論：表4 原始培養(yǎng)記錄（2012-8-30）時間、事件轉(zhuǎn)速/rpm溶氧dO2OD600稀釋倍率（樣品：水）離心管重(g)1號2號9:00加料前200100.2-9:00加料后20060.00.500未稀釋2.97473.00109:3029234.3-10:0026639.20.711未稀釋3.03882.992210:3027037.0-11:0031735.50.6041

17、:12.72403.050911:3034423.7-12:0029917.60.5921:22.92232.766212:19加糖后-0.5571:22.85852.920112:3027326.6-13:0040056.90.6111:23.05933.015613:3040039.0-14:0060059.80.5931:53.04652.793114:3070069.3-15:0070045.90.5311:92.83133.031815:3080056.3-16:0080038.90.5981:142.84032.721016:3080027.0-17:0080011.50.6121

18、:192.93243.029617:308006.9-17:37加糖前-0.7011:242.70742.998017:38加糖后-nullnull2.79042.938218:008005.00.7051:252.80482.705519:00nullnull0.6041:392.73953.0584注：“-”表示該處數(shù)據(jù)沒有必要測定；“null”表示該處數(shù)據(jù)缺失。簡單分析：實驗過程中，影響鹽單胞菌生長繁殖速度的因素有：鹽濃度、pH、溶氧量、葡萄糖濃度、溫度。其中，溶氧量與轉(zhuǎn)速偶聯(lián)，可通過儀器自動調(diào)節(jié)；發(fā)酵裝置有冷凝水裝置和電熱毯，因此，溫度也可通過儀器自動調(diào)節(jié)；細(xì)菌生長過程中會產(chǎn)生酸性物質(zhì)

19、，在pH降低時系統(tǒng)能自動通過堿泵向發(fā)酵罐中泵入堿以調(diào)節(jié)pH；而當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)糖濃度低于10 g/L, 細(xì)菌生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)不足，繁殖速度減小，需加葡萄糖以保證細(xì)菌的正常生長繁殖。通過盡可能是細(xì)菌處在最適生長環(huán)境，來保證細(xì)菌的生長速度。我們這組由于電腦不能記錄細(xì)菌生長過程中個參數(shù)變化，下圖是根據(jù)實驗記錄繪出的各參數(shù)隨時間變化曲線，9:00記為第0個小時：圖2 轉(zhuǎn)速和溶氧值隨時間變化曲線圖 3 OD600隨時間變化曲線分析與討論（1）環(huán)境因素對細(xì)菌生長繁殖的影響轉(zhuǎn)速和溶氧對細(xì)菌生長的影響：溶氧量的變化能在一定程度上反應(yīng)細(xì)菌的生長情況：接種細(xì)菌前后，溶氧量降低幅度較大，細(xì)菌生長會消耗培養(yǎng)液中的氧氣，隨

20、著細(xì)菌繁殖，細(xì)菌的數(shù)目增多，耗氧量增大，培養(yǎng)液中的溶氧量降低，系統(tǒng)會通過提高轉(zhuǎn)速來增大溶氧量。另外，攪拌也使得培養(yǎng)液各部分溫度和pH一致，保證了細(xì)菌良好的生長環(huán)境。在本次試驗中，轉(zhuǎn)速和溶氧量是耦合起來的，當(dāng)溶氧量（圖2紅色曲線）降低到設(shè)定的最低溶氧量30%時，系統(tǒng)會自動提高轉(zhuǎn)速（圖2藍(lán)色曲線）使培養(yǎng)液充分與空氣接觸，從而是培養(yǎng)液中溶氧量上升；而當(dāng)溶氧量升高到一定程度，轉(zhuǎn)速會稍微降低。從圖2可以看出，紅色曲線和藍(lán)色曲線的波動是相互耦合的。但轉(zhuǎn)速不能一直增大，否則會影響細(xì)胞生長，實驗中我們設(shè)定的最大轉(zhuǎn)速是800 rpm.圖2，第4小時以后轉(zhuǎn)速增幅較大，說明耗氧量迅速上升，細(xì)菌從此時開始迅速繁殖，而

21、圖3中從第4小時候迅速增加的OD600也與支持這個結(jié)論?？梢?，在實驗過程中，我們提供的條件：pH = 8.8，溫度37 ，高鹽等條件是適合鹽單胞菌生長的。溫度對細(xì)菌生長的影響：鹽單胞菌的最適溫度為37左右，溫度過高活著過低都會降低鹽單胞菌細(xì)胞內(nèi)酶的活度，從何降低代謝水平，細(xì)胞的繁殖速度也會下降，因此，當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)液體溫度降低時，發(fā)酵罐外壁的電熱毯會給液體加熱，而當(dāng)溫度過高時，發(fā)酵罐的冷凝水循環(huán)系統(tǒng)會降低培養(yǎng)液溫度，而攪拌也是的培養(yǎng)液各部分溫度均勻，給細(xì)菌生長提供最適溫度。pH對細(xì)菌生長的影響：鹽單胞菌是嗜堿細(xì)菌，最適pH為8.8，在細(xì)菌生長過程中，會產(chǎn)生酸性的代謝產(chǎn)物，使培養(yǎng)液pH降低，此時，系

22、統(tǒng)會泵入適量的氫氧化鈉溶液是發(fā)酵罐內(nèi)pH維持在8.8左右，保證細(xì)菌正常生長繁殖，攪拌可使溶液中氫氧化鈉混合均勻，不會產(chǎn)生部分溶液pH過高或過低的情況。另外，磷酸氫二鉀和磷酸二氫鈉的緩沖對會使培養(yǎng)液pH不至于變化太大。鹽濃度對細(xì)菌生長的影響：鹽單胞菌適宜在高鹽環(huán)境生長。在實驗開始時，發(fā)酵罐內(nèi)鹽濃度就很高，保證了細(xì)菌的正常生長。（2）發(fā)酵過程中OD600的變化OD600可以粗略反應(yīng)細(xì)菌數(shù)量的增長情況：培養(yǎng)液中細(xì)菌數(shù)量增加，液體的渾濁程度增加，OD600值也會增加。從圖3可以看出：前4個小時，細(xì)菌還處于活化過程，細(xì)菌數(shù)量增長緩慢，處于遲滯期，從第4小時后，細(xì)菌適應(yīng)了發(fā)酵罐內(nèi)的環(huán)境，氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)充足

23、，高堿、高鹽的環(huán)境，溫度適宜，再加上此時細(xì)菌有一定的數(shù)目，因此細(xì)菌數(shù)量快速增長，處于對數(shù)期，很遺憾我們發(fā)酵時間不夠長，沒有看到細(xì)菌增長的穩(wěn)定器和衰退期。（3）發(fā)酵過程中細(xì)菌質(zhì)量濃度的變化發(fā)酵過程中，每個一小時會取樣留樣，離心去上清并清洗后，低溫冷凍干燥測每一管的細(xì)菌干重，可以較為準(zhǔn)確直觀地反映鹽單胞菌的增長情況，具體數(shù)據(jù)見下表：表5 鹽單胞菌干重隨時間變化第一管第二管時間/h離心管凈重/g離心管與菌體干重/g菌體干重/g時間/h離心管凈重/g離心管與菌體干重/g菌體干重/g02.97472.97730.002603.00103.00320.002213.03883.04030.001512.9

24、9222.99380.001622.72402.72810.004123.05093.05430.003432.92232.92710.004832.76622.77120.0053.32.85852.86170.00323.32.92012.92410.00443.05933.06290.003643.01563.01920.003653.04653.05360.007152.79312.80040.007362.83132.8178-0.013563.03183.04250.010772.84032.85930.019072.72102.74040.019482.93242.96240.0

25、30083.02963.05990.03038.62.70742.74060.03328.62.99803.02930.03138.612.79042.82120.03088.612.93822.96980.031692.80482.85130.046592.70552.73650.0310102.73952.79900.0595103.05843.12050.0621*紅色字體標(biāo)出的數(shù)據(jù)是測量過程中出現(xiàn)錯誤,因此此組數(shù)據(jù)只用第二管的，不取兩管平均值我們已經(jīng)測出了同一時間取出的兩組5 mL液體中的鹽單胞菌干重X1和X2，取平均值（X1+X2）/2，則菌體濃度為C = 200*（X1+X2）/2

26、 g/L。菌體濃度偏差為兩平行樣間的絕對差值為（X1-X2）/2。處理后的數(shù)據(jù)見表6。表6 鹽單胞菌濃度隨時間變化時間/h管一細(xì)胞干重/g管二細(xì)胞干重/g菌體平均干重/g菌體平均濃度/g/L00.00260.00220.00240.4810.00150.00160.001550.3120.00410.00340.003750.7530.00480.0050.00490.983.30.00320.0040.00360.7240.00360.00360.00360.7250.00710.00730.00721.446-0.01350.01070.01072.1470.01900.01940.019

27、23.8480.03000.03030.030156.038.60.03320.03130.032256.458.610.03080.03160.03126.2490.04650.03100.038757.75100.05950.06210.060812.16繪制菌體濃度-時間關(guān)系曲線，并作出誤差線，可以更加直觀地反映菌體生長情況。圖4 菌體濃度隨時間變化曲線圖5兩平行樣的絕對差值分析與討論由圖4可見，菌體濃度隨時間變化曲線很好地反映了微生物生長的遲滯期和對數(shù)期：0-4小時鹽單胞菌數(shù)目增長緩慢，從4小時候開始快速增長，與OD600隨時間變化曲線所反映出的結(jié)果一致。從圖5的誤差曲線來看，第6小時

28、和第9小時的數(shù)據(jù)出現(xiàn)了很大誤差，但其他組誤差都不大。原因是：第6小時第一管所測得的細(xì)胞干重是負(fù)數(shù)，說明測量錯誤，或是前后所用管不一致；第9小時則是因為我們組某一位同學(xué)在用去離子水清洗細(xì)胞時，不小心用移液槍把離心管內(nèi)液體吹到了管外，因此一管數(shù)據(jù)偏小。但其他管誤差很小，說明數(shù)據(jù)還是可信的。（4）OD600與菌體濃度隨時間變化曲線對比比較OD600隨時間變化曲線和細(xì)菌濃度隨時間變化曲線圖6 OD600與菌體濃度隨時間變化曲線比較分析與討論從圖6我們可以看出，OD600隨時間變化曲線和細(xì)菌濃度隨時間變化曲線整體趨勢吻合得很好，都可以看出細(xì)菌生長的遲滯期和對數(shù)期，說明在測量過程中誤差較小，曲線比較真實地

29、反映了細(xì)菌的生長情況。（5）發(fā)酵過程中葡萄糖濃度的變化1. 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線表7 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液OD540測量表編號葡萄糖濃度/g/L實測OD540擬合OD540擬合OD540與真實OD540誤差000.000-110.2310.23430.0033220.4650.4498-0.0152330.6760.6653-0.0107440.8780.88080.0028551.1141.0963-0.0177661.3211.3118-0.0092771.5011.52730.0263繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線：圖7 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線分析與討論我們組的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性達(dá)到了0.9991，這是我們

30、組很多同學(xué)的共同努力的結(jié)果。我們配置葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液時由一人操作完成，且沾到試管壁上的溶液很少，加熱時同時佳人，保證加熱時間一樣，精確定容由一人完成，減少了溶液本身的濃度誤差。測量OD540時，我們用的是同一臺分光光度計，同一個比色皿，由同一位同學(xué)完成。這些都保證了葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性。但在第一次測量時，我們在測量過程中不小心碰到了波長調(diào)節(jié)旋鈕，導(dǎo)致中間數(shù)據(jù)測量出現(xiàn)較大偏差，經(jīng)助教提醒，我們用一個燒杯蓋住了波長調(diào)節(jié)旋鈕，重新測量得到了準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，避免了重新配制溶液。發(fā)酵過程中葡萄糖濃度的測量表8 樣品的OD540測量值和糖濃度時間/h一管OD540二管OD540平均OD540OD540絕對誤差

31、葡萄糖濃度/g/L01.1331.1451.13900.00620.7925811.1651.0901.1275-0.037520.5791221.0951.1311.11300.01820.3099831.0771.1191.09800.02120.031553.31.9041.9061.90500.00135.0106741.8691.8501.8595-0.009534.1661351.8951.9041.89950.004534.9085861.8951.8501.8725-0.022534.4074271.8001.7531.7765-0.023532.6255281.6271.71

32、01.66850.041530.620888.61.5801.6001.59000.0129.163818.612.1102.1102.1100038.8157892.0902.0972.09350.003538.50951102.0242.0182.0210-0.00337.16381由于兩平行組測出的OD540相差不大，因此我們測出了兩組平行管的OD540值X1和X2，取平均值即可，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合曲線，計算出樣品中葡萄糖的濃度，計算公式為：葡萄糖濃度= (（X1+X2）/2- 0.0188/0.2155)*4（因為稀釋了4倍），單位是g/L。作圖得到葡萄糖濃度隨時間變化曲線。圖8葡

33、萄糖濃度隨時間變化曲線分析與討論從圖8我們可以清楚地看到大約在地3.3h和第8.6h補加葡萄糖后，葡萄糖濃度有較大上升。第0-3小時，細(xì)菌處于調(diào)整期，生長速度不大，消耗葡萄糖不多，葡萄糖濃度下降緩慢，從第4小時后，細(xì)菌生長進入對數(shù)期，生長代謝水平加快，消耗葡萄糖的量增多，葡萄糖濃度有較明顯地下降。在第3.3小時和第8.6小時，我們用試紙粗測的葡萄糖濃度應(yīng)該是小于10 g/L的，但從曲線上看，葡萄糖濃度一直是大于20 g/L的，原因可能是試紙測量不準(zhǔn)確，但也有可能是用OD540測葡萄糖濃度時出現(xiàn)了問題，但我們的標(biāo)準(zhǔn)曲線是很準(zhǔn)確的，因此原因可能是離心后倒上清液時把細(xì)胞摻進了上清液里，導(dǎo)致上清液吸光

34、度變大，從而使測得的葡萄糖濃度比實際偏高；也可能是分光光度計使用時間過長，導(dǎo)致OD540測量不準(zhǔn)確。但總體趨勢還是可以反映細(xì)菌的生長趨勢的。（6）菌體濃度與葡萄糖濃度隨時間變化趨勢的對比將葡萄糖濃度和菌體濃度兩組數(shù)據(jù)放在同一張圖上進行對比觀察，得到菌體濃度與葡萄糖濃度隨時間變化曲線。圖9 菌體濃度與葡萄糖濃度隨時間變化曲線分析與討論這張圖可以很好地看出當(dāng)菌體濃度增加時，葡萄糖濃度隨之降低，菌體濃度增長快，則葡萄糖濃度降低快，如在第8小時左右，葡萄糖濃度低，細(xì)菌生長速度明顯減慢，而在第8.6小時加糖以后，細(xì)菌生長速度明顯加快。（7）整個過程所有因素綜合分析討論細(xì)菌整個過程的生長情況可以通過葡萄糖濃度，OD600，菌體濃度來反映：遲滯期第1至4小時，OD600，菌體濃度和葡萄糖含量曲線都比較平穩(wěn)。這個時期細(xì)菌正處于自身活化和適應(yīng)環(huán)境的時期，細(xì)菌并不會大量繁殖，因此數(shù)目增長不快，葡萄糖消耗量也不大。對數(shù)期第4至10小時，此時，細(xì)菌進入快速生長繁殖的階段，細(xì)菌數(shù)目迅速增加，因此細(xì)菌濃度和OD600的值快速增加，消耗葡萄糖的量也快