1、有用哺乳動物細胞培育手冊有用哺乳動物細胞培育手冊細胞培育是指從體內組織取出細胞在體外模擬體內環境下,使其生長生殖,并維持其構造和功能的一種培育技術.細胞培育的培育物可以是單個細胞,也可以是細胞群.1、試驗室設計物污染和不受其它有害因素的影響。細胞培育室和設計原則是防止微生物污染和有害因素影響，要求工作環境清潔、空氣清爽，枯燥和無煙塵。細胞培育室的設計原則一般是無菌操作區設在室內較少走動的內側，常規操作和封閉培育于一室，而洗刷消毒在另一室。2、常用設施及設備大類。間放置凈化工作臺及二氧化碳培育箱、離心機、倒置顯微鏡等。緩沖間可放置電冰箱、冷藏器及消毒好的無菌物品等。常分析處理物洗刷消毒間：烤箱、

2、消毒鍋、蒸餾水處理器及酸缸等。分析間：顯微鏡、計算機及打印機等。3、培育器皿的三倍。器皿應選擇透亮度好、無毒、利于細胞粘附和生長的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。常用的器皿有下面幾種。500ml250ml100ml 等幾種。胞傳代培育的細胞要求瓶壁厚簿均勻，便于細胞貼壁生長和觀看，瓶口要200ml100ml50ml25ml10ml 等幾種。培育皿：用于開放式培育及其它用途。分直徑等幾種。吸管：常用的有長吸管和短吸管兩類，長吸管也稱刻度吸管。其吸管：常用的有長吸管和短吸管兩類，長吸管也稱刻度吸管。其改進后管上部有球型刻度稱改進吸管， 刻度吸管用于移動液體。 常用 1ml 和1

3、0ml 兩種。短吸管也叫滴管，分彎頭和直頭兩種。形態各樣，常用于細胞培育的離心管有大腹式尖底離心管和一般尖底離心管兩類。前者分別為 50ml30ml 、15ml ；后者則多為 10ml 和 5ml。其它：如三角燒瓶、燒杯、量筒、漏斗、注射器等。5、細胞培育目的與用途科學爭辯 :藥物爭辯開發與根底爭辯1. 藥物爭辯與開發藥篩選 :如化學合成藥物藥效爭辯 ,中藥有效成分篩選與鑒定等.滋病疫苗等 ),腫瘤疫苗 (多肽疫苗 )等.基因工程藥物爭辯與開發 :如干擾素爭辯與開發 ,細胞生長因子爭辯細胞工程藥物爭辯與開發 :生物活性多肽爭辯與開發 ,人參皂甙 ,紫杉醇等生物活性成分爭辯與開發 .單克隆抗體制

4、備 :包括診斷用單克隆抗體 ,治療用單克隆抗體 .根底爭辯藥物作用機理基因功能疾病發生氣理2, 生物制藥基因工程藥物生產 :如在臨床醫學中具有治療價值的一些細胞生長因子如干擾素 ,粒細胞生長因子 ,胸腺肽等 (3) 診斷用和藥用單克隆抗體生產(4) 細胞工程藥物生產 :生物細胞內的一些生物活性多肽 ,生物活性物質等細胞培育根本條件1,適宜的細胞培育基適宜的細胞培育基是體外細胞生長增殖的最重要的條件之一 ,培育基不僅供給細胞養分 和促使細胞生長增殖的根底物質 ,而且還供給培育細胞生長和生殖的生存環境 .2,優質血清目前,大多數合成培育基都需要添加血清 .血清是細胞培育液中最重要的成分之一 ,含有

5、細胞生長所需的多種生長因子及其它養分成分.3,無菌無毒細胞培育環境無菌無毒的操作環境和培育環境是保證細胞在體外培育成功的首要條 件.在體外培育 的細胞由于缺乏對微生物和有毒物的防范力量,一旦被微生物或有毒物質污染 ,或者自身代謝物質積存 ,可導致細胞中毒死亡 .因此,在體外培育細胞時 ,必需保持細胞生存環境無菌無毒 ,準時去除細胞代謝產物.4,恒定的細胞生長溫度維持培育細胞旺盛生長 ,必需有恒定適宜的溫度 .5,適宜的氣體環境氣體是哺乳動物細胞培育生存必需條件之一,所需氣體主要有氧氣和 二氧化碳. 細胞培育基種類與根本成分細胞培育基的種類很多 ,按其來源分為合成培育基和自然培育基 (目前使用的

6、培育基絕大局部是合成培育基),按其物質狀態分為干粉培育基和液體培育基兩類.干粉培育基需由試驗者 自己配制并滅菌,液體培育基由專業商家供給 ,用戶可直接使用,格外便利.每種細胞都有其適宜的培育基 ,合成培育基的主要成分有氨基酸氨基酸是組成蛋白質的根本單位 .不同種類的細胞對氨基酸的要求各異,但有幾種氨基酸細胞自身不能合成 ,必需依靠培育液供給 ,這幾種氨基酸稱為必需氨基酸 .其中谷氨酰胺是細胞合成核酸和蛋白質必需的氨基酸在缺少谷氨酰胺時 ,細胞生長不良而死亡 .因此,各種培育液中都有較大量的谷氨酰胺.但是,由于谷氨酰胺在溶液中很不穩定 ,應置于-20冰箱中保存,在使用前參加培育液內 .已含谷氨酰

7、胺的培育液在 4冰箱中儲存 2上時,還應重參加原來量的谷氨酰胺 .碳水化合物碳水化合物是細胞生長主要能量來源 ,其中有的是合成蛋白質和核酸無機鹽培育液中無機鹽的主要功能是幫助細胞維持滲透壓平衡.此外,通過供給鈉,鉀和鈣離子 ,幫助細胞調整細胞膜功能 .培育液的滲透壓是一個格外 320mOsm/kg.標準培育液的滲透壓在此范圍內波動 .特別留意:向培育液中參加其它物質有可能會明顯轉變培育液的滲透壓 ,特別是溶于強酸或強堿中的物質 .向培育液中添加 HEPES時需按以下方法調整鈉離子濃度 .緩沖系統大多數細胞所需 pH 在 7.2 - 7.4. 但是,細胞培育最適 pH細胞種類不同而不同 .成纖維

8、細胞寵愛較高 pH (7.4 - 7.7), 而傳代轉化細胞系則需要偏酸 pH (7.0 - 7.4). 由于多數培育液靠碳酸氫鈉 (NaHCO3)CO2 體系進展緩沖 ,因此,氣相中的 CO2 濃度應與培育液中碳酸氫鈉濃度相平衡.假設氣相或培育箱空氣中 CO25%,3NaHCO31.97g/L;CO210%,NaHCO3HEPES 是pH 7.2 - 7.4 范圍內具有較好的緩沖力量 ,但是格外昂貴,在高濃度時對一些細胞可能有毒 .HEPES(0.34g/L) 共用,以抵消因額外參加 HEPES 引起的滲透壓增加 .在這種培育條件下,細胞培育瓶的蓋子應擰緊 ,以防止培育液中所需的少量碳酸鹽散

9、入空氣中.大多數培育液中含有酚紅作為 pH 指示劑,酸性培育液呈橙黃色 ,堿性維生素在細胞培育中 ,盡管血清是維生素重要來源 , 但是很多培育基中添加了各種維生素以適合更多的細胞系生長 .其它成分在一些較為簡單的培育液中還包括其它一些成分.如在雜交瘤技術中常用的DMEM培育液,使用時還需要補加丙酮酸鈉和 2-巰基乙醇(2-Mercaptoethanol,2-Me).2-Me對細胞生長有很重要的作用 .有人認為它相當于胎牛血清 ,有直接刺激細胞增殖作用 .2-Me的活性局部是硫氫基 ,其中一個重要作用是使血清中含硫的化合物復原成谷胱甘肽,能誘導細胞的增殖,為非特異性的激活作用 .同時避開過氧化物

10、對培育細胞的損害 .另一個重要作用是促進分裂原的反響和DNA合成,增加植物凝集素(PHA)對淋巴細胞的轉化作用 ,已廣泛應用于雜交瘤技術 ,另外,也開頭用于一些難以培育的細胞.2-Me 是一種小分子復原劑 ,極易氧化.分子量為 78.13,純的Me1.110-1.120(Do20), 常用終濃度510-5M.0.1M0.5ml.液體培育基保存液體培育基應于 4冰箱避光保存 ,試驗前放入 37體培育基有效期為 12 個月.液體培育基中的 L-谷氨酰胺會隨著儲存時間的延長而漸漸分解 .假設細胞生長不良 ,可以再添加適量 L基保存:4冰箱避光保存 ,有效期 36血清細胞培育液中添加的血清有牛血清 ,

11、馬血清,人血清等 ,其中牛血清是最常用的血清 ,分為胎牛血清和生小牛血清 .胎牛血清是從母牛破腹取出小牛中分別出來的血清 ,如廠家能做到這一點 ,生小牛血清的質量與胎牛血清的質量相差不大 .如小牛誕生后已哺乳 ,從這種小牛中取出的血清中可使用的濃度都有可能影響細胞的生長 ,而不同批次的血清支持細胞生長的力量也不同 ,尤其是對克隆細胞的生長 ,某些批次血清可能含有毒性或抑制細胞生長的物質 .因此,在購置大量血清之前 ,必需對血清支持細胞生長力量進展檢測 ,然后再,然后大量購置質量好的同一批號的血清 ,并留意以下幾點:需要長期保存的血清必需儲存于 -20 - 70 低溫冰箱中.4冰箱中保存時間切勿

12、超過 110%,清在凍入低溫冰箱前 ,必需預留肯定體積空間 ,否則易發生污染或玻璃瓶凍裂.物,則可將血清參加培育液內一起過濾 ,切勿直接過濾血清 .瓶裝血清解凍需承受逐步解凍法 :-20 至 - 70 低溫冰箱中的血清放入 4冰箱中溶解 1程中需不斷輕輕搖擺均勻 (留神勿造成氣泡 ),使溫度與成分均一 ,削減沉淀20進入 37造成蛋白質凝集而消滅沉淀 .熱滅活是指 56, 30 分鐘加熱已完全解凍的血清 .加熱過程中須規章搖擺均勻 .此熱處理的目的是使血清中的補體成分 (complement) 滅活.除非必需,一般不建議作此熱處理 ,由于熱處理睬造成血清沉淀物顯著增多 ,肥大細胞和血小板釋放組

13、胺 , 增加吞噬作用 , 促進淋巴細胞和巨噬細胞發生化學趨化和活化 .切勿將血清在 37有效成分會破會而影響血清質量 .血清中的沉淀物絮狀物:主要是血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成,這些絮狀物不會影響血清本身的質量 .可用離心 3000rpm, 5 分鐘去除,也可不用處理. 顯微鏡下“小黑點“:經過熱處理過的血清 ,沉淀物的形成會顯著增多.有些沉淀物在顯微鏡下觀看象 “小黑點“,常誤認為血清受污染 .一般狀況下,此小黑點不會影響細胞生長 ,但假設疑心血清質量 ,則應馬上停頓使用,更換另一批號的血清 .細胞培育環境1,試驗室設計細胞培育是一種無菌操作技術 ,要求工作環境和條件必需保證

14、無微生物污染和不受 其它有害因素的影響 .細胞培育室和設計原則是防止微生物污染和有害因素影響 ,要求工作環境清潔 ,空氣清爽,枯燥和無煙塵.細胞培育室的設計原則一般是無菌操作區設在室內較少走動的內側,常規操作和封閉培育于一室,而洗刷消毒在另一室 .2,常用設施及設備超凈工作臺 :也稱凈化工作臺 ,分為側流式 ,直流式和外流式三大類.置凈化工作臺及二氧化碳培育箱 ,離心機,倒置顯微鏡等 .緩沖間可放置電冰箱,冷藏器及消毒好的無菌物品等 .操作間:一般培育箱 ,離心機,水浴鍋,定時鐘,一般天平及日常分析處理物洗刷消毒間 :烤箱,消毒鍋,蒸餾水處理器及酸缸等 .分析間:顯微鏡,計算機及打印機等 .3

15、,培育器皿常用細胞培育器皿有培育瓶 ,培育板,培育皿等 .常預備量是使用量的三倍.器 皿應選擇透亮度好 ,無毒,利于細胞粘附和生長的材料 ,常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品 .常用的器皿有下面幾種 .500ml,250ml, 100ml 等幾種.培育瓶:依據培育細胞種類要求不同培育瓶的形態各異,用于細胞傳代培育的細胞要求瓶壁厚簿均勻 ,便于細胞貼壁生長和觀看 ,瓶口要大小全都,口徑一般不小于 1cm,允許吸管伸入瓶內任何部位 ,規格有200ml,100ml,50ml,25ml,10ml 等幾種.培育皿:用于開放式培育及其它用途 .分直徑 30mm,60mm,120mm 等幾種.吸管

16、:常用的有長吸管和短吸管兩類 ,長吸管也稱刻度吸管 .其改進1ml10ml兩種.短吸管也叫滴管 ,分彎頭和直頭兩種 .離心管:離心管是細胞培育中使用最廣泛的器皿 ,依據用途不同形態各樣,常用于細胞培育的離心管有大腹式尖底離心管和一般尖底離心管 兩類.前者分別為 50ml,30ml,15ml; 后者則多為 10ml5ml.4,細胞培育溫度維持培育細胞旺盛生長 ,必需有恒定而適宜的溫度 .不同種類的細胞對培育溫度要求也不同 .人體細胞培育的標準溫度為 36.50.5,偏離這受力較對高溫強 ,溫度上升不超過 39時,細胞代謝與溫度成正比 ;人體細39-401 小時,即能受到肯定損傷 ,但仍有40-4

17、11 小時,細胞會普遍受到損傷 ,僅小半數有可能恢復;41-421可能;當溫度在 43以上 10時,對細胞代謝雖有影響 ,但并無損害作用 ;把細胞放入 25-35時,細胞仍能生存437長.細胞代謝隨溫度降低而減慢 .當溫度降至冰點以下時 ,細胞可因胞質結冰受損而死亡 .但是,假設向培育液中參加肯定量的冷凍保護劑 (二甲亞砜或甘油),可在深低溫下如 -80或-196(5,適宜的氣體環境氣體是哺乳動物細胞培育生存必需條件之一,所需氣體主要有氧氣和 二氧化碳 .氧氣參與三羧酸循環 ,產生供給細胞生長增殖的能量和合成細胞生長所需用的各種成分 .開放培育時一般把細胞置于 95%空氣加5%二氧化碳混合氣體

18、環境中 .二氧化碳既是細胞代謝產物 ,也是細胞生長生殖所需成分 ,它在細胞培育中的主要作用在于維持培育基的pH值.大多數細胞的適宜 pH 為7.2-7.4,偏離這一范圍對細胞培育將產生有害的影響.但細胞耐酸性比耐堿性大一些 ,在偏酸環境中更利于細胞生長 .但有一些細胞也寵愛偏堿環境中生長 ,如成纖維細胞最適合 pH7.4-7.6. 每種細胞都有其最適 pH細胞培育無菌操作根本技術無菌操作技術分為三個局部 :工作環境及外表的處理 ,細胞培育所用玻璃及塑料制品的處理及培育液與培育細胞的處理.工作環境的處理使用層流超凈工作臺是最經濟有效的手段 .超凈工作臺正常工作時 ,向下的氣流可阻擋外界空氣污染物

19、進入超凈臺.試驗前,無菌室及無菌操作臺用紫外燈照耀30-60 分鐘滅菌,用 70%酒精擦拭無菌操作臺面 ,并開啟無菌操作臺風機運轉 10 分鐘后,才可開頭實試驗物品帶出工作臺 .如需要連續進展下一個試驗 ,則用 70% 酒精擦拭無菌操作臺面 ,再讓無菌操作臺風機運轉 10 分鐘后,才可進展下一個試驗操作 .或吸管頭等可以臨時放置 ,其它試驗用品用完后應準時移出 ,以利氣體流通 .試驗用品要用 70% 酒精擦拭后才能帶入無菌操作臺內 .試驗操作應在操作臺中心無菌區域內進展 ,勿在邊緣非無菌區域操作 .蓋并握住瓶身 ,傾斜約 45角取用 ,盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放在臺面上 .工作人員應留意自身的安全

20、 ,必需穿戴試驗衣與手套后才進展試驗.對于來自人源性或病毒感染的細胞株應特別留神 ,并選擇適當等級的無菌DMSOTPA 等,并避開鋒利物品傷人等 .定期檢查以下工程 :CO2鋼瓶內的 CO2壓力;CO2培育箱內的 CO2濃度,溫度,及水盤是否有污染 ;無菌操作臺內氣流壓力是否正常 ,定期更換紫外燈管及 HEPA過濾器濾膜,預濾300小時/預濾網,3000小時/HEPA). 培育細胞生長過程:埋伏期指數增生期停滯期埋伏期(latentphase) 細胞接種后,先經過一個在培育液中呈懸浮狀態的懸浮期.此時,細胞質回縮 ,胞體呈圓球形.然后細胞貼附于載體外表 ,稱貼壁,懸浮期完畢. 細胞貼壁速度與細

21、胞種類, 培育基成分,載體的理化性質等親熱相關 .一般狀況下 , 原代培育細胞貼壁速度慢 ,可達10-24小時或更多, 而傳代細胞系貼壁速度快, 通常10-30分鐘即可貼壁.細胞貼壁后還需經過一個埋伏階段 ,才進入生長和增殖期 .原代培育細胞埋伏期長 ,約 24-96 小時或更長 , 連續細胞系和腫瘤細胞埋伏期短 ,僅需6-24小時.指數增生期 (logarithmic growth phase)這是細胞增殖最旺盛的階段 ,分裂相細胞增多.指數增生期細胞分裂相數量可作為判定細胞生長是否旺盛的一個重要標志.通常以細胞分裂相指 數(Mitoticindex,MI) 表示,即細胞群中每 1000個細

22、胞中的分裂相數 .一般細胞的分裂指數介于 0.1%-0.5%, 原代細胞分裂指數較低 ,而連續細胞和腫瘤細胞分裂相指數可高達 3%-5%.指數增生期的細胞活力最好時期 ,是進展各種試驗最正確時期 ,也是凍存細胞的最好時機 .在接種細胞數量適宜狀況下,指數增生期持續 3-5天后,隨著細胞數量不斷增多 ,生長空間削減,最終細胞相互接觸集合成片 .正常細胞相互接觸后能抑制細胞運動 ,這種現象稱接觸抑制現象(contactinhibition). 而惡性腫瘤細胞無接觸抑制現象 ,能(piled up).胞接觸集合成片后 ,雖然發生接觸抑制 ,但只要養分充分 ,細胞仍能進展增 殖分裂,因此細胞數仍舊在增

23、多 .但是,當細胞密度進一步增大 ,培育液中營胞分裂停頓 ,這種現象稱密度抑制現象 (Density Inhibition).停滯期(Stagnate phase)細胞數量到達飽和密度后 ,如不準時進展傳代 ,細胞就會停頓增殖 ,進(Plateau phase). 停滯期細胞雖不增殖,但仍有代謝活動 .如不進展分別傳代 ,細胞會因培育液中養分耗盡 ,pH會發生死亡 ,因此,應準時傳代 . 培育細胞根本形態 培育細胞隨貼附支持物外形不同而形態各異 ,最常見的是貼附于平面支持物細胞 .在一般光鏡下生存中的細胞是均質而透亮的 ,構造不明顯 .細胞在生長期常有 1-2粒,脫滴和腔泡等,說明細胞代謝不良

24、 . 體外培育細胞依據它們在培育器皿是否能貼附于支持物上生長特征 ,可分為貼附型生長和懸浮型生長兩大類 .貼附型細胞在培育時能貼附在支持物外表生長.如羊水細胞為貼附型細胞 ,常表現為成纖維型細胞和上皮細胞生長 .懸浮型細胞在培育中懸浮生長 .成纖維型細胞在培育中的細胞凡形態與成纖維細胞類似時,皆可稱之為成纖維細胞 .本型細胞由形態與體內成纖維細胞的形態相像而得名,細胞在支持物外表 呈梭形或不規章三角形生長 ,細胞中心有卵園形核 ,胞質向外伸出 2-3厘米個長短不同的突起 ,除真正的成纖維細胞外 ,凡由中胚層間質起源的組織細胞常呈本類形態生長 .上皮型細胞此類型細胞在培育器皿支持物上生長具有扁平

25、不規章多角形特征,細胞中心有園形核,細胞嚴密相連單層膜樣生長 .起源于內,外胚層細胞如皮膚,表皮衍生物,消化管上皮等組織細胞培育時 ,皆呈上皮型形態生長 .游走型細胞本型細胞在支持物上散在生長 ,一般不連成片 .細胞質經常伸出偽足或亦難和其它型細胞區分 .在肯定的條件下 ,由于細胞密度增大聯成片后 ,可呈類似多角型或成纖維細膩包形態 .常見于羊水細胞培育的早期 . 細胞培育所用玻璃及塑料制品的清洗與消毒清洗在組織細胞培育中 ,體外細胞對任何有害物質都格外敏感 .微生物產品附帶雜物 ,上次細胞殘留物及非養分成分的化學物質 ,均能影響培育細胞的生長.因此對使用玻璃器皿和重使用的培育器皿都要嚴格徹底

26、的清洗且要依據器皿的組成材料不同 ,選擇不同的清洗方法 .玻璃器皿的清洗組織細胞培育中 ,使用量最大的是玻璃器皿 ,故工作最最大的是玻璃器皿的清洗 .一般玻璃器皿的清洗包括浸泡 ,刷洗,浸酸和沖洗四個步驟 .清洗后的玻璃器皿不僅要求干凈透亮無油跡 ,而且不能殘留任何物質 .浸泡:初次使用和培育使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡,以使附著物軟化或被溶液掉 .的初次使用的玻璃器皿 ,在生產及運輸過程中 ,玻璃外表帶有大量的干固的灰塵 ,且玻璃外表常呈堿性及帶有一些對細胞有害的物質等.瓶使用前應先用自來水簡潔刷洗 ,然后用稀鹽酸液浸泡過夜,以中和其中的堿性物質 .再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過

27、的蛋白質,干固后不易洗掉,故用后要馬上浸入水中 ,且要求完全浸入,不能留有氣泡或浮在液面上 .刷洗:浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗滌劑刷洗,以除去器皿外表附著較牢的雜質 .刷洗要適度,過度會損害器皿外表光澤度 .浸酸:清潔液是由重鉻酸鉀 ,濃硫酸和蒸餾水按肯定比例配制而成 ,其處理過程稱為浸酸 .清潔液對玻璃器皿無腐蝕作用 ,而其強氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質 .清潔液去污力量很強 .是清洗過程中關鍵的一環 .浸泡時器皿要布滿清潔液 ,勿留氣泡或器皿露出清潔液面 .浸泡時間一般為過夜,不應少于 6三種: 重鉻酸鉀 (g) 濃硫酸(ml) 蒸餾水(ml) (A)63:1000:202200

28、 (B) 次強清洗液 120:200:1000 (C) 弱清潔液 100:100:100.清潔液配制時應留意安全 ,須穿戴耐酸手套和圍裙 ,并要保護好面部及身體然后漸漸加濃硫酸 .并不停的用玻璃棒攪拌 ,使產生的熱量揮發 ,配制溶液應選擇塑料制品 .配成后清潔液一般為棕紅色 .沖洗:玻璃器皿在使用后 ,刷洗及浸泡后都必需用水充分沖洗 .使之3-5膠塞的清洗細胞培育中所用的橡膠制品主要是瓶塞 .購置的瓶塞帶有大量滑石粉2% NaOH 或洗衣粉煮沸 10-20 分鐘,以除掉培育中的13010-20塑料制品的清洗塑料自制品現多是承受無毒并已經特別處理的包裝 ,翻開包裝即可用 ,2% NaOH5%鹽酸

29、溶液浸泡 30消毒細胞培育的最大危急是發生培育物的細菌 ,真菌和病毒等微生物的污染.污染主要是由于操作者的疏忽而引起 ,常見的緣由有操作間或四周空間的不潔,培育器皿和培育液消毒不合格或不徹底 .由于有關培育的每個環節的失誤均能導致培育失敗 ,故細胞培育的每個環節都應嚴格遵守操作常規防止發生污染 . 消毒方法分為三類 :物理滅菌法 (紫外線,濕熱,干烤,過濾等),化學滅菌法(各種化學消毒劑)和抗生素.氣中大局部細菌 ,培育室紫外線燈應距地面不超過 2.5 米,且消毒進物品不宜相互遮檔 ,照耀不到的地方起不到消毒作用 .紫外線可產生臭氧 ,污染空氣,法.溫熱消毒時 ,消毒物品不能裝得過滿 ,以防止

30、消毒器內氣體堵塞而千百作者不能離開工作崗位 ,要定時檢查壓力及安全 ,防止消毒及表皮意外大事發生.常用物品消毒壓力準時間 :培育液,平衡鹽溶液及其它需要滅菌的液體:121,15磅,20分鐘; 布類,玻璃制品,金屬器械等物品 :先 121, 15 磅, 20 分鐘,然后在烘箱中烘干; 玻璃瓶:干熱滅菌 170, 4 小時.70%1操作者的皮膚 , 操作臺外表及無菌室內的壁面處理 .后者則主要用器械的常用物品細胞培育基目前,市場上可供給干粉培育基和液體培育基 .干粉培育基需使用者自體培育基是由專業產家按標準規模化生產 ,不僅質量得到保證 ,而且使用格外便利.常用的培育基種類及其應用見下表 :培育基

31、種類 應用細胞RPMI-1640( 標準型) 主要用于懸浮細胞培育DMEM-DMEM-IMDMMcCoys 5AM199F10血清平衡鹽液體PBS(Phosphate-Buffered Sallines)DPBS(Dulbecco”s Phosphate-Buffered Sallines)成分 含量(g/L)0.10KCl 0.20KH2PO4 0.20MgCl2 6H2O 0.10NaCl 8.00Na2HPO4 7H2O 2.16Hanks” 平衡鹽溶液 (Hanks” Balanced Salt Solutions,HBSS)成分 含量(g/L)0.14KCl 0.40KH2PO4 0

32、.06MgCl2 6H2O 0.1011MgSO4 7H2O 0.10NaCl 8.00NaCO3 0.35Na2HPO4 0.048D-Glucose 1.00Phenol Red 0.01D-Hanks” 平衡鹽溶液 (D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS)成分 含量(g/L)KCl 0.40KH2PO4 0.06NaCl 8.00NaCO3 0.35Na2HPO4 0.048D-Glucose 1.00Phenol Red 0.01消化液:分別組織和分散細胞 .常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二鈉 (EDTA)(1)胰蛋白酶(簡稱胰酶)是一種黃白色

33、粉末 ,易潮解,應放置冷暗枯燥處保存.目前應用的胰蛋白酶主要來自牛或豬的胰腺.胰酶的主要作用是使細胞間的蛋白質水解 ,使細胞相互離散 .胰酶對細胞的分別作用與細胞的種類和細胞的特性有親熱關系 .一般來講,胰酶濃度大 ,作用溫度高 ,作用時間長 , 對細胞分別力量也大 ,但超過肯定的限度會損傷細胞 .胰酶溶液在 pH8.0,溫度為37時,作用力量最強.留意:鈣離子,鎂離子和血清蛋白的存在會降低胰酶活力.因此,胰酶溶液常用無 Ca2+,Mg2+ 的D-Hanks” 平衡鹽溶液配制成0.25%溶液.消化細胞時 ,參加一些血清或含血清的培育液 ,或胰蛋白酶抑制劑能終止胰蛋白酶對細胞的消化作用 .胰蛋白

34、酶溶液配制 :稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中 ,先用少許 D-Hanks(pH7.2D-Hanks4次日,先用濾紙粗濾 ,再進展過濾除菌 ,分裝入瓶中 ,低溫冰箱保存備用,常用濃度為 0.25% 或 0.125%.氫鈉溶液調 pH7.220失效.EDTA4Na 溶液EDTA低廉,使用便利 .常用工作液濃度為 0.02%. 通常與 0.25%1:1EDTAHanks干凈,因殘留的 EDTAEDTAD-HBSS平衡鹽溶液溶解后 ,高壓蒸汽滅菌 ,分裝成小瓶 ,室溫或 4冰箱保存 . 胰蛋EDTA 4Na 溶液(0.05%0.53mM EDTA 4Na) 4Na+1L D-HBSS.- 20冰箱中保存 .pHNaHCO3 溶液常用濃度為 7.5%.,4冰箱或pH10%CO2法調整.HEPES( 分子量 238.31)HEPES 使用終濃度一般為 10-50mM, 但通常配成 1M200ml蒸水溶解 47.6HEPES,1N NaOH 調整 pH7.5-8.0;裝小瓶,室溫或 4保存. 抗生素溶液酚紅:大多數培育液中使用酚紅作為 pHpH,性 pH