1、關于目的基因的制備 (3)第一張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月目的基因：決定生物的優良性狀、具有應用價 值或應用前景，并被用于構建物種新特性的基因。 結構基因：包括從5端mRNA轉錄位點開始到3端mRNA轉錄終止信號結束的全部功能單位。這些功能單位包括：轉錄啟動區、核糖體識別和結合區、編碼區（起始密碼，開讀框、終止密碼）、轉錄終止區。第二張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月1) 原核生物的基因組成操縱子（Operon）：功能密切相關的基因聚 集在一起，處于同一個轉錄啟動區的調控 之下，并具有相同的轉錄終止區.第三張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月啟動區：RNA聚合酶識別

2、、結合和開始轉錄的一段DNA序列。第四張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月SD序列：核糖體識別和結合的序列，通常位于起譯密碼子上游4-9bp處。序列特征為：AGGAGG, 它與核糖體核糖體16S rRNA的3序列3 UCCUCC 5互補配對，從而使核糖體與mRNA結合,啟動翻譯過程。第五張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月編碼區： 翻譯起始密碼（ATG）：位于SD序列后4-9bp 多肽鏈編碼區： 翻譯終止密碼（TAG，TGA,TAA）：某些基因后面只有一個終止密碼，某些基因后面有兩個終止密碼.第六張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月轉錄終止區終止子：原核生物基因在轉錄終止前的

3、一段提供 轉錄終止信號的DNA序列（Terminator）. 特點：回文結構，轉錄后可形成發夾狀的結 構，從而使聚合酶減慢或停止前進. a）不依賴于終止因子的終止子（簡單終止子） 含有寡聚T序列和一段富含GC的序列 b）依賴于終止因子（）的終止子. 不含寡聚T序列，回文結構不含富GC的序列終止因子：幫助RNA聚合酶識別終止信號的 輔助因子（Termination factor） 第七張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月 終止子發夾結構第八張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月2) 真核生物基因組成 真核生物基因組的一般特點 a）基因位于染色體上，基因之間存在較長 的非編碼區 b）一個

4、結構基因內有一個或多個非編碼的 間隔序列第九張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月轉錄啟動區：真核生物的三類RNA(rRNA, mRNA, tRNA)分別由RNA聚合酶I、II和III進行轉錄.它們啟動子的結構也不相同.編碼蛋白質的啟動子由RNA聚合酶II識別.第十張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月基因區：特點：a）無類似于原核基因中的核糖體識別區 b）含有不編碼的間隔序列轉錄終止區：含有高度保守序列AATAAA，該序列與mRNA轉錄后3端加poly（dA）尾有關第十一張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月3) 其它基因組的特點病毒（噬菌體）基因組的特點 a）編碼的基因位于DN

5、A或RNA上 b）以多順反子進行轉錄（SV40） c）部分基因重疊并含有內含子線粒體基因組的特點 a）DNA編碼的蛋白與能量代謝有關 b）以多順反子進行轉錄 c）無S.D序列 d）動物線粒體基因無內含子，某些植物線粒 體基因有內含子葉綠體基因組的特點 a）DNA編碼與光合作用有關的蛋白或酶 b）以多順反子進行轉錄 c）含有類似于原核基因組的啟動子和S.D序列第十二張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月2. 基因的特殊排列對于大多數基因來說，基因組中的基因一個接一個排列在DNA分子上，在基因之間存在長度不等的間隔區，但某些生物基因組中的基因存在重疊，重復，加倍和重排等現象第十三張，PPT共九

6、十七頁，創作于2022年6月1）基因重疊一個基因內包含另一個基因的現象 a）部分重疊 ：兩個基因的序列部分重疊 b）完全重疊：一個基因完全包含在另一個基因內第十四張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月2）重復基因在某些生物基因組中，某些基因存在多個拷貝的現象* 真核生物基因組中組蛋白基因第十五張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月3）加倍基因同一細胞中至少含有兩套完全或基本相同的基因* 高等生物含有兩倍以上的染色體* 細菌質粒DNA* 藍藻染色體第十六張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月4）基因重排在生物的發育過程中，同一基因簇中的基因在不同的細胞中的排列順序發生改變的現象.它與

7、細胞功能的分化及表達有關.* 藍藻細胞中的營養細胞和異形胞中的nif基因存在重排現象第十七張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月第二節 目的基因的制備1.目的基因的直接分離 1) 限制性核酸內切酶酶切分離：對于已知序列的DNA分子，根據DNA分子上的酶切位點進行切割，然后分離所需片斷。 2) 物理化學分離法：根據不同DNA或RNA分子特性的差異，采用密度梯度離心、分子雜交等方法將目的基因分離出來。第十八張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月 3) 免疫法分離編碼特異性蛋白基因：核糖體沿mRNA進行轉譯時產生多肽鏈，通過特異性抗體與核糖體mRNA多肽鏈復合體結合，然后分離純化抗體核糖體m

8、RNA多肽鏈復合體，獲得特定基因的mRNA。 4)酶促反轉錄分離特定基因：在反轉錄酶的作用下，合成雙鏈DNA，獲得一定大小的基因片斷。第十九張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月2. 原核生物基因組文庫的構建基因組文庫（Genomic library)：某種生物基因組的全部遺傳信息通過克隆載體儲存于某一受體菌的群體中，這個群體就稱為該生物基因組的文庫。 目的：a）分離有用的目的基因 b）保存某種生物的全部基因第二十張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月1) 原核生物基因組DNA的提取 染色體DNA 質粒DNA pUC載體系統：制備的基因組片段 100 kb *采用常規的基因組DNA的制

9、備方法 載體系統：制備的基因組片段200 k bp *采用常規的基因組DNA的制備方法 要求：制備的DNA的長度為100-200kb， 防止在制備過程中的機械斷裂第二十一張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月2) 基因組DNA的不完全酶切 根據實驗需要選擇合適的限制性內切酶 a) 四個識別位點限制酶出現的幾率: 1/256 b) 六個識別位點限制酶出現的幾率: 1/1024 分離目的酶切片段大小的確定 a) 克隆單個基因： 10 kb b) 克隆基因族：99% . 文庫理論克隆子數基因組總長片段平均長度 文庫實際克隆子數（） （） 片段平均長度 基因組的總長第二十四張，PPT共九十七頁，創

10、作于2022年6月基因組大小酶切片段大小文庫克隆子數的關系第二十五張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月3) 酶切片段與克隆載體連接酶切片段的分離與純化a）低熔點瓊脂糖回收目的片段b）試劑盒回收目的片段第二十六張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月酶切片段與克隆載體連接克隆載體的選擇 a）質粒載體可承載10 kb片段 b）載體可承載20 kb DNA片段 c）Cosmid 載體可承載10M bp * 染色體分帶技術將各個染色體分離 載體系統：制備的基因組片段200 k bp *采用常規的基因組DNA的制備方法第三十四張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月2) 真核基因組DNA一級文

11、庫的構建（YAC文庫） a) 染色體DNA的部分酶切 獲得平均長度為200-500 kb的DNA片段 *多切點限制性內切酶：EcoR I，BamH I 特點：有較多重疊克隆子 *稀切點限制性內切酶：Not I，Mlu I 特點：重疊克隆子較少第三十五張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月 b) 酶切片段與YAC克隆載體連接YAC克隆載體 pYAC4第三十六張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月C) 酶切片段與載體連接*第三十七張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月d)重組YAC載體轉化酵母球形體 1 g基因組DNA 500個轉化體 e) YAC文庫的篩選 1）探針雜交法：以特異性的

12、探針分子與 文庫的克隆子進行雜交 2）PCR篩選法：第三十八張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月f)YAC基因組文庫的保存活化菌體：將含重組載體的陽性克?。ˋB1380 菌株）劃線接種于AHC平板上，于30 oC培 養至長出1-3mm的紅色菌落。短期保存：parafilm膜將平板周圍封起來于4 oC 保存4-6周。長期保存：接種一個單獨的YAC克隆子于3 ml YPD培養基中，在30 oC搖床振蕩過夜，然 后加入1ml 80%的甘油，混勻后分裝于-80 oC保存。第三十九張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月3) 真核基因組亞文庫的構建（ DNA載體的文庫）轉導E.coli第四十張，

13、PPT共九十七頁，創作于2022年6月4. cDNA文庫的構建cDNA文庫：某種生物基因組轉錄的全部mRNA 經反轉錄產生的cDNA片段分別與克隆載體重組，儲存于某種受體菌中，該群體就稱該生物基因組的cDNA文庫(cDNA Library）.原理：將帶poly（A）的mRNA經酶促反應轉變為雙鏈DNA，再與原核載體連接.第四十一張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月1) 制備用于克隆cDNA的mRNAa)mRNA的制備 動物細胞mRNA的制備 植物細胞mRNA的制備b)mRNA的來源 選用mRNA含量高的組織材料，或通過藥物等 方法提高mRNA的含量c)mRNA完整性的檢測 * mRNA在

14、無細胞翻譯體系指導合成高分子量 蛋白質的能力(見下頁圖)第四十二張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月哺乳動物mRNA在紅細胞裂解液中翻譯SDSanalysis of proteins translated by cell-free translation system. Lane 1: protein marker; Lane 2,without mRNA; Lane 3 to 7: translation products of total mRNA from mammalian cells第四十三張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月* mRNA在無細胞體系中指導合成目的多肽的能

15、力。* mRNA分子的大小。哺乳動物mRNA長度為500- 8000 bp，大部分mRNA位于1.5-2.0kb之間。* 總mRNA指導合成cDNA第一鏈長分子的能力。第四十四張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月利用哺乳動物細胞提取的poly(A)+RNA合成cDNALane 1: -HindIII-EcoRI; Lane 2: the first chain of cDNA; Lane 3: the second chain of cDNA; Lane 4: -HindIII第四十五張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月d) mRNA在細胞中的豐度* 高豐度mRNA 目的mRNA在

16、細胞中的含量占細胞質總mRNA 量的50-90%, 該類mRNA在合成和克隆cDNA之 前不需進一步純化特定mRNA.* 低豐度mRNA 目的mRNA在細胞中的含量占細胞質總mRNA 量的0.5%以下.第四十六張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月2) mRNA的富集典型的哺乳動物細胞含有10 000-30 000種不同的mRNA分子,某些mRNA分子在細胞內的拷貝數很低甚至只有一個拷貝 mRNA的豐度與文庫克隆子數的關系 N= ln(1-P) ln(1-1/n) N:所需克隆數; P: 要求的概率; n:一種 mRNA在總mRNA中的相對比例第四十七張，PPT共九十七頁，創作于2022年

17、6月a) 按大小對mRNA進行分級分離* 通過瓊脂糖凝膠電泳分離大小不同的mRNA分 子，該方法的分離效果最好，但從凝膠中回 收的得率較低.* 蔗糖梯度離心：加入破壞RNA二級結構的變 性劑如氫氧化甲基汞等，再進行蔗糖梯度離 心以分離不同分子量的mRNA.第四十八張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月b) cDNA的分級分離 mRNA通過反轉錄形成cDNA，在插入到克隆載 體前，通過瓊脂糖凝膠電泳，將不同大小的 cDNA分子分離開來. 優點： * 避免了分離過程中mRNA被污染的RNA酶降解 * 增加了獲得全長cDNA克隆的概率 * 獲得更準確的分級分離效果（分子量）第四十九張，PPT共九

18、十七頁，創作于2022年6月c）多聚核糖體免疫學純化法* 使用抗體來純化合成目的多肽的多聚核糖體. 將正在合成的新生多肽鏈的多聚核糖體結合 到免疫親和柱（A蛋白-Sepharose柱）上，隨 后用EDTA將多聚核糖體解離下來，并通過 Oligo(dT)層析分離mRNA, 利用該方法可將目 的mRNA純化數千倍. 目的mRNA在細胞中的 含量可為數十拷貝.第五十張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月3) cDNA第一鏈的合成利用反轉錄酶合成cDNA的第一鏈第五十一張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月第五十二張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月4) cDNA第二鏈的合成a) 自身引

19、導合成法：單鏈cDNA的3端能夠形成 發夾狀的結構作為引物，在大腸桿菌聚合酶I Klenow或反轉錄酶的作用下，合成cDNA的第 二鏈.* 缺點：在以S1核酸酶切割cDNA的發夾狀結構 時，會導致對應于mRNA 5端的地方的序列 出現缺失和重排.第五十三張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月自身引導法合成雙鏈cDNA第五十四張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月第五十五張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月b) 置換合成法原理：以第一鏈合成產物cDNA：mRNA雜交體作為切口平移的模板，RNA酶H在雜交體的mRNA鏈上造成切口和缺口,產生一系列RNA引物，在大腸桿菌DNA聚合酶I

20、的作用下合成cDNA的第二鏈.優點：a）合成cDNA的效率高 b）直接利用第一鏈的反應產物，不純化 c）避免使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA第五十六張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月置換法合成cDNA的第二鏈第五十七張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月第五十八張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月c)引物-銜接頭法第五十九張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月第六十張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月5) 雙鏈cDNA分子的克隆a) 同聚物加尾法 利用小牛胸腺末端轉移酶在雙鏈cDNA和質粒 載體的3端都加上一個互補的同聚片段，通 過退火使兩個片段連接成重組質粒，再將

21、重 組質粒轉化受體細胞第六十一張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月同聚物加尾法克隆雙鏈cDNA第六十二張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月b) 接頭-銜接頭法第六十三張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月c) mRNA-cDNA克隆法方法：在mRNA反轉錄合成cDNA第一鏈后，將dA殘基加到mRNA：cDNA雜交體上，然后與帶dT尾的克隆載體連接，轉化受體細在宿主細胞內，mRNA被降解并代之以DNA.缺點：克隆的效率低（為雙鏈cDNA克隆的1/10）第六十四張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月6) cDNA文庫的篩選和鑒定核酸雜交: 是最常用、最可靠的方法之一.可 大規模

22、地分析文庫的克隆子 * 同源探針：至少含有所需cDNA克隆的一部 分確切序列.常用于以一個部分克隆分離cDNA 文庫中的全長克隆. * 部分同源探針：探針的序列與所要篩選的 cDNA克隆的序列相關但不相同.常用于克隆 家族基因.第六十五張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月b) 特異性免疫學檢測:在cDNA表達文庫中，目的基因的表達產物能與特異性抗體發生免疫學反應，通過酶學的方法加以檢測.c) cDNA克隆的同胞檢測:將cDNA文庫分成若干組含有10-100個克隆子的易于處理的cDNA文庫，對每組cDNA文庫進行檢測，當鑒定出陽性庫后再不斷將其分成更細的庫進行檢測，直到獲得陽性單克隆第六十

23、六張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月 第三節 目的基因的分離1. 目的基因的功能克隆1) 根據蛋白質氨基酸序列分離目的基因對于未知功能的蛋白質基因，其目的基因的分離可從蛋白質開始，通過蛋白質的分離純化、蛋白質氨基酸序列的測定、相對應的基因片斷序列的設計，制備PCR擴增引物或合成DNA探針，從總DNA中分離目的基因片斷。或根據特異性蛋白質制備特異性抗體，然后從表達文庫中篩選克隆子第六十七張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月從蛋白質到目的基因的分離第六十八張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月2) 功能互補克隆目的基因 從某一基因組中提取總DNA，經限制性內切酶不完全酶切后，與克

24、隆載體連接，轉化某一種與目的基因功能互補的缺陷型受體細胞。當含有目的基因片斷的重組質粒進入受體細胞后，細胞才能生長，從而很方便地將含目的基因的克隆子挑選出來。第六十九張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月2.序列克隆法分離目的基因1) 根據部分已知序列或同源序列分離目的基因 如果知道某個基因的一部分序列，或知道某基因的家族基因的序列，則可根據已知序列或家族基因高度保守的同源序列合成DNA探針，通過探針雜交技術，從DNA酶切片斷或克隆子中篩選所要克隆的目的基因片斷或克隆子。第七十張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月同源探針雜交克隆目的基因第七十一張，PPT共九十七頁，創作于2022年6

25、月2) 表達序列標簽法分離目的基因 利用基因序列中一段特異性的DNA片斷（100- 500bp)作為該基因與其它基因差異的標簽 （expressed sequence tag, EST)，然后以該標簽 作為獲得新基因的依據。第七十二張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月3) 基因表達系列分析法基本原理：一個基因轉錄的mRNA上一段9-10個堿基的核苷酸序列（sequence tag, ST, 序列標簽）代表一個特定的轉錄產物，它們能被識別位點為四個堿基的限制性核酸內切酶（anchoring enzyme, AE, 錨定酶）所切割。多個序列標簽通過酶切和酶連后成為雙標簽序列的多聯體，將多聯體

26、克隆到測序載體上。通過連續序列分析確定每個ST序列在轉錄產物中的拷貝數（頻率）。通過與Genebank序列比較，確定某一種ST序列是新的基因或是已克隆的基因。第七十三張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月基因表達系列分析法克隆分析目的基因第七十四張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月3. 雜交法分離目的基因1) 差別雜交法: 對于兩個不同生長狀態的細胞群體，目的基因在其中一個細胞群體中得到表達，而在另一個細胞群體中沒有表達，兩個細胞群體的mRNA存在明顯差異。利用可表達目的基因的mRNA構建cDNA文庫，分別與兩個細胞群體總mRNA反轉錄后制備的cDNA探針進行雜交，根據雜交結果的差異

27、，篩選陽性克隆子。第七十五張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月差別雜交法篩選含目的基因的陽性克隆子第七十六張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月2) 減法雜交分離目的基因減法雜交（subtractive hybridization)：又稱為扣除雜交或減數雜交。通過雜交技術除去兩種細胞群體中普遍存在的基因序列，使目的基因序列得到有效的富集。適合于目的基因拷貝數較低的基因的分離。第七十七張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月減數雜交分離目的基因第七十八張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月4. 差示分析法分離目的基因mRNA差異顯示: 根據真核生物mRNA帶有poly(dA)的結

28、構，合成poly(dT)MN引物與mRNA的3端互補，在反轉錄酶的作用下合成cDNAmRNA雜交分子。然后合成5隨機引物，通過PCR擴增獲得所有mRNA的cDNA分子。通過凝膠電泳檢測出差異的cDNA條帶。第七十九張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月差別顯示克隆目的基因第八十張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月5.功能結合法篩選目的基因 原理：在cDNA表達文庫中，目的基因表達產物能與其它反應底物（探針）結合，形成一種穩定的可明顯區別的特征，從而獲得含有目的基因的克隆子。第八十一張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月功能結合法篩選目的基因第八十二張，PPT共九十七頁，創作于20

29、22年6月6. DNA插入誘變分離目的基因 原理：將一段特定的DNA序列（標簽DNA)插入到植物某一基因內部或相鄰位置，誘導該基因突變并形成突變體，再以標簽DNA為探針從突變體基因組DNA文庫中分離突變基因片斷，再根據突變基因片斷制備探針，從野生型植株基因組中分離野生型目的基因。第八十三張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月轉座子標簽法分離目的基因第八十四張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月T-DNA標簽插入誘變分離目的基因第八十五張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月7. 基因定位克隆分離目的基因 原理：根據目的基因在基因組上的位置特性對其進行克隆。通過DNA連鎖分析、染色體缺

30、失等方法將目的基因或其突變體定位到染色體上。在目的基因的一側或兩側確定一條或一對緊密連鎖的RFLP分子標記。利用緊密連鎖的DNA分子標記序列作為探針，通過染色體步查等將含目的基因的克隆分離。對目的基因進行測序及相關分析。第八十六張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月基因定位克隆分離目的基因的條件構建含有大片斷DNA的基因組文庫。 YAC文庫 BAC(Bacterial artificial chromosome)文庫 TAC(Transformation-competent artificial chromosom)文庫與目的基因緊密連鎖的DNA分子標記，分子標記與目的基因的遺傳圖距在數百個kb之內。構建生物體基因組高密度RFLP或RAPD分子標記。第八十七張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月1) 染色體步查法分離目的基因第八十八張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月2) 染色體跳查分離目的基因第八十九張，PPT共九十七頁，創作于2022年6月8. 基