1、哈蟆油質量控制方法【摘要】根據歷史文獻和現代哈蟆油研究的成果，進展整理、分析、總結，闡述了哈蟆油質量控制現狀和方法，從傳統的基源鑒別開展到性狀鑒別、顯微鑒別、色譜法、光譜法以及生物鑒定法，尤其是現代開展較好的氣相色譜、高效液相色譜、電泳色譜、PR技術以及指紋圖譜技術的應用使哈蟆油的研究進入了一個更高的科學領域。對哈蟆油的鑒定手段不斷的完善，為進步哈蟆油質量控制和鑒別真偽提供了根據?！娟P鍵詞】中藥；哈蟆油；質量控制方法藥材的真偽鑒別和品質評價是臨床應用、成藥制備、中藥科研不可缺少的前提條件。我國藥材品種繁多，據統計約有一萬二千多種，由于地大物博，南北差異，同名異物、同物異名的混淆品種極多，療效各

2、不一樣。而且中藥的有效成分和環境、產地、采收季節等因素也有很大關系；加之近年來，假冒偽劣中藥充滿市場，為控制中藥質量、保證臨床用藥平安和有效，中藥鑒定技術由傳統的性狀鑒別，如眼觀、鼻聞、口嘗、手摸升華、水火試等，對藥物的形狀、大孝輕重、顏色、外表特征、折斷面紋理、氣味、黏性、酸堿性等進展正確鑒別和描繪，到現代的色譜法、光譜法、X射線分析法、熱分析法、分子生物學技術等。哈蟆油vidutusRanae為蛙科動物中國林蛙RanateprariahensinensisDavid雌蛙的輸卵管，經采制枯燥而得。據?中國藥典?2022年版部收載，具有補腎益精，潤肺養陰的成效，用于陰虛體弱，神疲憊力，心悸失眠

3、，盜汗不止，癆嗽咳血1等病癥。隨著中藥現代化技術的開展，哈蟆油的質量控制技術也在不斷的進步。1基源鑒定法基源鑒定法就是應用植物、動物或礦物形態和分類學等方面的知識，對中藥的來源進展鑒定。中國林蛙的形態特征2為：體長57；頭長等于或大于寬，口內鋤骨齒位于肉鼻孔前方，排列成兩短行；兩側耳無后腺；反面黃褐色，較平滑；腹面黃白色，胸骨平坦，下肢部兩側稍膨大；后肢長為軀體的1.5倍。幾種蛙類的檢索：1.膝不互交21.兩膝互交32.大腿后面不具白色縱紋青蛙2.大腿后面具有一條明顯的白色環紋金錢蛙3.體平扁而稍小;脛跗關節不達眼部,雄性無聲囊黑龍江林蛙3.體略扁而稍大;脛跗關節前達眼部,雄性有聲囊中國林蛙2

4、性狀鑒別法哈蟆油呈不規那么的塊狀，彎曲而重疊，長1.52，厚1.55，外表黃白色，呈脂肪樣光澤，偶有帶灰白色薄膜狀干皮。摸之有滑膩感，在溫水中浸泡體積可膨脹1015倍3。氣腥，味微甘，嚼之有黏滑感1。3顯微鑒別法董萬超等4報道了林蛙油的顯微特征如下：加碘酊染色后，在顯微鏡下觀察，呈金黃色。腺體細胞肥大，呈長橢圓形，排列整齊，細胞壁明顯，靠腺體內腔一端較窄，細胞壁凸起，細胞核橢圓形，位于細胞中間稍偏向腺體內腔一面，腺體底部較寬，上端較狹，呈圓錐形。腺體內開口呈心臟形，內凹，整個腺體布滿細小紋理。為鑒別哈蟆油與中華大蟾蜍輸卵管、明太魚精巢、瓊脂蛋白加工品、馬鈴薯甘薯的偽制品提供了根據。4理化鑒別法

5、4.1熒光檢查劉秀峰等5報道了哈蟆油干品在365n下呈黃色的熒光；乙醇浸出物在254n下呈藍白色熒光4。4.2化學定性分析據報道4蛤蟆油水浸液雙縮脲反響為深紫紅色；加茚三酮試劑，反響為深藍紫色。為鑒別真偽提供了根據。4.3化學定量分析1991年，劉永鎮等6利用哈蟆油與Fehling試劑生成沉淀的反響，定量的鑒別了哈蟆油與其偽品蟾蜍輸卵管。錢笈締等7采用蛋白質自動分析儀測定冰糖哈蟆油中蛋白質的含量，探究了動物藥制劑的指控方法。王秋雨等8采用半微量的凱氏定氮法測定了哈蟆油和青蛙油中蛋白質的含量分別為72.8和73.8。4.4光譜分析法4.4.1可見分光光度法衛功慶等9用美國產DU650分光光度計，

6、在553n下測定了哈蟆油和青蛙油中膽固醇的含量，分別為2.12，4.92g/kg，由此確定哈蟆油比擬合適中老年人服用。4.4.2紫外光譜法李明剛等10在0360n下對哈蟆油和中華大蟾蜍輸卵管95乙醇浸出物進展了紫外檢測，結果哈蟆油9個吸收峰分別位于4，114，129，252，256，275，311，312，314n；中華大蟾蜍輸卵管8個吸收峰分別位于4，113，131，216，245，275，298，315n；王麗蘭等11紫外光譜法測定了哈蟆油中總核酸的含量為2.69%，DNA為0.130.01%，RNA為2.560.05%。2022年，作者報道了采用紫外譜線組法，對不同產地和不同溶劑提取的哈

7、蟆油正品和偽品的紫外及其一階導數光譜進展了檢測，為哈蟆油的質量控制和真偽鑒別提供了根據12，13。4.4.3紅外光譜法對哈蟆油的紅外光譜的報道較少，丘澤雨等14對不同產地的珍珠、蟾蜍、哈蟆油、冬蟲夏草、五靈脂的同種藥材進展了比照研究，并用紅外光譜法進展了藥材真偽優劣鑒別。4.4.4原子吸收光譜法和發射光譜法王秋雨等8用原子分光光度計(VARIANAa220)和等離子發射光譜儀(日立Z-8200)測定了哈蟆油與青蛙油中微量元素和重金屬的含量，結果哈蟆油與青蛙油均含有人體必需的常用微量元素,但青蛙油中重金屬Pb及Hg含量超標。李媛媛等15采用等離子體發射光譜法對國產和俄羅斯產哈蟆油無機元素的含量進

8、展了分析。4.5色譜分析法4.5.1薄層色譜法劉永鎮等15研究證實,用丙酮提取物乙醚萃取后的殘留物,在石油醚醋酸乙酯41展開的薄層層析中,其Rf值為0.4，用展開劑苯乙醚甲醇1050.8，顯色劑茴香醛冰乙酸濃硫酸11002測定,效果良好。李明剛等10采用苯乙醚甲醇1050.8為展開劑，茴香醛冰乙酸濃硫酸11002為顯色劑，對哈蟆油和中華大蟾蜍輸卵管進展了鑒別。趙文英等16用丙酮連續回流提取法，以石油醚：醋酸乙酯41為展開劑，36的乙酸濃硫酸11為顯色劑，展距20，分別在自然光及紫外光365n下，對不同來源的哈蟆油正品以及不同種類的偽品進展了鑒別。目前，作者正在對哈蟆油進展系統的薄層色譜研究，比

9、擬不同極性的溶劑和提取方法下哈蟆油的薄層效果從而建立哈蟆油系統的薄層色譜條件，建立哈蟆油專屬性鑒別方法。4.5.2高效液相色譜法李成義等17應用HPL測定了哈蟆油中磷脂的含量；多年來，作者對哈蟆油的有效成分進展了較深化地研究，已別離出了多個化合物18，其中，十六烷酸膽甾醇酯為首次從哈蟆油中提取純化出來的，作者以十六烷酸膽甾醇酯為化學對照品，利用HPL法對哈蟆油進展了含量測定及其方法學的研究，為建立一個完好、科學的哈蟆油質量評價方法提供根據19。李津明等20采用了反相高效液相色譜技術，對10批不同來源的林蛙油藥材建立了高效液相色譜指紋圖譜，從而進步了哈蟆油的質量控制技術。4.5.3氣相色譜-質譜

10、法趙文英等21利用氣相色譜-質譜法(G-S)，對哈蟆油石油醚提取物別離出的脂肪酸進展分析，發現哈蟆油不飽和脂肪酸含量約占脂肪酸含量的40%；盧立明等22利用G-S對哈蟆油脂溶性局部的化學成分進展了研究，結果說明哈蟆油中含有多種不飽和脂肪酸和奇數碳原子脂肪酸。李成義等17利用G-S法，從吉林產哈蟆油中檢定出9種酸。其中亞油酸的相對百分含量為36.05%,花生四烯酸的相對百分含量為1.63%。劉玉翠等23利用G-S法對哈蟆油的一組脂溶性成分進展分析,共別離鑒定了5種酯類化合物。季怡萍24用氣相色譜(G)與氣相色譜-質譜(G-S)聯用技術對哈士蟆油中的脂肪酸組成進展了定性與定量分析,共鑒定出10種脂

11、肪酸并用氣相色譜法作了定量。王秋雨等8利用氣相色譜-質譜(G-S)測定哈蟆油與青蛙油脂類物質含量根本一致，約為6%，其中不飽和脂肪酸含量分別占其脂肪酸的77.26%和64.67%。4.6電泳分析法趙華英25采用PA-GE技術,對哈士蟆油及其偽品:黑斑蛙(習稱青蛙)、中華大蟾蜍的輸卵管進展酯酶同工酶和可溶性蛋白質的電泳分析。結果酯酶同工酶圖譜可見：哈士蟆油共有2條譜帶，A區1條三級帶，B區1條一級帶。黑斑蛙有7條譜帶，分布在B區和區。中華大蟾蜍有2條譜帶，分布在B區和區?？扇苄缘鞍踪|電泳圖譜。可見哈士蟆油在區有2和62條一級帶可與偽品鑒別。因為黑斑蛙只有3一級帶，而中華大蟾蜍區無一級帶。曾明26

12、、石俊英等27采用凝膠電泳法測得哈蟆油一級帶三條，二級帶兩條，三級帶一條，為鑒別哈蟆油與其易混品種雞內金、蟾酥等提供了根據。5生物鑒定法5.1放射性免疫分析法林紀嫻等28采用放射性免疫分析法對中國林蛙和中華大蟾蜍輸卵管中睪酮的含量進展了分析；李成義17、白云等29先后采用了放射性免疫分析法測定了哈蟆油中激素的含量。5.2多聚酶鏈式反響PR技術楊學干等30從中國林蛙(Ranahensinensis)、中華大蟾蜍(Bufgargarizans)以及鱈魚(Gadusarephalus)等組織材料中提取DNA，擴增出約340bp的12SrRNA基因片段，測定其序列，并參考有關序列，設計一對哈蟆油的鑒別

13、引物HsL1，HsH1，用該鑒別引物擴增蛙類原動物的模板DNA時，只有中國林蛙和黑龍江林蛙的模板能得到陽性擴增，其余樣品為陰性。因此該對引物能用于哈蟆油藥材來源的鑒別，對購自5個不同藥材商店的哈蟆油PR鑒定結果說明，現市售商品哈蟆油有不同的材料來源，主要因為哈蟆油是由中國林蛙輸卵管干制而成，這種以組織器官制成的藥材鑒定難度大，易用其它動物相似的器官組織冒充,如黑斑側褶蛙、中華大蟾蜍、鱈魚等的輸卵管或精巢等加工品。該研究得到的鑒別引物能準確地對該藥材的來源加以區別?！緟⒖嘉墨I】1國家藥典委員會.中國藥典，部S.北京：化學工業出版社，2022：179.2嚴啟新.哈士蟆油的鑒別研究進展及資源開發J.

14、時珍國藥研究,1997,8(1):78.3金勝基，陣燦輝.幾種中藥材簡易水試鑒別法J.時珍國醫國藥,2000,11(5):422.4董萬超，張秀蓮，張寶香，等.林蛙及其油的利用概況J.特種經濟動植物，1998，(2):11.5劉秀峰，紀成茂.哈蟆油及其偽品的鑒別J.海峽藥學，1997,9(2):107.6劉永鎮，崔順錦，南善姬.蛤蟆油與其偽品蟾蜍輸卵管的簡易理化鑒別J.延邊醫學院學報,1991,14(2):109.7錢笈締，王培麗.冰糖哈士蟆油質量控制初探J.中成藥,1996,18(2)：43.8王秋雨，金莉莉，婁虹，等.哈蟆油和青蛙油主要營養成分的測定J.特產研究，2022,(4):37.9

15、衛功慶，楊寶田，張愛武，等.哈士蟆油與青蛙油脂肪酸及膽固醇的比擬研究J.吉林農業大學學報,1999,21(增刊):39.10李明剛，劉玉宗，宋玉蘭，等.哈蟆油及其偽品的鑒別J.特產研究，1992,(4):42.11王麗蘭,楊鳳和,王春霖，等.哈士蟆油核酸含量分析J.中草藥,1990，21(12)21.12王永生，姜大成，白雪媛，等.紫外譜線組法在哈蟆油偽品鑒別中的應用J.中成藥,2022,28(9):1336.13王永生，姜大成，白雪媛，等.蛤蟆油紫外譜線組法真偽鑒別的研究J.時珍國醫國藥，2022,17(11):2125.14邱澤雨，郭允珍.中藥紅外光譜鑒別方法的研究J.中成藥，1989,1

16、1(8):16.15李媛媛，胡嶸，關樹文，等.采用等離子體發射光譜法對不同產地哈蟆油無機元素的含量分析J.長春中醫學院學報，2002,18(4):45.16趙文英，楊祝方，侯振榮，等.哈蟆油的檢查及薄層方法初探J.沈陽藥科大學學報，1997,14(1):56.17李成義，金子，王琳.G/S法分析吉林產哈士蟆卵油的脂肪酸J.中國藥學雜志,1994,29(1):18.18姜大成，王永生，翁麗麗，等.哈土蟆油的化學成分研究.成都：第五屆全國動物藥和藥用動物保護學術研討會,2002：58.19王永生，姜大成，孟勤，等.HPL測定哈蟆油中十六烷酸膽甾醇酯含量研究J.中國中藥雜志，2022,30(13):990.20李津明，許婷，賈紹華，等.林蛙油的指紋圖譜J.中草藥，2022,36(4):591.21趙文英,侯振榮.蛤蟆油的化學成分J.沈陽藥科大學學報,1996，13(4):276.22盧立明,宋少江,武勇.蛤蟆卵油化學成分研究J.中國藥物化學雜志,2001，11(4):224.23劉玉翠.哈蟆油脂溶性化學成分研究J.吉林中醫藥,2022,25(5):56.24季怡萍.哈士蟆油中脂肪酸的G、G-S分析J.分析測試學報,1999,18(3):80.25趙華英，許欣榮，霍德蘭，等.哈士蟆油及其偽品的電泳鑒別J.中藥材,1998,21(3)