1、基因工程第三章第1頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二3.1.1 分子雜交與印漬技術(shù)的原理 分子雜交：不同來源的單鏈核酸（DNA或RNA），只要它們具有大致相同的堿基序列，經(jīng)過退火處理，就能重新形成雜種雙螺旋，這一現(xiàn)象稱為分子雜交（molecular hybridization）。 3.1分子雜交與印漬技術(shù)第2頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二0復(fù)性RNADNA第3頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二利用這一原理，就可以使用已知序列的單鏈核酸片段作為探針，去查找各種不同來源的基因組DNA分子中的同源基因或同源序列。 第4頁，共67頁

2、，2022年，5月20日，12點6分，星期二印漬技術(shù)： Blotting印漬技術(shù)的原理首先由Edwen Southern在1975年提出。第5頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二其基本操作過程是：將DNA片段在瓊脂糖凝膠中電泳分離后，置NaOH液中浸泡，從而將凝膠中的DNA變性為單鏈；然后將一張硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，上面放上大量吸水紙巾，利用吸水紙巾的毛細作用，將單鏈DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，再將膜置80烘干并使單鏈DNA分子固定在膜上，再用于分子雜交分析。第6頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二分子雜交實驗第7頁，共67頁，2022年，5月

3、20日，12點6分，星期二Southern Blotting第8頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用1、DNA印跡技術(shù) (Southern blotting) 用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。2、RNA印跡技術(shù) (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。3、蛋白質(zhì)的印跡分析 (Western blotting) 用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。 第9頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二三種印跡技術(shù)的比較第10頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二探針技術(shù)：將已知序列的核酸片段用放射

4、性同位素、生物素或熒光染料進行標記，然后用于分子雜交，雜交后通過放射自顯影、熒光檢測或顯色技術(shù)，使雜交區(qū)帶顯現(xiàn)出來。 第11頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二3.2 PCR技術(shù) PCR：聚合酶鏈式反應(yīng) （ Polymerase Chain Reaction），是指利用耐熱DNA聚合酶的反復(fù)作用，通過變性-復(fù)性-延伸的循環(huán)操作，在體外迅速將DNA模板擴增數(shù)百萬倍的一種操作技術(shù)。第12頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二PCR基本原理：變性-復(fù)性-延伸1變性：通常采用加熱變性，即將模板DNA或延伸后的雙鏈DNA加熱到940C，使雙螺旋DNA解開成為單鏈。2

5、復(fù)性：通過降低反應(yīng)溫度至500C- 650C ，使兩種引物能與兩條解開的DNA互補鏈的3端粘合，以提供DNA聚合酶催化聚合所需的3-OH。3延伸：將反應(yīng)溫度提高到約720C，在耐熱DNA聚合酶的催化下，根據(jù)模板DNA提供的堿基順序，合成兩條互補鏈，從而使模板DNA擴增一倍。第13頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二PCR技術(shù)特點1、高度的敏感性。2、高度的特異性。3、操作簡便快速。4、樣品適用廣泛。5、有一定程度的單核苷酸錯誤摻入。第14頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二引物 要擴增模板DNA，首先要設(shè)計兩條寡核苷酸引物，所謂引物，實際上就是兩段與待擴

6、增靶DNA序列互補的寡核苷酸片段，兩引物間距離決定擴增片段的長度；兩引物的5端決定擴增產(chǎn)物的兩個5末端位置。由此可見，引物是決定PCR擴增片段長度、位置和結(jié)果的關(guān)鍵，引物設(shè)計也就更為重要。第15頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二引物的設(shè)計：引物設(shè)計的必要條件是與引物互補的靶DNA序列必須是已知的，兩引物之間的序列未必清楚，這兩段已知序列一般為1821個堿基，可以用DNA合成儀合成與其對應(yīng)互補的二條引物。 第16頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二（1）引物長度：18-21bp （2）（G+C）%含量：引物的組成應(yīng)均勻，盡量避免含有相同的堿基多聚體。兩個

7、引物中（G+C）%含量一般以40%60%為佳。（3）引物的結(jié)構(gòu)：無明顯的次級結(jié)構(gòu)（4）引物之間：不應(yīng)發(fā)生互補 (5）引物3端配對精確和嚴格第17頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二引物引物3555基因組引物第18頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二PCR的反應(yīng)原理第19頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二PCR技術(shù)的基本過程TaqDNA聚合酶模板DNA dNTP 引物Buffer預(yù)變性模板DNA dNTP 引物Buffer循環(huán)儀94oC59455 72 第20頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二1、dNTP: PC

8、R常用的濃度為50200mol/L，不能低于1015mol/L。四種dNTP的濃度應(yīng)相同。2、 緩沖液：10 mM Tris.HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2。3、模板DNA：純度與含量。4、反應(yīng)參數(shù)。PCR的影響因素第21頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二（1） 變性-考慮酶的失活問題。一般為反應(yīng)開始時用95oC2- 5 min，在后續(xù)循環(huán)中設(shè)為94oC 30 s - 1 min;（2） 退火-退火溫度取決于引物的堿基組成、長度及引物與模板的匹配程度，一般在Tm 20-25oC左右；時間一般為30 s - 2 min；（3） 延伸溫

9、度一般為72oC；時間取決于待擴增片段的長度。在通常情況下，Taq酶的延伸速率約為2 kb/min，而pfu為1 kb/min 。（4） 在最后一個循環(huán)結(jié)束后，需再在72oC下延伸10 min，以產(chǎn)物完整。第22頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二 單、雙鏈DNA或RNA都可以作為PCR的樣品。若起始材料是RNA，須先通過逆轉(zhuǎn)錄得到第一條cDNA。 為了保證反應(yīng)的特異性，還應(yīng)用ng級的克隆DNA，g水平的單拷貝染色體DNA或102-105拷貝的待擴增片段作為起始材料。 模板可以是粗品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制劑以及結(jié)合在DNA上的蛋白。第23頁

10、，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二 模板的純度、含量測定 260nm 1 OD 雙鏈DNA 50g /ml 單鏈DNA 40g /ml OD 260nm/ OD280nm 1.8第24頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二ddH2O 37.60L10 Buffer 5LdNTP mixture(2.5mM) 4L引物上(20pmol/L) 1L引物下(20pmol/L) 1L MgCl2(25mM) 4L模板(102-105 拷貝) 0.5LDNA Polymerase 0.4L總體積 50L第25頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二

11、95變性處理3min 94 30S 56 30S 72 1min 30個循環(huán) 72延伸7min 第26頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二第27頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二PCR產(chǎn)物純化 從凝膠上盡量小的切下目的片段,放在一個干凈的EP管中，稱取凝膠的重量，并加入3倍體積的Buffer S1 (即100mg膠加300L Buffer S1)；盛膠EP管于50水浴10min，每2-3min搖動一次，至膠徹底融化；溶液加入到吸附柱內(nèi)，13000rpm離心1min，棄去收集管中的液體；第28頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二 加入

12、0.5mL的Buffer W1洗滌DNA，13000rpm離心15sec；棄去收集管中的液體，再加入0.5mL的W1 Buffer，靜置1min，13000rpm離心15sec；棄去收集管中的液體， 13000rpm離心1min；把吸附柱放在一個干凈的EP管內(nèi)，在柱子膜中央加入30L Buffer T1, 室溫放置1min,13000rpm 離心1min。 凝膠回收后的目的基因，各取5L電泳檢測，并測定濃度以確定連接體系（此步必做）。第29頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二第30頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二第31頁，共67頁，2022年，5月2

13、0日，12點6分，星期二第32頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二PCR的主要用途 （一）目的基因的克?。篜CR技術(shù)是迅速獲得一定量的目的基因以用于基因克隆的有效方法之一。主要采用的方法有： 利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板，獲得已知的目的基因；第33頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二 利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得具有同源性的DNA片段； 利用隨機引物從cDNA文庫或基因組文庫中隨機獲得目的基因。 第34頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二（二）基因的體外突變：采用隨意設(shè)計的引物，在體外對基因進行嵌合、缺

14、失、點突變等改造。（三）DNA的微量分析：由于PCR技術(shù)具有高度敏感性，故可用于微量DNA的分析檢測。 第35頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二3.3 生物芯片生物芯片（biochip）的概念指采用光導(dǎo)原位合成或微量點樣等方法，將大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至組織切片、細胞等生物樣品有序地固化于支持物的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標記的待測生物樣品中的靶分子雜交，通過特定的儀器對雜交信號的強度進行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。第36頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二根據(jù)生物分子之間特異性相互作用的原理，如DN

15、A-DNA、DNA-RNA、抗原-抗體、受體-配體之間可發(fā)生的復(fù)性與特異性結(jié)合，設(shè)計一方為探針，并固定在微小的載體表面，通過分子之間的特性性反應(yīng)，檢測另外一方有無、多少或者結(jié)構(gòu)改變等第37頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二生物芯片（Biochip或Bioarray）是指包被在固相載體上的高密度DNA、抗原、抗體、細胞或組織的微點陣(microarray）。未來十年最具發(fā)展?jié)摿Φ募夹g(shù)。第38頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二生物芯片的主要特點：高通量、微型化和自動化常用的生物芯片的分類：基因芯片、蛋白質(zhì)芯片及芯片實驗室第39頁，共67頁，2022年，5

16、月20日，12點6分，星期二基因芯片（Genechip） 又稱DNA芯片,是根據(jù)核酸雜交的原理，將大量探針分子固定于支持物上，然后與標記的樣品進行雜交，通過檢測雜交信號的強度及分布來進行分析。第40頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二2.蛋白質(zhì)芯片(proteinchip) 利用抗體與抗原特異性結(jié)合即免疫反應(yīng)的原理，將蛋白質(zhì)分子（抗原或抗體）結(jié)合到固相支持物上，形成蛋白質(zhì)微陣列，即蛋白質(zhì)芯片。 第41頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二芯片實驗室(labs-on-chip) 高度集成化的集樣品制備、基因擴增、核酸標記及檢測為一體的便攜式生物分析系統(tǒng)。實現(xiàn)

17、生化分析全過程集成在一片芯片上完成，從而使生物分析過程自動化、連續(xù)化和微縮化。芯片實驗室是生物芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標。第42頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二3.4 基因文庫的構(gòu)建第43頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二基因文庫基因組文庫第44頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二第45頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二為什么要建立基因文庫？直接從含目的基因的生物中提取不行嗎？第46頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二基因文庫限制性內(nèi)切酶克隆、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、鑒定基因組DNA基因文庫第47頁，共

18、67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二基因組DNA文庫基因組DNA限制性內(nèi)切酶基因重組轉(zhuǎn)化細菌體外包裝第48頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二cDNA文庫的組建：基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA第49頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二如何從基因文庫中找到所需要的基因根據(jù)目的基因的有關(guān)信息基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)第50頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二3.6 酵母雙雜交系統(tǒng) 酵母雙雜交技術(shù)是1989年由Fields等最先應(yīng)的。與其他技術(shù)相比，它省去了耗時耗力的

19、蛋白表達純化以及抗體制備步驟，并且可以用于高通量的篩選，因此以其簡便、快捷與廉價的優(yōu)點迅速發(fā)展成為一種常用的研究蛋白質(zhì)相互作用的方法。根據(jù)對文獻的統(tǒng)計，目前已知的蛋白質(zhì)相互作用至少有一半是通過酵母雙雜交實驗發(fā)現(xiàn)的。第51頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二原理轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式的(modular), 即這些因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成, 其中有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain, 簡稱為DB)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain, 簡稱為AD), 它們是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。 單獨的DB雖然能和啟動子結(jié)合

20、, 但是不能激活轉(zhuǎn)錄。 而不同轉(zhuǎn)錄激活因子的DB和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄的功能。 第52頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報道基因的表達探測蛋白蛋白的相互作用。主要結(jié)構(gòu)由含有DNA 結(jié)合域和DNA 轉(zhuǎn)錄激活域二類載體以及酵母報告株構(gòu)成。 將DNA BD 與已知的誘餌蛋白質(zhì)X 融合,構(gòu)建出BD - X質(zhì)粒載體;將AD 基因與cDNA 文庫,基因片段或基因突變體(以Y表示) 融合,構(gòu)建出AD- Y質(zhì)粒載體。第53頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二第54頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星

21、期二酵母雙雜交系統(tǒng)的實驗基本過程第55頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二 3.7 DNA堿基序列測定 DNA堿基序列測定即DNA一級結(jié)構(gòu)的測定，目前常用的方法為Maxam-Gilbert建立的化學裂解法和Sanger建立的雙脫氧末端終止法。 第56頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二雙脫氧末端終止法的主要操作步驟有：1獲得待測DNA片段的單鏈模板：一般采用基因工程的方法以獲取一定數(shù)量的單鏈待測DNA模板?？蓪⒋郎yDNA片段與噬菌體M13DNA進行重組，然后將其導(dǎo)入大腸桿菌進行增殖，M13噬菌體一般以單鏈DNA形式透出細胞再感染新的細菌，故此可獲得單鏈D

22、NA模板。 第57頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二2合成寡核苷酸引物：在待測DNA片段的3-端合成一段互補的寡核苷酸引物，其順序可為待測DNA片段3-端的一段已知順序，也可為一段M13噬菌體的順序?？衫肈NA合成儀自動合成。3模板-引物雜交：將待測單鏈DNA模板與寡核苷酸引物混合，并在適當溫度條件下進行保溫處理，使引物與DNA單鏈模板的3-端進行雜交。 第58頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二4互補鏈的延長和終止：將上述雜交混合液分為四份，每份混合液中均加入DNA聚合酶，四種dNTPS，一種帶放射性同位素標記的脫氧核糖核酸（如-32P-dATP）。此外，還需分別加入一種雙脫氧核糖核酸（ddATP，ddGTP，ddCTP或ddTTP）。然后在適當溫度條件下延伸互補鏈，就可得到四組分別以A、G、C、T，終止的長短不一的互補鏈的混合物。因在互補鏈合成時，如摻入的是雙脫氧核糖核酸，由于缺乏3-和2-OH，故可導(dǎo)致互補鏈合成終止。 第59頁，共67頁，2022年，5月20日，12點6分，星期二5電泳分離：將四