1、 熒光免疫標記技術 熒光免疫標記技術免疫標記（immunolabelling technic） 是指用一些易測定的、具有高度敏感性的標記物質：熒光素、放射性核素、酶、膠體金、生物素、鐵蛋白及化學（或生物）發光劑等作為追蹤物，標記特異性的抗原、抗體分子進行的抗原、抗體反應。 通過這些標記物的增強放大效應來顯示反應系統中抗原、抗體的性質與含量。并借助于熒光顯微鏡、射線測量儀、酶標檢測儀、電子顯微鏡和發光免疫測定儀等精密儀器對試驗結果直接鏡檢觀察或進行自動化測定。 可以在細胞、亞細胞、超微結構及分子水平上對抗原、抗體反應進行定性和定位研究；或應用各種液相和固相免疫分析方法對體液中的半抗原、抗原進行定

2、性和定量測定。 具有高度敏感性、特異性、快速性。熒光免疫標記技術課件 免疫標記技術主要分為： 免疫熒光技術： 放射免疫測定：自動化儀器價格昂貴、所用試劑半衰期短、危及人體健康 酶免疫技術：敏感、快速、簡便、應用范圍廣、不需特殊設備 免疫標記技術主要分為：免疫標記技術的應用 標記物與抗原、抗體的連接技術； 標記后的抗原、抗體進行特異性檢測的實驗設計原理以及相應的檢測儀器的使用方法。免疫標記技術的應用免疫熒光標記技術（immunofluorescence technique）是將已知的抗體或抗原分子標記上熒光素，當與其相對應的抗原或抗體起反應時，在形成的復合物上就帶有一定量的熒光素，在熒光顯微鏡下

3、就可以看見發出熒光的抗原抗體結合部位，檢測出抗原或抗體。免疫熒光標記技術（immunofluorescence te免疫熒光標記技術始創于20世紀40年代初，1942年Coons等首次報道用異氰酸熒光素標記抗體，檢查小鼠組織切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原。當時由于異氰酸熒光素標記物的性能較差，未能推廣使用。直至1958年Riggs等合成了性能較為優良的異硫氰酸熒光黃（fluorescein isothiocyanate，FITC）。Marshall等又對熒光抗體標記的方法進行了改進，從而使免疫熒光技術逐漸推廣應用。熒光免疫標記技術課件 免疫熒光技術是將抗原抗體反應的特異性和敏感性與顯微示蹤的精

4、確性相結合。以熒光素作為標記物，與已知的抗體(或抗原)結合、但不影響其免疫學特性。然后將熒光素標記的抗體作為標準試劑，用于檢測和鑒定未知的抗原。在熒光顯微鏡下，可以直接觀察呈現特異熒光的抗原抗體復合物及其存在部位。 免疫熒光技術- 基本原理 免疫熒光技術是將抗原抗體反應的特異性和敏感性與顯微示蹤的 熒光是指一個分子或原子吸收了給予的能量后，即刻引起發光；停止能量供給，發光亦瞬即停止。熒光素是一種可吸收激發光的光便能產生熒光，并能作為染料使用的有機化合物，亦稱熒光色素。發生原理：基態激發態產生特點：激發-即刻產生 停止激發-瞬間消失種類：光致熒光，化學熒光，X線熒光，陰極射線熒光熒光 熒光是指一

5、個分子或原子吸收了給予的能量后，即刻引起發光；熒光壽命-熒光物質被瞬時光脈沖激發后產生的熒光衰減到一定程度所用時間。熒光淬滅-熒光物質的熒光輻射能力在受到激發光較長時間的照射后發生的減弱現象。淬滅劑-苯胺、硝基苯、酚等熒光（標記）物質的保存熒光熒光壽命-熒光物質被瞬時光脈沖激發后產生的熒光衰減到一定用于標記的抗體：高特異性和高親和力作為標記的熒光素應符合以下要求：應具有能迅速而穩定地與蛋白質分子形成共價健的化學基團，與蛋白質結合后不易解離，而未結合的色素及其降解產物易于清除。熒光效率高，與蛋白質結合后，仍能保持較高的熒光效率。有強的熒光效應，即使標記后也不出現非特異染色熒光色澤,與背景組織的色

6、澤對比鮮明。容易與自發熒光及其他熒光相區別（如雙重標記時）與蛋白質結合后不影響蛋白質原有的生化與免疫性質。盡可能少褪色標記方法簡單、安全無毒。與蛋白質的結合物穩定，易于保存有良好的水溶性，溶解后不與其它物質發生化學反應，純凈，可用標準試劑檢驗。熒光免疫標記技術課件常用的熒光標記試劑:熒光素類 ：標準熒光素及其衍生物異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）羥基熒光素（carboxyfluorescein,FAM）四氯熒光素（tetrachlorofluorescein,TET）羅丹明類（Rhodamine dye) 標準熒光素的衍生物四甲基異硫氰酸羅丹明（t

7、etramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）常用的熒光標記試劑:異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）外觀：為黃色或橙黃色結晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子式：C21H11NO5S分子量為 389.4純度：95% (HPLC) 最大吸收光波長為490-495nm，最大發射光波長520-530nm，呈現明亮的黃綠色熒光，有兩種同分異結構，其中異構體型在效率、穩定性、與蛋白質結合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應用最廣泛的熒光素。主要優點：人眼對黃綠色較為敏感，

8、通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyan 異硫氰酸熒光素(FITC) 異硫氰酸熒光素(FITC)四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）最大吸引光波長為550nm，最大發射光波長為620nm呈橙紅色熒光與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或對比染色其異硫氰基可與蛋白質結合，但熒光效率較低四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）橘紅色粉末不溶于水，易溶于酒精和丙酮性質穩定，可長期保存最大吸收光波長為570nm，最大發射光波長為595-600nm呈橘紅色熒光四乙基羅丹明（rhodamine，RI

9、B200）熒光FITC+RB200標記熒光FITC+RB200標記熒光素FITC標記抗體當FITC在堿性溶液中與抗體蛋白反應時，主要是蛋白質上賴氨酸的r氨基與熒光素的硫碳胺鍵結合，形成FITC-蛋白質結合物，即熒光抗體或熒光結合物。一個IgG分子中有86個賴氨酸殘基，一般最多能結合1520個，一個IgG分子可結合28個分子的FITC，其反應式如下：FITC-N=C=S + N-H2-蛋白質 FITC-NS-C-N-H2-蛋白質熒光素FITC標記抗體當FITC在堿性溶液中與抗體蛋白反應時FITC標記方法：攪拌法： 適用于標記體積較大、蛋白質含量較高的抗體溶液。優點是標記時間短、熒光試劑用量少，但

10、此法所受影響因素較多，若操作不當會引起較強的非特異性熒光染色出現。直接標記法間接標記法改良法透析法：適用于標記樣品量少、蛋白含量低的抗體溶液，此法標記抗體比較均勻，非特異性染色也比較少。FITC標記方法： 【主要試劑與器材】1器材（1）鐵立架、蝴蝶夾、層析柱、洗脫瓶、攪拌器、磁棒、 紫外分光光度計（2）燒杯、試管、滴管、吸管、洗耳球、pH試紙、黑紙2試劑（1）抗體（2）異硫氰基熒光黃（FITC）（3）葡聚糖凝膠（Sephadex G-25）（4）pH9.5，0. 5M 碳酸緩沖液（5）pH7.0，0.005M 磷酸緩沖液 【主要試劑與器材】取已知濃度的抗體蛋白溶液，用pH9.5，0. 5M 碳

11、酸緩沖液稀釋至最終濃度為20mg/ml。置于包黑紙的小燒杯中，并放入磁棒。稱取適量FITC：按FITC(mg)/抗體蛋白(mg)的質量比為1/100，并計算出需要FITC的量。即：FITC的量(mg)=待標記抗體蛋白總量(mg)0.01。將稱好的FITC放在試管中，并用黑紙包好，然后取相當于稀釋后抗體蛋白溶液體積1/10的pH9.5，0. 5M 碳酸緩沖液溶解FITC。開啟攪拌器，將FITC溶液用滴管逐滴滴入含抗體蛋白溶液的燒杯內，加完后用pH試紙測試，如pH低于9.5，則用碳酸緩沖液調整pH至9.5，加蓋攪拌1小時。用Sephadex G-25裝層析柱，用pH7.0，0.005M 磷酸緩沖液

12、（PB）平衡洗脫。將上述標記液上Sephadex G-25柱。用pH7.0，0.005M PB 洗脫，流速控制為1ml/分鐘。用三支試管收集：待黃綠色熒光走至離下端2cm處時，用第一支試管開始收集；當黃綠色熒光出現在洗脫液時，用第二支試管收集全部黃綠色熒光溶液，待黃色熒光溶液在流出層析柱口時，換用第三支試管收集，直至流出液黃色消失，則停止收集?！静僮鞣椒ā咳∫阎獫舛鹊目贵w蛋白溶液，用pH9.5，0. 5M 碳酸緩沖記錄收集管的OD495讀數與OD280讀數， 根據公式： 2.87OD495F / P = OD2800.35OD495 計算F/P值，并對該比值作一簡單分析。【結果判斷】【結果判斷

13、】熒光抗體的鑒定效價抗體效價可以用瓊脂雙擴散法進行滴定，效價大于1:16者較為理想。熒光素與蛋白質的結合比率熒光素與蛋白質結合比率（f/p）的測定和計算f/p值越高，說明抗體分子上結合的熒光素越多，反之則越少。一般用于固定標本的熒光抗體以f/p1.5為宜，用于活細胞染色的以f/p2.4為宜。 熒光抗體的鑒定抗體工作濃度抗體工作濃度的確定方法類似ELISA間接法中酶標抗體的滴定。將熒光抗體自1:41:256倍比稀釋，對切片標本作熒光抗體染色。以能清晰顯示特異熒光、且非特異染色弱的最高稀釋度為熒光抗體工作濃度。熒光抗體的保存應注意防止抗體失活和防止熒光猝滅。最好小量分裝，20凍存，這樣就可放置34

14、年。在4中一般也可存放12年。 抗體工作濃度【影響標記的因素】溫度: 溫度低則所需標記時間長，溫度高則標記時間短。在0-4 時標記體需攪拌6-12h,而在7-9 時攪拌4h即可, 20-251-2h，3730-45minpH 值: pH低時，標記較慢，pH值偏高（大于10），抗體易變性，pH值9.0-9.5最為適宜，在弱堿性條件下FITC易溶解，同時免疫球蛋白的羧基容易暴露，便于兩者結合。反應液中熒光試劑和免疫球蛋白的比例: 抗體蛋白含量低，標記慢，以每毫升含20-25mg蛋白為宜?！居绊憳擞浀囊蛩亍俊咀⒁馐马棥?嚴格掌握整個反應體系中的抗體蛋白含量，可提高標記效率。裝柱及上樣操作參照實驗一。

15、最后洗脫時應注意掌握洗脫速度及每管收集量?！咀⒁馐马棥?嚴格掌握整個反應體系中的抗體蛋白含量，可提高標光源：高壓汞燈、氙燈、鹵素燈濾板：隔熱濾板、激光濾板（UG、BG）、吸收濾板（OG、GG）光路：透射光、落射光熒光顯微鏡光源：高壓汞燈、氙燈、鹵素燈熒光顯微鏡熒光免疫標記技術課件間接免疫熒光檢測自身抗核抗體間接免疫熒光檢測自身抗核抗體熒光免疫標記技術課件FALS SensorLaser前向角散射光（FSC）：反映細胞的大小熒光免疫顯微技術FALS SensorLaser前向角散射光（FSC）：反映FALS Sensor90LS SensorLaser側向角散射光（SSC）：反映細胞內的顆粒多少 熒光免疫顯微技術FALS Sensor90LS SensorLaser側向角雙色直接染色細胞熒光免疫顯微技術