1、熱帶魚類發育早期耳石日增量1 介紹我們對于海洋魚類早期的生態動力研究曾頻繁地被稱為密不可測的“黑箱”。然而，幸運的是，幾十年前Pannella發現海洋魚類的耳石記錄了年齡和每天的生長信息，這個發現給我們提供了一個有力的工具來揭開這個“黑箱”的謎底。在那之后越來越多的研究和技術進步，使得科學家們能從幼魚的耳石中獲取大量的精確的細小的早期生活史的信息。相比較于類似的無脊椎動物的研究，使用耳石微結構包含的大量有價值的信息是魚類種群研究中最大的優勢之一。個體的年齡信息能被用于研究幼魚分布狀況、補充動力、早期生長、出生率和死亡率以及更為熟知的具體年齡段的生長率。重要的是，個體的數據可以被擴展到群體和種群

2、的動力研究，包括特定的產卵種群和育苗場。理解其下的機制是最終預測重要商業魚種的世代強度的必要一步。生長率也可以被用于生物能量模型和檢測早期生活的關鍵事件。最終，對整個生活史的變化所做的生長和存活的研究可能為進一步研究特定生活史階段的優勢和進化提供基礎。在這一章節里，我首先列出了能從幼魚耳石獲得的個體早期生活史數據的普遍用途，包括耳石提供的線索里不同時空尺度的變化。之后，我展示了從幼魚耳石提取年齡和生長數據所需的技術原理和步驟。我具體地講述了獲取樣本、處理耳石用以分析、讀取增量信息以及分析數據的基礎方法。我也明確指出這個過程存在的固有問題和局限之處。通過這些基礎的步驟，有價值的年齡和生長信息能提

3、取出來用于不同的生態學研究中，包括不同生態環境中的熱帶幼魚，比如深海區、珊瑚礁、海草床和河口紅樹林邊緣區域。introduction+2.1+2.2+2.9(94-100,124)張慧敏P93-100：introduction4.在熱帶魚的早期階段每日的耳石增加展示：1.1基于歐托利的早期生活史特征耳石可以提供一組變量或早期生命歷史(ELH)特征的數據。幼蟲的年齡、出生日期、遠洋幼蟲期(PLD)、幼年期和沉降時間都涉及到在耳石軸上(表1)的耳石增量，在這段時間內任何時間點的相對日增長都可以通過觀察連續增量之間的寬度來獲得。在生長較快的時期，通常會有更多的物質沉積在耳石成巖上，類似于樹木年輪。在

4、個體或群體中某一特定階段的增量寬度的比較，提供了一種有關身體生長的相對尺度。此外，在體細胞生長和耳石生長之間的校準，可以提供從耳石耳石測量得到的真實體細胞生長的估計。演示了身體尺寸之間重要且一致的線性關系(例如:標準長度，SL)和耳石的大小和年齡是此類分析的前提條件(Campana 1990，格芬1992，Thorrold&野兔2002)。同樣重要的是要注意，當在一個個體中比較不同階段之間的增量寬度時，必須使用謹慎，因為耳石增量沉積的細節可能會隨著身體幾何(變化)、棲息地和食物來源的變化而發生變化。相對大小可以在一定的環境中測量，從耳石半徑到興趣日。然而，這一測量也必須謹慎，因為各種環境過程可

5、能會影響到體細胞生長的關系(例如，耳石巖性的生長關系。溫度，Mosegaard等1988年，食物水平，Baumann等2005年的)和耳石結石物質將繼續沉積，即使是在身體生長可以忽略的情況下。因此，這一分離的身體-耳石結石的增長可以使人們對身體的大小產生誤導(Mosegaard等人1988年，Reznick等人1989年，Reznick和1992年，morales-nin 2000)。值得注意的是，在自然條件下，這種“脫鉤”可能是很少的，對于年輕的魚來說，這種生長緩慢的小魚不太可能活到在野外采集的地步(民沃和莫賽德2002年)。無論如何，通過對不同年齡魚類的身體長度的測量，證實了在生長緩慢和快

6、速生長的魚類之間的相對大小的相對大小的估計。Searcy和海綿2000年)可以使耳石的大小成為一個有用的相對測量。生命的歷史變遷也可以記錄在耳石lith，除了每日的增加。定居是一種主要的過渡性事件，對幼年魚的生態研究具有十分明顯的意義。沉降(和相關的變形)可以用非常不同的方式記錄下來。對某些物種的解決，僅僅是縮小幼體增量的范圍(或反之亦然)的一個點。一個更寬的暗帶(或檢查)在一些物種的定居和變形過程中沉積。在其他更不尋常的物種中，比如藍頭瀨魚、海地雙筋膜，變形是長時間的，而魚被埋在沙子和珊瑚的碎石下，在這段時間里，一個寬帶被沉積在耳石上(維克多1983年;圖1).定居標志可能是漸進的或突然的，

7、通常是物種特有的，并且在當地的種群中可能會有變化。(威爾遜&McCormick 1997，1999)。某些物種的定居特征是次生生長中心(附屬原基)的形成。在這一卷的第7章中，Panfili等人在更詳細的討論中討論了原始的原始狀態(參見Geffen等人2002年的其他討論)，以及萊特等人(2002a)提供了其他特定物種的其他過渡事件的匯編。P95日常耳石增長圖1所示。用于獲得ELH特征的特征。(a)一種海狀的雙筋膜狀體（D背，V腹，A前，P后）(b)一種橫截面的盧特杰斯格里修斯射手座，和(c)一種斯特格斯圖的拉皮圖。中心原基(核心)，L=幼蟲增量，S=沉降，E=浮現，J=青少年增量，E=耳石邊緣

8、。以前用于區分魚種和魚類的不同的耳石形狀的差異。1993年，坎帕納和卡塞爾曼，Begg和布朗2000，2002年的)，但在更小的范圍內，關于耳石形態學(形狀)的數據可能對年輕的魚類的生態研究有幫助。最近研究了兩種熱帶魚，兩種兩棲類，一種，一種，一種是一種，一種是一種很有價值的，一種是一種很有價值的。13天)喂養歷史(Gagliano和2004年)。這是一個有前景的新研究途徑，與傳統的每日增量分析一起，可以為生態研究提供高分辨率的信息。表1：早期的生命歷史特征(LHT)可以通過閱讀帶有生態定義的幼魚的卵和耳石指標來獲得，這些指標用于測量幼蟲、定居期或后殖民時期的幼體特征。生活史定義測量尺寸幼蟲階

9、段收集時的幼蟲時代耳石原基和邊緣之間的增量出生日期產卵日或孵化日孵化的一天從收藏之日減去幼蟲年齡(以上)。根據物種的不同，需要考慮一個額外的時間來孵出時間(通常是2-4天)。遠洋幼蟲期(PLD)幼蟲在浮游生物中度過的天數;卵生卵(或從德生蛋中孵化)和沉降之間的時間沉積耳石的核心與邊緣之間的增加，或在耳石上的核心和明顯的標記之間的增加(沉降標記;請參見圖1)少年時代后沉降和變形的天數從沉降標記到耳石邊緣的增量定居日幼蟲的時間從浮游生物到本斯特島從收集日開始減少未成年人的年齡每天的增長相對增長率連續的耳石增量之間的距離與年輪相似，更多的物質通常是在生長較快的時期沉積一定時期的大小給定年齡的相對大小

10、從原始的原始到一定年齡的距離(在年齡上的輻射-年齡)通過耳石派生特性的主要優點是，變量同時被記錄下來，這樣事件就可以與年齡相關，重要的是，一個實際的日歷日期可以與特定的年齡、事件或個體魚的生長速率相關。此外，耳石lith是無細胞的，不受吸收。這允許對魚類早期生活中的事件進行歷史分析，例如潮汐周期與幼蟲的運輸之間的緊密耦合。每日老化對群體補充研究至關重要，旨在確定定居、招募和幼蟲運輸機制的模式。當產卵是未知的(經常遠洋物種的情況),可以確定使用源種群幼蟲年齡數據與水文和當前數據(野兔和考恩1991、1996、福勒et al . 2000年詹金斯等。2000年,印度教等。2002年,Govoni

11、et al . 2003年,Serafy et al . 2003年)。通過研究從這些棲息地收集的魚類的相對生長，可以比較不同的青年棲息地的作用和相對價值。相比耳石lith-derived早期生活史特征也可以在最初的幼蟲或定居者和幸存者的檢查模式選擇性死亡率。從個體收集的這些數據可以很好地解決變異性的問題，并為“基于個體的模型”(IBM)提供數據。這些相對較新的技術可以成為定義變量之間關系的有力手段，最終將通過揭示影響魚類早期生命歷史的重要的生態過程，從而提高我們對種群生態學的認識。Allain等人2003年)。1.2在早期生活史的特性變異：對耳石派生的早期生命歷史特征的研究經常涉及到超越對這

12、些特征的測量，這些特征在多個空間和時間尺度上表現出來。以下幾個例子說明了這些性狀的變化是如何影響我們對生態過程的研究的。1.2.1在早期生活史上的特點和地理上的差異在生態研究中，遠洋幼蟲的持續時間是具有并持續受到廣泛關注的ELH特征的列表。幼蟲需要發育成未成年人的時間，不僅在其生命史策略的進化過程中起著重要的作用，而且可能影響到種群在生態尺度上的連接性。在不同的分類中，魚類的數量有很大的不同，這可能會影響到種群在生態學上的相關程度(參見海綿類的研究，2002年的討論)。早期的工作是為了檢驗在不同地理尺度上的分類中(維克多1986、長尾谷等1989、威靈頓和維克多1989、維克多和威靈頓2000

13、、薩帕塔和赫倫2002)之間的差異。最近的研究已經對不同的魚種(舒曼和伯明漢1995，里吉諾斯和維克多2001，Taylor&地獄berg 2003)的基因關系進行了研究。1.2.2在早期的生命歷史特征中，紫杉的變異在不同的分類中，不同種類的紫杉的變異程度不同。特定的分類單元有相對不變的PLDs(例如:而另一些人則在PLD中表現出更廣泛的范圍(一些唇齒、小蝦、木蓋、刺頭肌);維克多1986，考恩1991，1994，1994，1994，1997，1997)。這種分類可以用來檢驗生態過程的作用，例如食物的可用性和水的溫度在較短的時間尺度上的作用。例如，在PLD中，在PLD的月群中，有一群人的變化很

14、明顯，在巴巴多斯島的“藍頭瀨魚”中，有更大的生長速度的魚有更短的PLDs(Searcy和海綿狀的2000)。較低的生長和較長的PLDs被歸因于食物供應的減少，以及在系統中移動的低鹽分的物理海洋特征(北巴西環;2000年，棉球和平卡，2004a)。在那里，水溫更有季節性變化(例如:佛羅里達的鑰匙)，在溫暖的月份里，t.雙筋膜狀體的沉降比在寒冷的月份里的沉降速度要高得多. 由于浮游生物的死亡率通常是高且大小的(階段持續時間假說:安德森1988年)，因此，生長和發育得更快并更快定居的幼蟲可能會有更高的生存率。例如，在巴拿馬的幼蟲生長中，不同物種的變異，在兩種pomacentrids(Wilson&M

15、eekan 2002，Meekan et al-2003)和一種acanthurid(Bergenius等2002年)的定居變化中占很大一部分。1.2.3群內變異在生長和PLD等特征中，可以用來探索早期存活率的動態變化。同一隊列時間的重復收集(例如:“cohort-tracking”)允許幸存者的特征的比較(最近)收集與解決人口(最早收集)檢查是否生存與早期生活史特征如幼蟲或青少年增長或幼蟲期的持續時間。在這本書的第六章中，Vigliola和米坎更詳細地探討了這種方法。2途徑方法2.1樣本大小理解ELH性狀的不同尺度是設計基于耳石的研究的先決條件，以確保收集足夠的樣本(個體魚)以供耳石解釋，以

16、回答主要的問題。需要足夠的數量來準確估計一個特定地區的物種的平均價值，而比較研究的抽樣設計必須仔細計劃，以包含其他的變異尺度。例如，如果計劃進行地理分析，不同地區不同月份的樣本收集可能會帶來季節性差異，而不是地理位置。此外，取樣必須將已知的困難與耳石耳石處理和解釋(更詳細地討論)加以考慮。Cohort-tracking研究早期生活史特征的分布如何變化隨著時間的樣本過多的個人認為必須從同一隊列,因為特定的群組成員只能決定耳石老化完成后,通常導致消除每個樣本的一部分。對幼魚的任何研究都需要足夠的幼蟲、定居者或新老的新成員。了解該物種的自然歷史，包括它的棲息地，以確保該物種的供應，這顯然是有幫助的。

17、2.2樣本收集幼蟲和年輕的新蟲可以通過一些取樣技術來收集。幼齡幼蟲通常是通過拖曳各種類型的網來收集，從中到大容器。網開和網的尺寸越小，網被拖得越慢大的、年長的幼蟲能夠躲避取樣裝置的可能性越大。必須用大開口和大網孔的網來收集年長的幼蟲(大于1平方米的開口和1毫米的網孔)。這些更大的網可以而且應該被更快地拖拽，以增加收集活動的年老幼蟲的可能性，盡管快速的拖拽也可能會通過網絡增加幼蟲的擠壓，從而導致無法識別的損壞的標本。必須選擇兩種速度來平衡這些對立的約束，因為對幼蟲的準確識別是進一步分析的先決條件。圖中浮游動物采樣裝置的狀態包括多開和關閉環境采樣系統(模型;1 - 4平方米開放;0-3毫米網格)和

18、一個耦合的模擬系統，有兩個不同的網和網大小(guiget等2005)允許同時對幼蟲和它們的獵物進行取樣。這一裝置可以從離散的深度收集樣本，同時測量水道測量變量，但它必須從一個大型的專門的研究船中進行捕撈。模型已經成功地在各種熱帶和亞熱帶地區(如:巴巴多斯、考恩和卡斯特羅1994年、巴黎和考恩2004年;佛羅里達海峽，2008年的佛羅里達海峽)，盡管運營大型研究船的高昂費用使他們的使用有所限制?？焖贅悠匪p可能限制熱帶水域的拖帶時間(25攝氏度)，但一個解決方案是在檢索時立即對樣品進行冰敷。一個不那么技術性的，但仍然有效的，從較小的容器中收集垂直的離散樣本的網，是標準的開放閉合塔克拖網(見Pep

19、in和剪切1997年的塔克拖網和bongo網)。晚期，或定居階段幼蟲經常被幼蟲的光阱所攻擊。這些陷阱被立即部署在珊瑚礁的近海處，以便在它們返回珊瑚礁定居時攔截它們。無數的設計都在不同的地理環境中使用(多爾蒂1987、Brogan 1994、海綿、1996a、b、Brogan等2001年、威爾遜和米坎2002)，所有這些都是對特定物種的選擇性(多爾蒂1987)。此外，在水柱(Fisher&Bellwood 2002)中，還可以垂直放置光阱來評估幼蟲的垂直位置。渠道網(Shenker等人1993年)和頂蓋網(Shenker和Galzin 1993年，Shenker和McIlwain)可以有效地收集

20、通過珊瑚礁通道或在礁湖上的幼蟲，但需要特別的環境條件(強大的、單向的流動)來部署。幼蟲的錢包是一種笨重的，但通常是收集幼蟲的方法，尤其是老的“預定居”或后期的幼蟲(金斯福德和喬，1985年，Choat等人1993年)。年輕的新兵可以從底棲生物的棲息地收集(例如:礁、海地)通過發出槍或手網，或不使用諸如丁香油或奎寧之類的麻醉化學物質。顯然，對物種特有的棲息地的了解和對幼魚的行為的了解是很有幫助的。例如，最年輕的珊瑚礁定居者通常都是在巨石下或隱藏在巨藻中(例如:銷售等，1984年，1995年，日耳石增量，2008年)。對這些棲息地進行仔細的調查是必要的。年齡較大的新兵可以用手或用小手矛來捕魚，或用

21、小的長矛捕魚，或用底棲拖網捕魚。灘海是近岸、河口地區、包括海藻床等地收集青少年的一種常用技術。紅樹林支柱的取樣可能具有挑戰性，方法包括流行網(Hindell&Jenkins 2005)或使用麻醉化學藥品的手網。無論收集到的魚的方法是什么，都應該保存在超過75%的乙醇中。冷凍也是一種可接受的短期儲存標本的方法。一些研究人員已經成功地將干燥作為一種保存手段，但這可能是有風險的，其他的防腐劑應該在使用之前對耳石lith的影響進行測試，以用于重要的樣本。例如，使用某些防腐劑會損壞耳石liths(例如:甲醛或福爾馬林，是溫和的酸性物質)。2.3日沉積的驗證耳石是獲取短期或短期生態數據的寶貴工具，稚魚提供

22、的增量每天都是固定的。大多數珊瑚礁魚類耳石每天都有增加的量，盡管有一些案例存在每日沉積不明顯或不一致。使用耳石的第一步，因此，是驗證每日的增量的存在的存在。這個可以做直接涉及標記或喂養稚魚(Wright et al-2002b)或通過間接或統計技術的使用(morales-nin和Panfili2002a)。每天對許多物種的幼體或幼體的沉積率進行了驗證。不同的種群(見表2)。每日沉積速率的方法可以被驗證包括以下內容。1.化學標記。化學標記耳石與維護相結合在實驗室里用短時間標記魚(7-10天;圖2)來識別在魚的標記和犧牲時間之間形成的結構。耳石一般都是在24小時的化學浴中浸泡活魚或者注入高濃度的化

23、學物質?；瘜W物質由耳石很容易的吸收包括四環素，氧四環素，鈣素熒光素綠色，阿利扎林絡合素，氯化鍶(1988年，1990年，Geffen 1992年，威爾遜1995，見萊特等2000年的有效總結表化學濃度)。2。壓力標記這種方法包括在耳石中誘導一個非典型的標記通過將魚暴露在較高的溫度下，縮短了光腳，或者減少了食物，保持魚的額外天數，并比較增加的數量在壓力標記后存放的時間(請參閱賴特等2002b的評論)。耳石在實驗室條件下維護的魚的增量通常不會類似于在野外的魚的增量(圖2)，但是它的周期性沉積應該保持不變，允許驗證速率的增加。形成?；瘜W或壓力標記的魚類也可以被釋放到野外并被捕獲。這個方法會產生最自然

24、的增量，但是重新捕獲率可能很低?，F場圍場中有標記的個體的維護。戶外的中型生態系統是另一個選擇。3。集合在結算。收集到的晚期幼魚的定居沉降的過程允許對這些個體的耳石進行比較定居幼魚的耳石在晚期階段的到來后，收集了一小段時間。在稚魚后期。這種方法不僅驗證了幼魚的每日沉積量的增加也驗證了定居標志。(即:晚期幼魚不應該有這樣的標記）4。實驗室飼養。在實驗室里孵出一批卵，然后檢查幾天后，幼魚的耳石允許對其周期性進行驗證在幼魚生活的開始階段增加。稚魚期飼養多物種的困難使我們很難驗證周期性的周期性，盡管改進的飼養技術使這種方法越來越可行。5幼魚的連續場集。耳石的周期性增長能通過重新采樣一個水質量(包含一組幼

25、蟲)而建立。短周期(7天)和比較年齡和長度的頻率分布將收集的幼魚分為幾類。這個方法假設相同的隊列有被重新取樣時間，很少有新的魚進入水團，魚有一個恒定的，可預測死亡率。這種技術在具有大量水柱混合的環境，但可以應用于某些場合環境中沒有取得很好的效果，但是可以在特定環境中應用以及對幼魚的定居。計算增長率的比較。通過長期頻率的差異可以與生長速率進行比較從耳石增量的解釋分析(尺寸大小)計算，作為一種確證的方法。(如耳石增量解釋。1997年，morales-nin&醛)。圖2。銀紋笛每日沉積的確定新捕獲的幼魚被置于一個暴露與空氣的10 L鹽水玻璃池中。用200毫克/l alizarin的紅色濃度浸泡24小

26、時。由于阿利扎里紅的感光性，被保存在黑暗中。24小時后,魚被移走并放置在流動的海水罐中，直到14天后，他們被接受了，耳石也準備好觀察了。通過倒置的顯微鏡觀察到的耳石是用紫外線照射的在標準燈光下標記增量，然后再看用顯微鏡來列舉每一個增量的數目(黑線和白線放大后的盒子)超出了熒光標記(每個圖像中的白色箭頭)。它是在實驗室條件下維護的魚的常見情況是增加這與野生環境里的增量不相似但是對增量周期的驗證依然是可能的。邊際增量分析，經常用于驗證年度成魚的增量沉積，一般不適合每天驗證。增加的時間，考慮到時間的縮短和限制顯微鏡和觀察者解析(見r1984，詹金斯和戴維斯1990，高德納公司1991)。Campan

27、a(2001)提供了關于優缺點的詳細對比各種驗證技術。第二個需要對不同物種進行驗證的過程是第一次的時間增加沉積。第一次增量沉積的平均時間是足夠的有一些目的，但有必要驗證一下這個問題的答案更精確的問題，如:鑄造的拉瓦式運輸或產卵區。第一個增量通常是在孵化后的某個時間(Campana&Neilson 1985)，通常是在產卵后2-3天。被動漂移必須考慮到在估計成年產卵地點的早期階段。這類物種的幼魚的每日增量。產卵時間較長第一個增量沉積發生在仔魚孵化的過程中從在底部大量產卵的過程中，但這些卵通常不會在孵化之前就被漂走。2.4副增量每日沉積速率的驗證是有用的甚至是必要的對于區分副增量,例如，每天增加的

28、增量超過一次。這樣的標記在熱帶魚類中并不罕見，它們包含在讀數結果中對年齡的高估和對增長率的低估。副增量最常見的是顏色較淺，對比度也不明顯增量(如。藍頭瀨魚)，雖然每天的增量也可以出現在一些顏色較暗的條帶可能與每日的增加混淆(例如，梭魚)。將顯微鏡的放大率調整到增量的位置輕微的模糊可以幫助區分子日和每日的增量，因為子日當圖像變得模糊時，增量就會消失(圖3)。在明顯的情況下，增量可能很難區分每天的增量只有在某些地區的耳石。然而，值得注意的是，在這些地區子日增量應該在組中重復出現。它們一般不會單獨發生。此外，每天的增量應該是大約一半的寬度。臨近的每日增量，它們在這里變得明顯。副增量當魚很年輕的時候可

29、能是一個特別的問題因為它可能更難將子日和每日增量區分開來，而不需要多次增量相比之下，用顯微鏡的調整來解決差異是比較困難的當只有很少的增量時。以7-10標記和保持魚的確認天可以幫助解決哪些標記是每日的，哪些是子日的。主識別子日增量的原因是它們沒有被計算或度量。目前還沒有任何令人信服的理由來比較子日的具體模式熱帶魚的增量。2.5解剖和耳石的制備技巧從小魚類中提取耳石似乎是一項艱巨的任務，但是正確的工具和技術，實際上是一個相當簡單的過程。請注意所有的形態測量數據都應該在開始任何解剖之前得到，因為在解剖過程中，魚體會被破壞或破壞。例如,每個魚應該被分配一個樣品編號，重量(濕重)和適當的長度(標準、全或

30、叉長度)測量。耳石分離的細節準備取決于物種和生命階段的興趣。因此,以下是基于“案例研究”方法的技術討論所提出的技術應該易于應用于其他物種的多樣性。Secor等人(1992)提供了一種用于其他物種的技術的編譯。A在耳石石制備方面有價值的手冊(Secor等人1991)也可以在網上找到2.5.1仔魚大多數仔魚都是足夠小的，因為保存的不透明可以有效地進行將仔魚浸泡在中等粘度浸油中1-30天。那在偏振的情況下，對耳石的配對可以很容易的被觀察到顯微鏡放大后，身體是透明的(圖4)。在大多數情況下,仔魚有時可以通過身體直接在體內直接讀取帶有漂白劑或酶的果肉(Secor&Dean 1992，綠色等2002)并染

31、色使用Von Kossa染色法(綠色等2002)。但是，耳石應該從身體中移除并且所有的組織殘留物都被清除干凈。移除耳石的方法包括輕柔地撕裂組織，并用非常精細的鑷子或解剖或昆蟲針(盒子1)清洗組織可以通過用解剖或昆蟲針或靜電研磨的鎢針或用一種輕漂白劑溶液沖洗耳石。從子魚體中獲取和準備耳石的步驟從稚魚體中獲取和準備耳石的步驟從幼魚體中獲取耳石的步驟把嵌入式的耳石放在樹脂中準備解剖一些嵌入式的耳石的解剖耳石的打磨一些耳石表面太粗糙了，導致我們不解剖的話無法清楚地看到全部，還有一些耳石太小了，使我們解剖起來很困難。打磨光滑這些耳石的表面，無法解剖的耳石可以直接放在我們的指尖打磨，打磨時要用氧化鋁和摩擦

32、布重復地順時針和逆時針的摩擦。同樣，可以像在上面的章節中提到的那樣，把耳石的有某種結合劑的一面和擦亮的一面直接粘在一起，在指尖上的磨損和撕裂程度要低得多。這樣的話，我們就可以拿著一些耳石來打磨他們了。2.5.4耳石的日常增量的分析偶爾會受到光學顯微鏡的分辨率的限制。光學顯微鏡的分辨率通常只到0.25um,最多到0.5-1.0um.TEM(透射電子顯微鏡)和SEM（掃描電子顯微鏡）的使用能夠避免這一問題，達到很高的分辨率，可以清楚地看到一些細小的結構。在TEM和SEM下，樣品的數據處理是專門的，需要很高的實驗操作經驗，是十分昂貴的，然而，這也意味著，只有在光學顯微鏡無法使用，尺寸十分小時，獲取的

33、這些信息十分重要時，這些技術才會使用。盡管SEM在一些情況下已經得到了使用，但是TEM和SEM在稚魚的日齡測定中不會經常被使用。SEM更多的用來測以年為單位的年齡測量，然而，樣品的技術和準備在其他地方有更詳細的討論。后面是一些耳石的實驗數據。2.6讀取耳石的選擇在老化研究中使用的耳石的選擇依賴于這項研究物種，魚的相對年齡，傳統的或以前的其他研究者的使用，可用的時間，人力，和部門的設備。選擇將是顯而易見的對于一些物種，而對于另一些物種來說，使用一種耳石沒有明顯的優勢，例如，雙色雀鯛是非常大甚至是幼魚晚期，而整個拉皮都很小，很明顯只使用油浸式準備，可讀。選擇最簡單和最快的耳石為解釋作準備，極大地促

34、進了工作，并使之能夠進行檢查大量的個體。和以前的研究一樣，或者對同一物種的同一物種進行研究不同的地方選擇相同的耳石通常是明智的。如果沒有預先的經驗，初步的努力應該是探索他們的種間關系，輕松的準備和閱讀。一個耳石在發育的早期，可能會有一個持續的更少的增量一種耳石類型，或沉積速率在不同時期或轉變期間可能發生變化(如。黑爾和考恩1994)。一旦確定了這種關系，耳石應使用年齡和校正因素是有必要，只有一種耳石類型的數據，但是，在一個給定的研究中，應該用于最終的分析。大小和選擇“最佳”的耳石是為在表3中選擇的一種年輕的熱帶魚而提供的。在一對都應該是相似的，可以是隨機選擇增加解釋。偶爾，的一個耳石將會不正常

35、的形狀或以某種斷裂的方式進行精確的解讀妥協(圖8)。很明顯，這些不應該被使用，但是這對耳石的其他一個是正常的，可讀的。耳石研究的最初步驟應該是包括仔細檢查所有耳石以使讀者熟悉這個形狀，面向所有生命階段的所有耳石的方向和可讀性。標簽草圖在這個階段可以很有用。2.7 耳石增量的譯讀讀取耳石日增量的第一個必要工具是有一個好的顯微鏡，配備偏振濾光鏡和不同放大率的油鏡（25倍、40倍或100倍），使用的放大倍數取決于研究的物種和它們的耳石的大小。通常對整個耳石的測量，使用油鏡其效果會更佳，而對耳石某一部分的測量，使用油鏡與否都可以。選擇正確的放大倍數意味著要平衡能否清晰讀取耳石日增量和能否在一張圖像中看

36、到整條閱讀軸的平衡。放大率不能太高，太高會導致副日增量（sub-daily increments）無法與日增量區分開來；也不能太低，太低會導致耳石日增量不明顯。低的放大率有助于找到載玻片上的非常小的耳石并能獲取整個耳石的完整圖像。有時候不可能做到將整條需要讀取信息的軸放置到一張圖像里，意味著需要給耳石拍兩張圖片，兩次讀取信息，之后數據整合起來。有必要在每張圖片里標記坐標點以避免重復閱讀。Figure 8. 正常的和不正常的矢耳石，正常的和不正常的微耳石理想情況中，顯微鏡與一個相機連接在一起，相機與電腦中的圖像分析軟件相連。圖像分析軟件不僅提高了耳石年齡研究的準確性，也使得耳石細微增量的測量得以

37、實現，以便于研究魚體日增率。這項技術也加速了耳石信息讀取的過程。有研究表明，不用軟件人眼通過顯微鏡讀取信息只能獲得簡單的年齡信息，用目鏡測微計也可以，但這非常慢而且相當不精確。所以這研究充分論證圖像分析軟件的必要性。現在耳石年齡研究中使用的軟件有好幾種，包括 Image-Pro plus，還有OPTIMAS (BioScan, USA) 和免費軟件 NIH Image。2.7.1 顯微鏡和系統校準設置圖像分析軟件的第一步是很關鍵，就是將軟件的標尺與顯微鏡的每個物鏡校正，使其相匹配。標尺必須與實際將要被讀的圖像大小相匹配。如果圖像是從顯微鏡里捕獲的，它會被放大以供信息讀取之需。不論是通過宏來操作

38、或是手動操作，標尺必須標在放大了的那張圖像上。選擇一個錯誤的標尺將極大的放大錯誤，如果沒有正確的標尺，測量的結果無法用于比較，沒有用處。在很多圖像分析軟件中，可以很方便的保存測量或者標志設置（測徑器設置），不同的設置能被用于不同的耳石信息讀取。對不同類型的增量應該設置獨特的邊緣偵測（edge detectors）。邊緣標記可以加上不同的顏色和標簽使直觀可見。在一定的測徑器設置下，測量內容可以包括從耳石中心到每一條環紋的距離以及單獨兩條環紋之間的距離。測量的數據可以被輸出到電子表格中。2.7.2 宏現代軟件包含一體化的程序，使得耳石增量的譯讀和記錄保存更加容易。設計一個宏能夠極大的增加效率。宏可

39、以被編寫，用于自動重復操作步驟，比如說選擇和使用正確的標尺，捕獲從顯微鏡里看到的圖像并銳化，使用濾鏡或者其他圖像處理工具，標記耳石增量屬于仔魚期還是稚魚期，做基礎的測量，輸出數據到電子表格，然后生成帶耳石圖片和數據表格的報告。宏的內容因不同研究者、研究的物種以及軟件而非常具體，在這展示生成宏的操作指示不可行。Box 7提供了在Visual Basic里生成的一個短的宏的節選，可用用于Image-Pro Plus。說明了代碼如何包含以下指令：獲得耳石顯微圖像的預覽，捕獲圖像，放大圖像，選擇合適的標尺以及使用合適的測徑器設置。2.7.3 讀取耳石信息所有信息的讀取都必須在同一條軸上，通常是最長的那

40、條軸。從一而終是關鍵，不過，如果長軸不是最清楚的，可以選擇其他軸。對于很多物種來說，根據先前它們的讀法來決定哪一根軸是有用的。在研究中從一而終不僅能省時間，避免重復探索先人已經做過的方法，也能提高普遍的適用性和可比性。研究中可能會出現一些問題，取決于物種和生活史，下面列舉了三種問題。個體發育引發的耳石生長軸的改變。仔魚期的耳石增量可能在長軸，但是一旦變態發生，一個新的生長長軸可能出現。一個例子是加勒比海的綠鸚鯛。應該沿著不同的生長軸讀取信息，以便描述生長軸的變化。次生生長中心即副原基(primordium耳石中心)。通常發生在早期形態改變的時期，比如說變態和鲆鰈類眼睛移位。次生生長中心使耳石增

41、量的信息讀取復雜化。一旦新的生長中心形成，生長的增量將圍繞這些中心而不是最初的原基。讀取包含副原基的耳石通常需要將二十四分成多個部分閱讀。再一次的，從一而終的閱讀方法有利于比較。有次生生長中心的魚的例子有竹筴魚類（bluefish）、鲆鰈魚類等裂口。長軸會被一些裂痕切斷，從而耳石增量變得不清晰。在這種情況下最好繼續沿著長軸閱讀，并且根據相鄰的清晰的耳石增量插入標記。如果必要完整的讀取信息，可以沿著一條稍短的清晰的軸，而且這條標記的線段保留在圖片中以便真正沿著長軸讀耳石信息時可供參考。這種插補不能用在太多的個體上。如果長軸上裂痕頻繁出現，那么有必要選取一條新的通用的閱讀軸。讀取耳石信息包括顯微觀

42、察和圖像分析系統的使用。不停地改變焦點和偏振有助于解決難以閱讀的區域和觀察在電腦屏幕上顯示不清晰的部分，也有助于閱讀軸上耳石增量的譯讀。且不論耳石準備的細節和閱讀軸的選擇，大部分的信息讀取過程在8中列出來了。Box 8油鏡下耳石譯讀的基本步驟打開顯微鏡、相機和電腦，并打開圖像分析系統將玻片放置在載物臺上，調整位置，直到包圍耳石的油滴在正中央，將油鏡放低直至油滴頂部，并調整至耳石在查看電腦上的視野中央。查看電腦屏幕中的預覽，調整焦點、對比度、偏振和視野深度以及光線，直到環紋可視并在焦點上。獲取最好的圖像是關鍵，所以耐心和經驗是非常必要的。如果能行，那么錄制一個宏。拍下用于信息讀取的照片，然后銳化

43、。選用合適的測量標尺并做相關設置。使用線段功能line function，選取耳石的中心作為線段的起點，并把線段拉至耳石最長軸的邊緣。使用tick標記功能，開始標記增量。（可以在calliper setting里新建和標記不同類型的tick標記）在輸入輸出對話框里選擇Send data，把完整的信息讀取的數據輸出。*步驟5、6、7可錄制為宏。2.7.4 初始化階段以下三個客觀的看法可能在一個新物種的耳石信息讀取的初始階段會有所幫助。在讀取一個新物種或新的生活史階段的耳石信息，最開始的幾個耳石看起來很困難甚至不可能讀取。耳石信息的讀取要求堅持和耐心。堅持下去耳石會看起來更容易，因為讀者會對耳石的

44、特點越來越熟悉。插入幾天的時間來讀取年齡信息會使得這個過程輕松一些。耳石譯讀是一門科學，但是增量的確認和譯讀需要精準的判斷力和嚴苛的態度。譯讀一個物種的耳石要花一段時間，獲得經驗，才能準確地譯讀。在初試階段，對特殊耳石增量和傳統地標的譯讀方法可能會改變，所以在讀取可用數據之前確定下這種譯讀方法很重要。有效的一種方法是最初試著譯讀50-100個隨機樣品，然后丟棄這些數據從頭開始。2.7.5 盲讀“盲”意味著事先不知道魚體大小、采集時間或者任何其他能引起個人偏見的樣品背景細節。這會有難度卻很有必要多花一點點額外的精力。盲讀可以減少由于知道樣品信息而引起的下意識的偏差。2.7.6 多位讀者以及參考訓

45、練收集理想的情況是在一個項目里一個人全程負責耳石譯讀，那樣整個譯讀一致，減少由于多人譯讀的內部偏差。應該嘗試在一個給定的項目里控制譯讀耳石的人數，并且讓所有譯讀者一起訓練、一起譯讀耳石、一起試讀，然后再獨立地譯讀耳石樣品。讓譯讀者以盡可能相似的方式譯讀耳石是關鍵點，為每一個物種和生活史階段建立一系列參考耳石非常有用，有助于保持耳石譯讀的一致性。這些可供參考的耳石從已知年齡段的樣品里挑選出來，能被用于訓練新手和校驗新手和老手是否以相似的額方式譯讀。在一次研究中也能多次使用參考耳石。即使譯讀者之間譯讀結果高度一致，也建議每個人隨機地譯讀耳石，使譯讀結果不會與其他指標重疊一致，也就不至于使分析混亂。

46、最后，至少得有一部分耳石被所有譯讀者共同譯讀，用于確定譯讀者之間是否存在系統誤差。通過各種統計方法比較譯讀者間的誤差，終極目標是獲得最高質量的數據。Jones(2002)建議使用配對檢驗多個譯讀者讀取的耳石日增量的差異，甚至單個譯讀者的譯讀數據也可以用這種方法比較。準確的譯讀數據結果應該落在第一二次數據組成的矩陣的斜對角線上。減少譯讀者的誤差并為耳石譯讀建立標準是耳石分析中必不可少的部分，但是，最終，只有最客觀、最高質量的數據能被使用。2.7.7 重復譯讀以及可接受的錯誤范圍即使只是單一一個人來譯讀所有耳石也會有誤差，誤差與個人錯誤或者耳石特征有關。為了減少譯讀本身的誤差，對每個耳石重復譯讀很

47、有必要。多種技術被使用，這些方法隨著技術的進步也在改變。最普遍的方法是重復譯讀，知道譯讀結果之間的誤差小于一個可接受的最大水平，這個界線通常取決于數出來的耳石增量數目，問題本身也有影響。圖像分析軟件已經發展到一定階段，一個譯讀者譯讀過的耳石圖片能被保存，可用于之后被同一個人或者第二人檢查。使用這些圖像（不論有無標記增量）和軟件生成的報告，多個圖像（或盲讀的圖像）能直接地一對一比較。在每一個研究中，總有一些耳石要被丟棄，因為所有重復的譯讀結果的差異不一。保存這些耳石的記錄很重要，因為可能這些數據與某種環境壓力有關。2.7 耳石日增量譯讀2.7.1 顯微鏡和系統校準2.7.2 宏2.7.3 讀取耳石信息2.7.4 初始化階段2.7.5 盲讀2.7.6 多位讀者以及參考訓練收集2.7.7 重復譯讀以及可接受的錯誤范圍3 總結像許多優秀的生物學工具，耳石的年齡和日生長分析需要在先進技術中謹慎使用和訓練。在有價值的信息能從耳石中提取出來的前提下，付出是值得的。這一章里的方法、技術和局限證明，這些技術對普通科學家來說不應該是全部。除了時間投入和訓練，在設備（顯微鏡、圖像分析軟件和金剛石鋸片）上的投資也是必要的。另兩種投入對成功獲取和使用耳