1、 重組人胰島素的研究歷史 和生產工藝BY: 王騰 時佳 孫玉新 瑪依努爾 據世界衛生組織統計，2011年全球糖尿病患者2.8億，在中國，已突破9200萬人，發病率達10%，同時由于老齡化等因素，國內還有9000多萬的潛在糖尿病患者。加之中國糖尿病患者整體治療率不足三成，且人均胰島素使用量偏低，僅為美國糖尿病患者人均使用量的0.8%，所以中國胰島素市場潛力巨大。 重組人胰島素 胰島素定義： 胰島素是由胰島細胞受內源性或外源性物質如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一種蛋白質激素。 胰島素結構： 胰島素由A、B兩個肽鏈組成。A鏈有11種21個氨基酸，B鏈有15種30個氨基酸，共26種51個

2、氨基酸組成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四個半胱氨酸中的巰基形成兩個二硫鍵，使A、B兩鏈連接起來。此外A鏈中A6(Cys)與A11(Cys)之間也存在一個二硫鍵。 3D Structure of Insulin胰島素二聚體（dimer）胰島素六聚體（hexamer ）Ins的性質 胰島素的功能 穩定性Ins在弱酸性水溶液中或混懸在中性緩沖液中較穩定還原劑及多種重金屬使Ins失活 紫外線、光氧化、超聲波會引起Ins變性。 胰島素是機體內唯一降低血糖的激素，也是唯一同時促進糖原、脂肪、蛋白質合成的激素。藥理作用 治療糖尿病、消耗性疾病。1921年-從動物胰

3、腺中提取出胰島素，開創了人類胰島素治療的歷史。1926年-重結晶胰島素1930s-傳統中、長效動物胰島素1970s-單峰胰島素和 單組分胰島素 70年代末-半合成胰島素重組胰島素的研究歷史基因重組人胰島素研 制成功 基因重組人胰島素實驗基因重組來源的胰島素（27種）藥品名稱生產企業藥品名稱生產企業APIDRA SANOFI AVENTIS US LANTUS SANOFI AVENTIS US EXUBERA PFIZER LEVEMIR Novo Nordisk HUMALOG LILLY MIXTARD HUMAN 70/30 BAYER PHARMS HUMALOG MIX 50/50

4、LILLY NOVOLIN 70/30 Novo NordiskHUMALOG MIX 75/25 LILLY NOVOLIN L NOVO NORDISK INC HUMALOG PEN LILLYNOVOLIN N NOVO NORDISK INC HUMULIN 50/50 LILLY NOVOLIN R NOVO NORDISK INC HUMULIN 70/30 LILLY NOVOLIN R（Purified）NOVO NORDISK INC HUMULIN 70/30 PEN LILLYNOVOLOG NOVO NORDISK INC HUMULIN BR LILLYNOVOLO

5、G MIX 70/30 NOVO NORDISK INC HUMULIN L LILLYVELOSULIN BR NOVO NORDISK INC HUMULIN N LILLYVELOSULIN BR HUMANNOVO NORDISK INC HUMULIN R LILLYHUMULIN U LILLYHUMULIN R PEN LILLY胰島素給藥方式的發展注射給藥非注射給藥一種新的注射給藥方式:NIS泵 通過一條與人體相連的軟管向體內持續輸注胰島素的裝置。它模擬人體健康胰腺分泌胰島素的生理模式。俗稱“人工胰腺”。 維持血液中INS水平 縮短控制高血糖的時間 減少低血糖發生， 減輕病人多

6、次皮下注射INS的痛苦 INS泵是強化治療的最佳手段非注射給藥口服給藥：由于采用了包裹的方法來保護胰島素制劑，口胰島素在胃及小腸內不被破壞，在大腸內分解、釋放出來，通過腸黏膜進行吸收。肺部給藥：巨大的肺泡表面積、極薄的肺泡、豐富的毛細血管網、狹小的氣血通路、低酶活性、肺深處較慢的清除速率等，這些良好的生理環境為蛋白多肽的吸收提供了有利條件。眼部給藥：INS主要通過眼結膜和鼻淚管黏膜吸收進入體循環兩達到降糖效果。一般眼內容量少，INS作用時間短，生物利用度低因此人們致力于研究能延長INS作用時間的滴眼劑，并選擇刺激性小的滴眼劑。鼻腔給藥黏膜內血管豐富黏膜上蛋白酶含量也比胃腸道中少，減少了INS被

7、酶破壞失活。提高了藥物的生物利用度。許多藥物動力學研究表明，鼻黏膜吸收INS的機制與體內內源性的INS釋放極為相似，為鼻腔INS給藥提供了理論依據。鼻腔給藥需要加入吸收促進劑才能增加吸收效果口服給藥、局部給藥 人胰島素分類傳統中長效胰島素 長效人胰島素類似物速效人胰島素類似物非注射胰島素 Lispro （賴脯胰島素 ，Humalog ）是第一個用于臨床的速效胰島素類似物,由美國禮來公司研制生產，將人胰島素的B28與B29位的氨基酸對換。 Aspart（門冬胰島素，Novolog ）由丹麥諾和諾德公司研制生產，結構與人胰島素的區別在于用天冬氨酸取代了B鏈28位上的脯氨酸。APIDRA （賴谷胰島

8、素，Apidra ）安萬特公司研制，以賴氨酸和谷氨酸分別取代了人胰島素B3位的天冬氨酸和B29位的賴氨酸。長效胰島素-人胰島素類似物1. 甘精胰島素（ glargine ）： 商品名Lantus-甘氨酸替代胰島素A鏈21位門冬氨酸、并在B鏈末端增加兩個精氨酸。使胰島素結合更多帶正電的氨基酸殘基，改變等電點，使等電點由5.4上升至中性。這樣，胰島素類似物在酸性條件下可溶，在生理的近中性條件下結晶。2. Insulin Detemir：商品名Levemir -胰島素B鏈29位賴氨酸側鏈通過酰基化連接一個N-16-烷基 酸的14碳游離脂肪酸該游離脂肪酸能與白蛋白結合，延緩與胰島素受體結合，從而延長其

9、半衰期。 胰島素肺部吸入制劑-Exubera輝瑞、萬安特以及Nektar 共同研發于2006.1.27被FDA批準一種作用快的胰島素干粉吸入劑適用于餐前給藥，其胰島素吸收具有速效化的特征胰島素制備工藝 以動物胰臟為原料提取胰島素 -酸醇提取法 半合成胰島素-以豬胰島素為原料，酶修飾后得到人胰島素重組DNA技術生產人胰島素 AB鏈合成：分別表達AB鏈，化學方法連接 逆轉錄法：表達胰島素原，酶切得到重組人胰島素Ins A鏈Ins B鏈轉化大腸桿菌發酵A鏈B鏈純化二硫鍵活性胰島素AB鏈合成人胰島素質粒Ins mRNA反轉錄Ins cDNA轉化大腸桿菌PCR連接胰島素原活性胰島素二硫鍵酶切 提取質粒限

10、制性內切酶酶切 反轉錄酶法合成人胰島素 離子換，分子篩色譜，反相色譜結晶CNBr裂解，去除保戶多肽發酵胰島素原融合蛋白胰島素原（ SSO3 ）粗品亞硫基化胰島素原純化胰島素原純品酶切解離A,B鏈胰島素粗品純化的人胰島素基因重組大腸桿菌生產重組人胰島素工藝流程破碎菌體 包涵體 尿素溶解 復性酵母系統生產重組胰島素優點：二硫鍵的結構與位置正確，不需要復性加工處理缺點：表達低，發酵時間長表達載體結構基因組成：信號肽、前肽序列、MCS 和微小胰島素原。 前肽序列引導目的蛋白通過正確的分泌途徑至胞外。宿主：貝克酵母。分泌量大，形成二硫鍵，培養基簡單，高密度發酵，無熱原和有毒物質發酵生產重組人胰島素設備重組胰島素的質量控制測定生物活性效價測定控制產品中雜質或潛在有害物質保證產品安全性和有效性長期重復大劑量使用通化東寶 1998年12月研制出中國第一支基因重組胰島素“甘舒霖” 甘舒霖 R- 常規重組人胰島素注射液 甘舒霖 N- 低精蛋白重組人胰島素注射液 甘舒霖 30R- 30/70混合重組人胰島素注射液 （ 30%常規重