1、孫素琴清華大學化學系復雜混合物紅外光譜分析的關鍵方法和技術中藥等復雜混合物質量控制的難題成分2成分1 成分復雜多樣，難以完全逐一分離并檢測指標成分不夠全面不能準確反映中藥藥效和質量難以鑒別藥材產地等多種屬性無法安全控制其他大多數成分檢測困難檢測方法復雜且檢測成本過高缺乏定性分析而導致定量錯誤人為添加可改變指標成分含量“先分離，后分析”的混合物分析路線一般分析過程中首先要從混合物中分離出相應的純組分，然而分離并不等同于分析。分離只是將混合物分解為不同部分，而各部分的結構和含量確定還需要多種分析方法相結合。對混合物進行分離，不可避免對原成分造成影響，分離所得物質與原始成分往往具有一定的差異。對混合

2、物進行分離，很難直接觀察到各種成分共存時的相互作用。對混合物進行分離并對所有組分逐一分析，需要消耗大量的時間、人力和物力?！跋确蛛x，后分析”的混合物分析路線實際過程中研究者們往往只關注所感興趣的一小部分分離產物，不能夠得到混合物整體成分信息。如果提取分離方法不恰當，就無法得到待測樣本中所含有的全部的目標成分，而且會在分離產物中混入其他雜質成分。如果對于分離產物沒有進行準確的定性分析，就可能將雜質成分與目標成分混淆在一起，影響定量分析的準確性。中藥成分信息的多維層次結構與合理分析原則全部成分部分成分單一成分主體成分少量成分微量成分定性信息定量信息宏觀整體樣本微觀局部樣本漸進式分析：從整體到部分，

3、先定性后定量有些信息只要粗略了解，有些信息必需細致分析中藥等復雜混合物質量控制的合理路線中藥整體定量部分定性全部成分，指紋圖譜特定成分，定性定量混合物分析：從整體到部分，層層深入整體：完整樣本，所有成分部分：局部樣本，特定成分兔子血管壁（可見圖像）紅外圖像(化學圖像)血管壁膽固醇結塊局部樣本紅外光譜(化學成分)蛋白質脂肪混合物分析：先定性后定量，準確無誤蛋白質N轉化為NH4+NH3三聚氰胺蛋白質含量分析三聚氰胺未知物定性: 是不是？定量: 有多少？為什么選擇紅外光譜？紅外光譜是一種無需標記的分析技術，在沒有先驗知識的情況下即可使用；既可以同時獲取混合物中整體成分信息，又可以對特定成分進行有針對

4、性的檢測。隨著計算機與化學計量學技術的發展，紅外光譜不僅可以對混合物成分進行詳細的定性分析，還可以對特定成分進行相當準確的定量分析。紅外光譜既可以對較大尺寸的混合物樣品進行分析，也可以借助顯微鏡對納克級的微小樣品進行檢測，還可以研究宏觀樣本中微米級的局部區域。豐富靈活的采樣技術使各種形態樣品的紅外光譜測試都可以做到簡便、快速、無損，儀器通用，成本低廉，環境友好。紅外光譜適合與其它分析技術聯用，獲得全面的樣品信息。“不分離，即分析”的混合物分析路線簡化步驟而節約時間和成本得到樣本全部成分整體信息獲取各種成分相互作用信息避免指標成分分析種種弊端“邊分離，邊分析”的混合物分析路線要對混合物進行全面準

5、確的分析研究，應該遵循“從整體到部分，先定性后定量”的路線原則，在紅外光譜的指導下，對混合物進行逐步分離與分析。紅外光譜可以提供混合物整體成分信息，指導進一步的分離分析；紅外光譜可以監督各步分離產物的成分，檢查分離方法的合理性，揀選含有目標成分的分離產物；紅外光譜可以用于解析和確認各種分離組分的結構“邊組合，邊分析”的混合物分析路線對混合物進行分析研究，了解其構成與性質的聯系，能夠為得到具有更優異性質的混合物提供指導。在混合物組合過程中，紅外光譜可檢查原料的正確性及其純度，避免錯誤原料和過量雜質的引入；可監控組合過程，及時發現組合過程中出現的異常，為過程工藝的優化提供信息；可對中間產物進行快速

6、分析，避免不合格產物進入下一環節而導致不必要的損失；可對最終產物進行定性定量分析，檢查其是否合乎相應的要求?；旌衔锏募t外光譜純化合物多組分混合物混合物光譜成分A光譜成分B光譜成分C光譜定量分析混合物紅外光譜可以提供的信息定性分析整體樣本/局部區域整體成分特定成分混合物紅外光譜解析的三大難題根源：成分復雜，譜圖重疊樣本分辨難如何獲得優質譜圖如何提高分辨能力如何增加信息表達成分解析難如何解析主體成分如何解析特定成分如何解析相對含量譜圖分析難如何智能化解析如何智能化鑒別如何智能化定量混合物紅外光譜宏觀指紋特征Wavenumber/cm-1Absorbance同種官能團吸收峰相鄰，重疊峰給出物質群組信

7、息鄰、間、對二甲苯混合物混合物紅外光譜宏觀指紋特征鄰二甲苯間二甲苯對二甲苯等體積混合物光譜加和Wavenumber/cm-1Absorbance混合物光譜包含各組分特征峰混合物紅外光譜宏觀指紋特征Wavenumber/cm-1Absorbance特征峰表現與濃度和重疊程度有關間二甲苯90% 間二甲苯50% 間二甲苯33% 間二甲苯5% 間二甲苯混合物紅外光譜宏觀指紋特征p-m-m-o-Wavenumber/cm-1Absorbance鄰、間、對二甲苯 1 ：1 ：1 2 ：1 ：1 1 ：1 ：2 1 ：2 ：1成分種類或含量不同，混合物光譜不同混合物紅外光譜解析方法多級紅外光譜宏觀指紋分析法

8、multilevel infrared spectral macro-fingerprints analysis使用多級光譜增強譜圖分辨能力根據特征譜峰進行相應組分解析借助統計方法實現客觀量化分析混合物紅外光譜解析的三大方法多級紅外光譜宏觀指紋分析法三級鑒別法傳統紅外光譜二階導數光譜二維相關光譜整體解析法主體成分解析特定成分解析相對含量比較專家識別法光譜數據庫檢索相似度量化比較多組分定量分析紅外光譜三級鑒別法一級鑒別（the primary identification）普通紅外光譜Conventional Infrared Spectroscopy, conventional IR二級鑒別（

9、the secondary identification）二階導數紅外光譜Second Derivative Infrared Spectroscopy, SD-IR三級鑒別（the tertiary identification）二維相關紅外光譜Two-dimensional Correlation Infrared Spectroscopy, 2D-IRInfrared Spectral Tri-step Identification普通紅外光譜精密度，準確度，信噪比，分辨率Wavenumbers / cm-1AbsorbanceCO2和H2O干擾扣除1.00000.99970.99981

10、.00000.9998相關系數平均光譜標準差光譜重復性二階導數紅外光譜二階導數紅外光譜：葡萄糖/乙醇-水溶液FTIR12%乙醇20 g/L葡萄糖12%乙醇60 g/L葡萄糖12%乙醇100 g/L葡萄糖12%乙醇Wavenumbers / cm-1SDIRWavenumbers / cm-1二維相關紅外光譜OriginalDynamic2DCOS二維相關紅外光譜：葡萄糖/乙醇-水溶液108510441152110710851065104410249921152110710851044102499211071085104499212%vol乙醇-水20 g/L葡萄糖12%vol乙醇-水60 g/

11、L葡萄糖12%vol乙醇-水100 g/L葡萄糖12%vol乙醇-水真偽阿膠：第一級鑒別Wavenumbers / cm-1Absorbance東阿阿膠假阿膠真偽阿膠：第二級鑒別Wavenumbers / cm-12nd derivative 東阿阿膠假阿膠真偽阿膠：第三級鑒別假阿膠東阿阿膠v混合物紅外光譜解析的三大方法多級紅外光譜宏觀指紋分析法三級鑒別法傳統紅外光譜二階導數光譜二維相關光譜整體解析法主體成分解析特定成分解析相對含量比較專家識別法光譜數據庫檢索相似度量化比較多組分定量分析主體成分解析官能團分析脂肪蛋白質糖類 全脂奶粉（104）奶粉的紅外光譜中藥主體成分解析：蛋白質羚羊角麝香水蛭

12、相思子Wavenumbers / cm-1Absorbance中藥主體成分解析：蛋白質1639Wavenumbers / cm-12nd derivative羚羊角麝香水蛭相思子中藥主體成分解析：油脂火麻仁芥子萊菔子烏梅 Wavenumbers / cm-1Absorbance中藥主體成分解析：油脂火麻仁芥子萊菔子烏梅 285417472nd derivative / Wavenumbers / cm-1/特定成分解析標準品比較ABC乳糖Wavenumbers / cm-1Absorbance特定成分解析標準品比較乳糖樣品A樣品B樣品C峰位置/cm-1(閾值0.01A)352933823345

13、352433803343338029782934290129002901147014561436145614391457144014571440138313671359138113671359138213801341129612611341129612611342126013431260120211681142120211671143120111661143120211631143111610941083111610941083111610931116107110581034107110581035107110581036107010371019100498710199881020989989

14、915899875915898876915898876914898875778671631779631779631779632604566551605566551604552604551467445434468434469469對應峰個數39332520相同峰個數391875相關系數1.00000.91240.80980.6436特定成分解析標準品比較Wavenumber / cm-1Absorbance白鮮皮地骨皮桑葉銀杏葉草酸鈣中藥指標成分解析：黃連Wavenumbers / cm-1Absorbance黃連藥材鹽酸小檗堿中藥指標成分解析：黃連Wavenumbers / cm-12nd d

15、erivative黃連藥材鹽酸小檗堿中藥指標成分解析：淫羊藿Wavenumbers / cm-1Absorbancea.脫水淫羊藿素b.寶藿苷Ic.箭葉苷Bd.淫羊藿苷e.淫羊藿定Bf.淫羊藿定Cg.淫羊藿屬苷Ah.意卡瑞甙Ci.山奈酚j.槲皮素R=HR=CH3中藥指標成分解析：淫羊藿IRHPLCIRHPLC相對含量比較相對峰強度脂肪蛋白質糖類全脂奶粉低脂奶粉脫脂奶粉Wavenumbers / cm-1Absorbance相對含量比較相對峰強度鹿茸鹿角鹿角霜磷酸鈣Wavenumber / cm-1Absorbance混合物紅外光譜解析的三大方法多級紅外光譜宏觀指紋分析法三級鑒別法傳統紅外光譜二

16、階導數光譜二維相關光譜整體解析法主體成分解析特定成分解析相對含量比較專家識別法光譜數據庫檢索相似度量化比較多組分定量分析數據庫檢索純化合物數據庫五倍子藥材樣本在Sadtler譜庫中檢索結果數據庫檢索混合物數據庫unknown samplethe 1st hit模式識別-基本概念模式識別（Pattern Recognition）就是分類?？陀^存在可以觀察的事物，如果可根據一定規則進行相似性判別，都可稱之為模式。模式識別就是通過特定方法將樣本分成有實際意義的類別。模式識別是人工智能技術的分支，它試圖用計算機代替人工對各種模式進行描述、分類和決策，從中找出規律，達到識別事物的目的。原始數據（訓練集）

17、特征提取訓練與分類分類規則未知樣本分類結果方法的選擇光譜比對某一樣品與一系列參考光譜比較簡單，易操作單個樣品即可需要選擇各種“數學過濾器”降低制樣帶來的影響模式識別一組樣品進行比較方法靈敏至少需要5個樣品需要借助數學方法進行識別數據預處理原始量測數據同一樣本的不同性質不同樣本的同一性質X為m個樣本在n個變量處的測量值，比如測量m個樣本在n個波數處的吸光度值而得到的紅外光譜，也可以是m個樣本中n種成分的含量。數據預處理不同樣本的同一性質中心化自動調整值域調整數值歸一化模長歸一化權重調整相似性方向余弦相似性系數相關系數相似性越大樣本間越相像相似度量化相關系數相關系數產地相關系數產地相關系數產地1.

18、0000河南武陟0.9822河南武陟0.9738廣東0.9922河南武陟0.9821河南溫縣0.9733云南0.9898河南博愛0.9817河南溫縣0.9623山西太谷0.9890河南修武0.9815河南武陟0.9606河北安國0.9885河南溫縣0.9814河南武陟0.9605山西襄汾0.9877河南武陟0.9813河南沁陽0.9600山西汾陽0.9872河南沁陽0.9809河南武陟0.9578山西平遙0.9868河南孟縣0.9794山東單縣0.9544山西平遙0.9865河南武陟0.9793河北安國0.9516山西太谷0.9854河南溫縣0.9781山西平遙0.9422山東濟寧0.9842

19、河南溫縣0.9776陜西西安0.9402廣西0.9837河南溫縣0.9772廣東0.9214山西汾陽0.9830河南溫縣0.9765山西曲沃0.9101浙江東陽0.9825河南溫縣0.9762河北安國0.8881河北安國0.9824河南孟縣0.9754山西平遙0.8486山西平遙懷山藥不同產地山藥與對照品的相關系數（1590-1390cm-1）是不是相關系數比較相似度量化模式識別山藥基本原理單組份定量（單波長定量） 多組份定量（譜圖重疊，全譜定量）A = K C工作曲線法實例根據中藥配方顆粒的紅外光譜確定其中輔料含量不同糊精含量的丹參配方顆粒的紅外光譜圖a.0.0, b.9.97, c.20.

20、55, d.29.81, e.39.82, f.49.80, g.59.62, h.100%工作曲線法實例相對峰強度的計算峰強度的計算工作曲線法實例丹參配方顆粒糊精工作曲線法實例根據奶粉的紅外光譜確定其中乳糖含量決定系數奶粉奶粉+乳糖乳糖組分定量分析工作曲線糊精質量分數糊精峰高1021cm-1, A1藥材峰高1611cm-1, A2相對峰強度A1/A2相對峰強度對數lg(A1/A2)0.0%0.81010.93650.8650-0.063012.0%0.86580.77581.11600.047722.2%0.90690.64641.40310.147129.3%0.97240.63881.5

21、2220.182544.0%0.96830.47022.05930.313749.7%0.96960.43122.24870.351958.6%0.98190.36922.65940.4248基線起止2000-880cm-1相關系數R0.99110.9986白扁豆藥材糊精 多元線性回歸K矩陣與P矩陣主成分回歸偏最小二乘回歸多組分定量分析選擇標準樣品集：定標集、驗證集其他方法獲得參照值：HPLC、GC確定化學計量學的算法PCA 主成分分析（定性）PCR+ - 增強的主成分回歸PLS1 偏最小二乘法（單組分）PLS2 偏最小二乘法（多組分）選擇合適的光譜參數：范圍、預處理模型評價：R2、SEE、S

22、EPPage 64 模型評價定標集的決定系數R2判斷一個定標集模型的好壞定標標準差SEE 反映定標集數據點標準偏差預測標準差SEP給出一個獨立樣本在標準集中預測時所產生的誤差RSS = 殘差的平方和SYY = 總的方差組分定量分析多元校正1700-900cm-1SNV+De-trending二階導數R2=0.992SEE=0.001806SEP=0.00011311600-900cm-1SNV+De-trending二階導數R2=0.997SEE=0.000572SEP=0.0000879黃芩苷綠原酸雙黃連粉針劑指標成分定量分析分離提取過程丹參丹參藥材95%醇提殘渣95%醇提物95%醇提丹參酮

23、IIA分離提取過程丹參95%醇提物濾液沉淀（總酮）加水溶解分離提取過程丹參加水提取95%醇提殘渣水提物水提殘渣分離提取過程丹參加醇至70%95%醇提殘渣水提物濾液沉淀（多糖）水蘇糖丹酚酸B分離提取過程丹參乙酸乙酯萃取95%醇提殘渣水提物醇沉濾液水層酯層（總酸）丹參酮IIA水蘇糖丹酚酸B分離提取過程丹參分離提取過程甘草藥材水提10%醇提20%醇提90%醇提100%醇提甘草苷黃酮類成分增加糖類酸類成分減少分離提取過程甘草甘草藥材95%醇提物95%醇提殘渣分離提取過程甘草甘草藥材95%醇提物總黃酮甘草苷乙酸乙酯萃取分離提取過程甘草甘草藥材95%醇提殘渣10%醇提物10%醇提殘渣分離提取過程甘草10%醇提物60%醇沉沉淀60%醇沉濾液含糖醛酸（酯）的多糖分離提取過程甘草總皂苷10%醇提物60%醇沉濾液甘草酸銨加酸沉淀分離提取過程甘草甘草藥材殘渣皂苷黃酮多糖紅外光譜法用于中藥等混合物分析的三大特性快速、簡便、直接、無損、全面一次性儀器購置一次性樣品測試一次性譜圖分析一次性真實性無預處理存原本性反映全部成分信息跟蹤組分變化規律可控性同樣本重復性儀器間重現性操作者一致性紅外光譜相對于色譜的優勢儀器重現性同一個樣本在所有儀器上得到的紅外譜圖都是一致的，不受測試時間、地點以及操作人員等因素影響；對標準物質進