1、本科學(xué)生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）題目霍山石斛微衛(wèi)星引物的SDS的檢測(cè)與方法探討學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院專業(yè)生物科學(xué)學(xué)生姓名姚宗莉?qū)W號(hào)0810366指導(dǎo)教師王暉職稱副教授論文字?jǐn)?shù)5,375完成日期2011年3月25日目錄1摘要12引言13材料和方法2實(shí)驗(yàn)材料2試劑和儀器3試劑的配制3實(shí)驗(yàn)儀器3實(shí)驗(yàn)方法34結(jié)果與分析4實(shí)驗(yàn)結(jié)果4結(jié)果分析85討論86參考文獻(xiàn)107致謝信11霍山石斛微衛(wèi)星引物的SDS的檢測(cè)與方法探討姚宗莉，生命科學(xué)學(xué)院摘要：霍山石斛 (Dendrobium huoshanense)為蘭科石斛屬多年生草本植物，其干燥莖或鮮草可藥用。 為了篩選和檢測(cè)石斛屬不同種之間微衛(wèi)星的多態(tài)性，采用PCR 方法擴(kuò)增石

2、斛屬基因組上的微衛(wèi)星序列后，經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。采用銀染法對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，該方法具有靈敏度高，污染小，無毒害，條帶清晰等突出特點(diǎn)。 能有效地控制染色背景， 顯著提高檢測(cè)分辨率等。關(guān)鍵詞 ：霍山石斛；微衛(wèi)星； PCR;銀染；變性聚丙烯酰胺凝膠電泳Discussion onthe Dendrobium huoshanensemicrosatellite primer detected by SDSandmethodsYao zongli, College of Life SciencesAbstract: Dendrobium huoshanense of huoshan i

3、s one of Orchid Dendrobium0perennial herb.It sdry stems or fresh can use for medicinal.For screening and detection of Dendrobium of the different between the microsatellite polymorphism and PCR amplification of microsatellite sequencesin the Dendrobium in genome analysis is denaturing polyacrylamide

4、 gel electrophoresis. Using silver staining method for microsatellite loci were polymorphic detection, the method has the advantages of high sensitivity, small pollution, no poison, with clear characteristics.And can effectively control the staining background, and significantly improve the detectio

5、n resolution.Keywords: Dendrobiumhuoshanense， Microsatellite(SSR);PCR;silverstaining;SDS引言：霍山石斛 (Dendrobium huoshanense)為蘭科石斛屬多年生草本植物，其干燥莖（又名霍楓斗）或鮮草可藥用，具有抑制肝臟細(xì)胞中膽固醇合成，而且還具有抑癌活性，有利于防治心血管系統(tǒng)疾病和防癌抗癌作用，是常用的大宗藥材。霍山石斛（即米斛），由于其功效奇特，資源稀少，價(jià)格昂貴，素有“千金草”、“軟黃金”的美譽(yù)，目前國內(nèi)外市場(chǎng)上真正地霍山石斛基本上沒有，所存在的均是掛名“霍山石斛”的黃草石斛等常規(guī)類藥物。霍山

6、石斛是安徽道地藥材之一，其自然分布區(qū)相當(dāng)狹窄， 主產(chǎn)于安徽霍山縣， 一直處于瀕危狀態(tài)很難找到野生的霍山石斛。微衛(wèi)星 (microsatellites) 是以 1 個(gè) 6 個(gè)核苷酸為單位的多次串聯(lián)重復(fù)DNA序列 ,其中兩核苷酸的重復(fù)頻率最高。微衛(wèi)星又被稱為SSRs （simplesequencerepeats,簡(jiǎn)單序列重復(fù)）或STRs （shorttandemrepeats,短串聯(lián)重復(fù)序列）或STRP (short tandem repeat polmorphism,短串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性 ) 或 SSLP（simplesequence lengthpolymorphism ,簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性）

7、等。它具有數(shù)量多、分布廣（不僅存在于內(nèi)含子中 ,也存在于編碼區(qū)及染色體上的其它任一區(qū)域）,多態(tài)性豐富 ,個(gè)體專一性強(qiáng) ,分析操作簡(jiǎn)便、 快速 ,重復(fù)性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性好 ,呈孟德爾1式共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)。微衛(wèi)星PCR 擴(kuò)增后用聚丙烯酰胺凝膠電泳是現(xiàn)代分子生物學(xué)的常用方法 ,因?yàn)樗直媛矢?,可以分離只有 1 個(gè)堿基 bp 差別的不同 DNA 片段 ,廣泛應(yīng)用于 DNA 序列測(cè)定和短串聯(lián)重復(fù)序列 ( STR )等的研究。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后的 DNA 若不經(jīng)處理就觀察不到條帶，對(duì) PAGE 處理的方法中以同位素標(biāo)記、放射自顯影最為敏感， 溴化乙錠染色方法最簡(jiǎn)單， 但同位素放射性和強(qiáng)誘變劑溴化乙錠

8、對(duì)人體有毒害作用，處理繁瑣，需要特別設(shè)備和防護(hù)措施， 而且兩者的廢棄物會(huì)污染環(huán)境，難于處理。因此，本實(shí)驗(yàn)采用安全無毒而又敏感性好的銀染顯色法。中藥分子鑒定是近年來發(fā)展的從分子水平鑒定中藥的方法，能從DNA 水平反映中藥的遺傳特征， 具有準(zhǔn)確性高、 特異性強(qiáng)的特點(diǎn)， 不受季節(jié)、產(chǎn)地的影響。目前國內(nèi)外學(xué)者對(duì)霍山石斛的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理作用和臨床應(yīng)用上，霍山石斛在分子領(lǐng)域的研究還是比較少。近年來發(fā)展起來的分子標(biāo)記技術(shù)為品種鑒定開辟了廣闊的前景，SDS分析速度快、操作簡(jiǎn)單、試驗(yàn)費(fèi)用低而且可以在沒有任何遺傳背景的基礎(chǔ)上用于物種分類和品種鑒定研究。本試驗(yàn)首次采用 SDS技術(shù)對(duì)霍山石斛進(jìn)行分析，旨

9、在為霍山石斛分子鑒別提供依據(jù)。材料和方法2.1 材料表一：研究材料 的采集 :居群采樣個(gè)體數(shù)采樣部位采樣地點(diǎn)霍山石斛40葉片霍山縣太平畈鄉(xiāng)2銅皮石斛15葉片霍山縣太平畈鄉(xiāng)鐵皮石斛10葉片霍山縣太平畈鄉(xiāng)，湖北英山河南石斛25葉片霍山縣太平畈鄉(xiāng)，湖北英山扁黃草石斛5葉片霍山縣太平畈鄉(xiāng)，湖北英山鉤狀石斛6霍山縣太平畈鄉(xiāng)，湖北英山葉片2.2 試劑和儀器變性聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系為 15L，6ul的專用 loading buffer，DNA 樣品 3ul ，去離子水 3ul，然后在 PCR擴(kuò)增儀中 95溫度下變性 5min， 4 條件下保存。表二：變性聚丙烯酰胺膠的配制：試劑名稱

10、加入劑量Urea（尿素）31.2g40%acrylamide/bis16mlddh O2加至 80mlTEMED40ul，一般取 45ul攪拌，待完全溶解后，再加入 10%APS10%APS400ul,一般取 450ul固定液：100ml無水乙酸加純水至 1L.銀染液： 1g AgNO3 加純水至 1L.（使用前按照 1.5ML 甲醛 /1L染色液加入甲醛）顯影液： 30gNa2CO3加純水至 1L.（在使用前按照 1.5ML 甲醛 /1L 顯影液加入甲醛，加入硫代硫酸鈉使?jié)舛冗_(dá)到2mg/L,加0.2ml） .340%聚丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺（Acrylamide ）：雙丙烯酰胺（ Bis-a

11、crylamide）=19:1. 稱取丙烯酰胺 38g和雙丙烯酰胺 2g，加入雙蒸水，定容到100ml， 4C保存 .10mg/ml硫代硫酸鈉： 0.7848g五水硫代硫酸鈉加水定容至50ml，避光保存 .10%APS：1gAPS溶于 10ml水中 .10TBE Buffer ：Tris 108g，硼酸 55g， EDTA 9.3g ，加水定容至 1L.6loading buffer:溴酚藍(lán) 250mg，二甲苯氰250mg，甘油 30ml，定容至 100ml，然后按 1:9加入變性劑 .DNA 樣品， DNA Mark ,專用 loading buffer，無水乙醇，乙酸，疏水性硅烷，親水硅烷

12、，去離子水，瓊脂糖凝膠，石蠟油等.儀器變性檢測(cè)系統(tǒng)（ 374BR 3501）,電泳儀（ DYY-6C 型），電子天平（ HX202T ）,微量移液槍， PCR 擴(kuò)增儀，超純水器，凝膠成像系統(tǒng)等.2.3 試驗(yàn)方法1）清洗玻璃板取大、小玻璃板各兩塊，用蘸有單蒸水的脫脂棉單方向使勁擦洗玻璃板，再用干的脫脂棉將玻璃板擦干 .2）涂硅烷在涂硅烷以前，用蘸有無水乙醇的潔凈脫脂棉單方向使勁擦洗大、小玻璃板，用干的脫脂棉將玻璃板擦干，直至各玻璃板完全潔凈 .吸取 1ml疏水性硅烷滴加在大玻璃板上， 立即用脫脂棉稍用力把疏水性硅烷在大玻璃板上涂勻，然后單向輕輕地將之涂干 .將乙醇和乙酸的混合溶液 （其中 95%

13、乙醇 5%乙酸）和親水性硅烷以 1000:14的體積比（ 2ml：2ul）混勻制作親水性硅烷工作液，一塊小玻璃板各取1ml工作液。將1ml工作液滴加到小玻璃板上， 立即迅速用把親水性工作液在小玻璃板上涂勻、涂干 .用蘸有去離子水的干凈脫脂棉擦洗大玻璃板，然后用干凈的脫脂棉擦干玻璃上的水分，以備用 .用蘸有無水乙醇的干凈脫脂棉擦洗小玻璃板，然后用干凈的脫脂棉擦干玻璃上的水分，以備用 .3）裝板將小玻璃板清洗的一面同大玻璃板干凈的一面相對(duì)。4）上架用夾玻璃板的架子對(duì)齊并固定，裝入墊好海綿墊子的支架底座內(nèi)，固定。5）變性聚丙烯酰胺凝膠的配制及倒膠將配制好的膠液連續(xù)倒入兩玻璃板的夾縫中， 再將潔凈的梳

14、子插入膠液中，靜置 1-1.5小時(shí)。6）預(yù)電泳50 ，250V，預(yù)電泳 20分鐘。（ 7）上樣，正式電泳關(guān)電后15S打開蓋子，注射器沖洗點(diǎn)樣孔，4 l PCR 產(chǎn)物中加入4 lLoading Buffer 變性8l樣品點(diǎn)樣，點(diǎn) Mark 蓋上蓋子， 250V,電泳 5h。（ 8）固定小玻璃板經(jīng)單蒸水清洗后，使膠面朝上，再加入10%的乙酸固定的 20分鐘。（ 9）銀染5將固定液倒掉，用單蒸水清洗 3次，加入銀染液， 避光條件下，銀染 30分鐘。（ 10）顯影倒掉銀染液，用單蒸水清洗3次，加入顯影液，避光，一般5-10分鐘即可顯示出條帶。（ 11）固定當(dāng)條帶顯示清楚后，用 10%乙酸固定液，再次固

15、定，終止染色。在凝膠成像系統(tǒng)中拍照，保存。實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取幾種以下引物擴(kuò)增的樣本經(jīng)大量的 SDS凝膠電泳實(shí)驗(yàn) ，得到的圖譜如下：圖 1： Hs- 39引物聚丙烯酰胺凝膠電泳M1 、2：DNA Marker1-12泳道： 1-12號(hào)個(gè)體 PCR產(chǎn)物銀染結(jié)果6圖 2： Hs40引物聚丙烯酰胺凝膠電泳M1 ：DNA Marker1-12泳道： 1-12號(hào)個(gè)體 PCR產(chǎn)物銀染結(jié)果圖 3： Hs41引物聚丙烯酰胺凝膠電泳M1 、2、3：DNA Marker1-15泳道： 1-15號(hào)個(gè)體 PCR產(chǎn)物銀染結(jié)果7圖 4： Hs57引物聚丙烯酰胺凝膠電泳M1 、2：DNA Marker1-16泳道： 1-16號(hào)個(gè)體

16、 PCR產(chǎn)物銀染結(jié)果圖 5：Hs44引物聚丙烯酰胺凝膠電泳M1 、2：DNA Marker1-13泳道 : 1-13號(hào)個(gè)體 PCR產(chǎn)物銀染結(jié)果8圖 6：跨種擴(kuò)增 -41引物聚丙烯酰胺凝膠電泳M1 、2：DNA Marker1-3號(hào)泳道： 1-3號(hào)個(gè)體（霍山石斛） PCR產(chǎn)物銀染結(jié)果4-6號(hào)泳道： 4-6號(hào)個(gè)體（銅皮石斛） PCR產(chǎn)物銀染結(jié)果7-9號(hào)泳道： 7-9號(hào)個(gè)體（鐵皮石斛） PCR產(chǎn)物銀染結(jié)果結(jié)果與分析4.1結(jié)果Characteristics of five microsatellite loci isolated from Dendrobium huoshanense.表三：五個(gè)霍山石

17、斛微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物序列、重復(fù)單元、 退火溫度及等位基因的數(shù)量：LocusPrimer sequence (5-3)Repeat motifTa ( C)NAHs39*F:CACCGCTTGTCCATCAAACTTC(TC)26614R:CGCAATGGTTGAGCGTGTAAATHs40F:AAGATTGAGGCGATGTTGT(TC)20613R: ACTTGCTGGAATTTGTGGTHs41F: CAGGCGGCAGAGTTACAGAG) 26553R:GCCAAAGCAAAACAAAGTAGAGHs44F: ATGGCATAAAACCTCCCCG(CT)165549R: GAGCGGA

18、CAATCGCATCTAAGTHs57F: CCTTGAATTTGCATGGAGTT(TC)22522R: TTTTGGGGCATTTTGCTGTTNA is the number of alleles;Ta is the optimal annealing temperature.經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)該實(shí)驗(yàn)所取樣本，經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后，結(jié)果顯示條帶有兩種情況：兩條和一條帶，不單一，且許多不在一條水平線上4.2分析由結(jié)果顯示的條帶可以說明， 在所取的實(shí)驗(yàn)樣本中， 樣本有雜合子和純合子，并具有多態(tài)性。其中， 結(jié)果顯示兩條帶的是雜合子，結(jié)果顯示只有一條帶的為純合子。霍山石斛存在一定的種內(nèi)變異， 其變

19、異類型從形態(tài)上分化不明顯。 銅皮石斛，鐵皮石斛，扁黃草石斛， 鉤狀石斛與霍山石斛及河南石斛有較大差異。這些差異為研究霍山石斛遺傳多樣性、基因流動(dòng)、演化規(guī)律提供有利的工具。 這些差異可以為上述幾種石斛屬植物的遺傳多樣性、保護(hù)遺傳學(xué)、以及石斛屬植物之間親緣關(guān)系的研究提供參考依據(jù)。討論銀染檢測(cè)的方法安全且試驗(yàn)周期短,但從膠板的前期處理到最后的顯色,整個(gè)銀染檢測(cè)技術(shù)流程長(zhǎng),但因其靈敏度高，操作時(shí)間短，在實(shí)際操作中出現(xiàn)的一些問題常常會(huì)影響最終的檢測(cè)結(jié)果，而通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)影響銀染檢測(cè)效果的因素非常多 ,許多意想不到的因素都會(huì)影響最后的銀染效果, 導(dǎo)致帶型異常,難以統(tǒng)計(jì)。通過大量 的試驗(yàn) ,發(fā)現(xiàn)可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)

20、結(jié)果中條帶的顯示的主要有以下因素 ：5.1模板質(zhì)量模板定量不準(zhǔn)，抽提不純，4 存放時(shí)間過長(zhǎng) DNA 降解等都會(huì)影響PCR 的擴(kuò)增效果。本次試驗(yàn)所用DNA 樣品的提取結(jié)果較好，但是有的樣10品由于存放時(shí)間稍長(zhǎng)，至使有的條帶結(jié)果顯示不清晰。由此可見，模板的質(zhì)量也是影響結(jié)果的一個(gè)重要因素。5.2引物質(zhì)量設(shè)計(jì)引物時(shí)，要防止兩個(gè)引物的3端含有互補(bǔ)序列， 否則會(huì)發(fā)生退火，聚合酶就會(huì)把引物延伸到另一引物的末端而形成引物二聚體，可通過改變 MgCl 2 濃度使含量大大低于目的產(chǎn)物。 本次試驗(yàn)的引物設(shè)計(jì)由專業(yè)的公司完成，故質(zhì)量較好。5.3退火溫度提高退火溫度能有效減少非特異性帶，但若減少太多會(huì)影響PCR 產(chǎn)物量

21、，特異性帶將變暗。5.4玻璃板的處理每次電泳前都要對(duì)電泳裝置， 尤其是玻璃板徹底清洗。 依次用自來水、超純水、無水乙醇擦拭干凈，自然干燥。保證玻璃板上沒有其他污染物。否則，玻璃板上的一點(diǎn)臟污都會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的條帶顯示。另外玻璃板的平整程度很重要， 若玻璃板的邊緣有缺口， 在膠干燥的過程中會(huì)導(dǎo)致漏膠，解決辦法是不停地補(bǔ)膠。5.5試劑的存放過硫酸胺（ APS）在理論上應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配,也可于 4 避光條件下保存12 周。 TEMED在 4 避光保存。 10TBE 緩沖液濃度高 ,常溫下容易結(jié)晶,可以用 5TBE 代替 10TBE置于 4貯存。丙烯酰胺與甲雙丙烯酰胺在貯存過程中 ,因光或堿的催化 ,會(huì)慢慢

22、轉(zhuǎn)變成丙烯酸或雙丙烯酸 ,故應(yīng)經(jīng)常檢查丙烯酰胺溶液的 pH值是否小于 7.0為此 ,常將它裝入棕色瓶中 ,置于 411保存 ,新配制的溶液一般使用2個(gè)月。5.6點(diǎn)樣點(diǎn)樣之前要用醫(yī)用針管吹去點(diǎn)樣孔內(nèi)的雜質(zhì)，吹的時(shí)候針管盡量插到底部，重復(fù) 3 到 6 次即可，否則會(huì)導(dǎo)致帶型分散。另外點(diǎn)樣量應(yīng)適中，過多會(huì)導(dǎo)致條帶分散，過少會(huì)導(dǎo)致條帶不清晰。5.7銀染后凝膠不著色通常導(dǎo)致銀染后凝膠不著色的原因是硝酸銀失效。由于硝酸銀見光易分解 ,常被保存于棕色瓶中。 如果保存不當(dāng) ,會(huì)導(dǎo)致染色后膠背景偏黃,甚至不著色。因此要保證每次銀染前染色液新鮮配制，不可將染色液重復(fù)使用。染色后用去離子水漂洗的時(shí)間要嚴(yán)格控制在5-

23、10s，否則會(huì)使結(jié)果條帶顯示不清晰。電泳緩沖液重復(fù)使用次數(shù)過多，也會(huì)使結(jié)果條帶顯示不清晰，一般緩沖液最多可重復(fù)使用8次，就需要重新配制緩沖液。5.8染色后凝膠背景深1）整個(gè)銀染色過程應(yīng)采用不含雜質(zhì)的超純水或者是雙蒸水,以免影響擴(kuò)增信號(hào)的減弱 .2）嚴(yán)格控制顯色時(shí)間 ,做到長(zhǎng)短適中 ,顯色時(shí)間過長(zhǎng)或過短都會(huì)影響對(duì)最終結(jié)果的判定。3）電泳后,染色前冰乙酸的固定時(shí)間不應(yīng)過長(zhǎng)。雖然理論上可以過夜,但也會(huì)加深染色后凝膠的背景。4）顯色過程中硫代硫酸鈉起敏化作用,可以防止自由銀離子還原為金屬銀,否則會(huì)增加背景。5）顯色液溫度和顯色時(shí)搖床的搖動(dòng)速度直接影響著顯色反應(yīng)的速度。因此顯12色液應(yīng)控溫在 4 左右 ,搖動(dòng)不要太快,以方便控制顯色時(shí)間參考文獻(xiàn)：張志峰，史洪才，武堅(jiān)，簡(jiǎn)子健 . 微衛(wèi)星 DNA聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE ）銀染法的改良 . BIOTECHNOLOGY ， 2005,15（ 3） :51-53.張軍，武耀廷，郭旺珍等 . 棉花微衛(wèi)星標(biāo)記的 PAGE/ 銀染快速檢測(cè) J. 棉花學(xué)報(bào) , 2000,12(5):267-269.3 呂海航，鄭國萍 , 等 . 微衛(wèi)星電泳及銀染檢測(cè)中的常見問題分析及對(duì)策 J. Heilongjiang Animal S