1、 好氧反硝化菌及其在污水處理和環境修復中的研究進展 丁鈺 張婷月 黃民生 何巖 曹承進Summary：好氧反硝化菌由于其可以進行同步硝化反硝化的獨特優勢，給傳統生物脫氮帶來了新思路.本文綜述了好氧反硝化菌的分離方法、種類及其影響因素，從電子傳遞瓶頸理論和酶學理論兩方面探討了好氧反硝化作用機理，介紹了它們在污水處理和環境修復方面的應用.研究表明，溫度、溶解氧（DO）、碳源、碳氮比和pH值對好氧反硝化過程影響明顯，且好氧反硝化菌在適宜條件下都有高效的脫氮效率.不過，目前好氧反硝化菌在環境修復應用方面仍有著效果不穩定等不足，和實驗室研究有著一定的差距，需要進一步的探究.系統總結了好氧反硝化菌的分離方

2、法、種類、反應機理、影響因素以及污水處理和環境修復中的應用。Key：好氧反硝化菌;生物脫氮;環境生物修復：X522 文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1000-5641.2018.06.001引言污水中含有過量的氮素，導致水體富營養化進而影響水資源利用和水生態安全，所以減少污水中氮排放量，降低水中氮含量是必要的傳統生物脫氮方法認為生物脫氮由硝化作用和反硝化作用組成，兩個部分相互獨立又要協同完成，每一部分所參與的微生物和環境條件完全不同，硝化反應需要自養細菌在好氧條件下完成，反硝化反應需要異養細菌在嚴格缺氧/厭氧條件下完成.反硝化是氮素生物地球化學循環的重要環節.長期以來厭養反

3、硝化細菌曾被認為是反硝化過程的唯一承擔者.然而，自1980年以來，隨著Meiberg等在Hyphomicrobium x氧化二甲胺/三甲胺過程發現具有好氧反硝化功能的菌株以及Robertson等在廢水脫硫和反硝化系統中首次分離出一株好氧反硝化菌Thiosphaera pantotropha（現名脫氮副球菌Paracoccusdenitrificans）越來越多的證據表明好氧反硝化菌在生態系統氮素循環中起著不容忽視的作用而且一部分好氧反硝化菌有同步硝化反硝化功能給傳統生物脫氮帶來了新的思路.本文系統總結了好氧反硝化菌的分離方法、反應機理、影響因素以及污水處理和環境修復中的應用.1好氧反硝化菌的分

4、離好氧反硝化菌為專性或兼性好氧細菌，在自然界中含量少，很難成為自然環境中優勢菌種，給好氧反硝化菌的分離帶來了極大的難度.好氧反硝化菌的分離方法主要有以下幾種.1.1持續曝氣法在細菌的反硝化過程中，硝酸鹽（NO-3）和氧氣（02）都能作為電子傳遞過程中電子的最終受體，好氧反硝化菌可以同時利用NO-q和O2.利用該特征，持續往以硝酸鹽為單一氮源的反硝化培養基中通入氧氣，使細菌處于好氧環境中，氧分子抑制了厭氧條件下發揮作用的酶，使得專性厭氧菌和兼性厭氧菌生命活動受到抑制，從而使好氧反硝化菌在競爭中處于優勢地位.Honda等人利用持續曝氣法在培養基中曝氣一段時間，篩選出一株腸球菌，該菌株可以在有氧條件

5、下進行反硝化脫氮但是這種方法具有篩選時間長、不易于篩選出單一純化菌種的缺點。1.2呼吸抑制劑法呼吸抑制劑法通過在持續曝氣的培養基中加入呼吸抑制劑來篩選出好氧反硝化菌.該方法用持續曝氣來抑制厭氧和兼性厭氧菌的生長，通過加入某種可以阻斷電子流向其他電子受體的呼吸抑制劑，使電子流向氧氣和硝酸鹽，來抑制其他好氧菌，從而分離出好氧反硝化菌孔慶鑫等選擇氰化鉀（KCN）作為呼吸抑制劑對富集源進行初篩，之后復篩，篩選出一株高效菌Y2-1，在呼吸抑制法中，選擇合適的呼吸抑制劑是該方法的關鍵，由于菌種培養的不同階段需要的呼吸抑制劑和不同分離源所需要的呼吸抑制劑都可能不同，給分離過程帶來了極大的不便.1.3酸堿指示

6、劑法酸堿指示劑法是通過在培養基中加入酸堿指示劑反映出菌株生命活動過程中pH變化，來篩選出特定產酸或者產堿的菌.通常應用于篩選好氧反硝化菌的酸堿指示劑是溴百里酚藍（BTB），BTB的pH變色范圍是6.07.6，顏色由黃色到綠色到藍色.該方法就是利用細菌在反硝化過程中pH值會升高的特點，在好氧條件下用加入了BTB的培養基培養細菌，好氧反硝化菌會在其周圍產生一圈藍色光暈，從而將其分離出李秀婷等人用BTB培養基從污水處理池的活性污泥中初篩出22株好氧反硝化菌株.1.4滴加試劑法該方法是利用在培養液中滴加格里斯試劑、二苯胺試劑和奈氏試劑，3種指示劑分別能指示亞硝氮、硝氮和氨氮的變化，從而分離出脫氮效率高

7、的反硝化菌株.開始時在以硝氮為唯一氮源的培養基中加入1-2滴格里斯試劑，可以檢測亞硝酸鹽的存在，如溶液立即變成棕色或粉紅色，說明該溶液中具有好氧反硝化作用的細菌，過程中生成了亞硝酸鹽.若無顏色變化，再加X-苯胺試劑，若培養液變為藍色，則說明硝酸鹽并沒有被還原，溶液中無反硝化細菌;若無色，則表示硝酸鹽和剛生成的亞硝酸鹽都被還原成氮氧化物，說明該溶液中具有較強好氧反硝化功能的細菌.周立祥等在好氧條件下采用滴加試劑法，從土壤中分離到3株好氧反硝化菌，均屬于假單胞菌屬.朱曉宇等采用該方法，分別從水稻土和活性污泥中分離到1株好氧反硝化菌（zW23和ZW27），經鑒定分別為假單胞菌屬類產堿桿菌和假單胞菌屬

8、門多薩菌，脫氮速率分別達到約21.72和22.31mg/（L.h）.不過這種方法適合篩選反硝化過程中有明顯亞硝酸鹽積累的菌株，不具有普遍適用性，且在分離精度上有較大的誤差.1.5固液交替培養法該方法是將液體培養基培養和固體培養基篩選結合，進行多次篩選，不斷地劃線分離純化，再通過好氧環境培養，分離出需要的好氧反硝化菌株，再純化再培養，然后通過測其硝氮去除率來篩選出具有較高脫氮效率的純種好氧反硝化菌株.此方法可以篩選出高效的純菌株，但過程復雜，重復操作多，工作量較大.以上各方法都有一定的缺陷，現在實驗中多采用各方法組合的綜合篩選法，可以較快地找到高效目標單菌株.Yao等人用BTB培養基在好氧環境中

9、經過固液交替培養分離純化得到了一株在低溫下具有好氧反硝化功能的菌株不動桿菌HA2.黃廷林等用選擇培養基通過持續曝氣法和逐步馴化培養法從貧營養水源水庫中分離出一株好氧反硝化菌A14.2好氧反硝化菌的種類好氧反硝化菌的研究從20世紀80年代開始，之后國內外研究者在好氧反硝化領域進行了長期的深入研究，越來越多的新型好氧反硝化菌從自然環境和污水處理系統中分離出來（見表1）.從表1可以看出，很多菌屬都具有好氧反硝化能力，例如副球菌屬（Paracoccus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動桿菌屬（Acinetobacters）和芽孢桿菌屬（Bacillus）.從近些年國內外的研究報道可以看出，

10、雖然在自然環境中，好氧反硝化菌不是優勢菌，但使用合適方法可以進行分離和富集。3好氧反硝化反應機理3.1電子傳遞瓶頸理論Robertson等在廢水脫硫和反硝化系統中首次分離出一株好氧反硝化菌Thiosphaerapantotropha（現名脫氮副球菌Paracoccus denitrificans），隨后提出電子傳遞瓶頸理論來解釋好氧反硝化反應機理.他們把研究重點放在細菌的電子傳遞上，對于傳統反硝化細菌的電子傳遞而言，在細胞色素c（Cyt c）和細胞色素aa3（cyt aa3）傳遞中存在傳遞瓶頸，從而使電子不能同時流向O2和NO-3，而在好氧反硝化過程中，打破了這種瓶頸，使電子可以同時流向O2和

11、NO-3.從而解除了O2對反硝化過程的競爭抑制作用，可以在好氧環境中進行反硝化過程.隨后，Kong等提出了新的好氧反硝化電子傳遞模型，認為可能存在一條新的電子傳遞鏈，該電子傳遞鏈可以以醌氫類為電子供體，通過不受氧氣抑制的硝酸鹽還原酶（Nar）和亞硝酸鹽還原酶（Nir）將電子傳遞給硝酸鹽，從而可以在好氧條件下把硝酸鹽還原.該發現補充和發展了Robertson等人的電子傳遞理論.3.2酶學理論研究者們嘗試從好氧反硝化酶系統來解釋好氧反硝化現象，提出了酶學理論.微生物進行反硝化過程需要4種酶：硝酸鹽還原酶（Nar）、亞硝酸鹽還原酶（Nir）、一氧化氮還原酶（Nor）和一氧化二氮還原酶（Nos），其中

12、硝酸鹽還原酶（Nar）包含兩種：膜結合硝酸鹽還原酶（M-Nar）及周質硝酸鹽還原酶（P-Nar）.前者和細胞膜結合，而后者存在于細胞質膜和細胞壁之間.Bell等將分離得到的好氧反硝化菌T.pantotropha分別在好氧條件和缺氧條件下培養，對兩種酶進行研究.結果發現膜結合硝酸鹽還原酶（M-Nar）只在缺氧或厭氧條件下表達，而周質硝酸鹽還原酶（P-Nar）在好氧和缺氧、厭氧條件下均可以表達，其中好氧條件更適宜該酶的表達.實驗證明了正是硝酸鹽還原酶的種類差異導致了好氧反硝化菌和普通反硝化菌的區別，好氧反硝化的發生是由于周質硝酸鹽還原酶（P-Nar）的存在和表達.和厭氧反硝化菌不同，好氧反硝化菌擁

13、有兩種硝酸鹽還原酶，使02和NOi可以同時被還原，o2對好氧反硝化過程不再起到競爭抑制作用，好氧反硝化得以實現.4好氧反硝化的影響因素好氧反硝化菌由于其獨特的優勢而被廣泛關注，目前對好氧反硝化的研究還處于實驗室階段，人們從自然界中分離出多種好氧反硝化菌，但是由于該類菌對環境要求苛刻及其特殊性，研究好氧反硝化的影響因素及其優化條件對優化好氧反硝化系統設計及其工程應用顯得尤為重要.一般來說，影響好氧反硝化的因素有溫度、溶解氧、碳源、碳氮比和pH值等，這些因素都是影響好氧反硝化菌生長及其反應速率的重要因素.其中，溫度是影響所有微生物生長、繁殖及其生理活性的重要因素，有機碳源種類和濃度會影響好氧反硝化

14、的反應速率，在一定范圍內碳源濃度的升高會加快好氧反硝化的速率，pH值通過影響酶活性來影響好氧反硝化速率，這些因素對于不同菌種的影響程度不同.4.1溫度過高和過低溫度都會抑制好氧反硝化過程，對于大多數好氧反硝化菌，最適溫度范圍為2537c.Ren等發現對于好氧反硝化菌Acinetobacter sp.YB而言，在37c下獲得的NH+4-N去除率最高，微生物的生長速率也隨著溫度的升高而升高.但也有特殊情況，一些好氧反硝化菌就不受低溫的影響.在已經發現的好氧反硝化菌中，也有少數被證明是嗜低溫菌.Yao等發現一株異養硝化一好氧反硝化菌在溫度低至10c時仍能保持相對高的生長速率，沒有滯后階段，且20c為

15、最適生長溫度.從表2可以看出大多數好氧反硝化菌在較寬的溫度范圍內（2537c）保持著較高的活性和脫氮效率，這有利于好氧反硝化菌在環境中的競爭，在有溫度波動的實際廢水中更具有應用價值，且嗜低溫好氧反硝化菌的發現也為好氧反硝化菌在低溫地區的應用打下了基礎.4.2溶解氧（DO）溶解氧的濃度不僅決定了好氧反硝化菌的有無，而且還影響了其豐度和生理活性.前文提到反硝化過程涉及4種酶，這4種酶的合成和活性均受到溶解氧的影響，其中對氧的耐受程度最高的是硝酸鹽還原酶有實驗表明，當溶解氧濃度低于0.2 mg/L時一氧化二氮還原酶受到抑制，而硝酸鹽還原酶在溶解氧濃度高于4mg/L時受到抑制，可以看出溶解氧濃度會對反

16、硝化過程的路徑及其產物造成影響.好氧反硝化菌種類繁多，不同的好氧反硝化菌對溶解氧的耐受程度不同，如表2所示，大多數好氧反硝化菌的最佳溶解氧濃度在2-7 mg/L之間，一些好氧反硝化菌在6-7 mg/L時仍表現出很強的反硝化能力，展現出對氧很強的耐受性，這也更體現了好氧反硝化的優勢.Huang等發現對好氧反硝化菌檸檬酸桿菌屬Citrobacter diversu sp.而言，該菌屬的細胞生長速率和反硝化速率隨著溶解氧濃度的升高呈現先上升后下降的趨勢，在溶解氧濃度為5 mg/L時反硝化速率最高.總之，DO濃度對好氧反硝化過程是一個非常重要的影響因素，在一定范圍內DO濃度的增加會促進好氧反硝化過程.

17、4.3碳源種類及碳氮比碳源給細菌的生命活動提供能量的同時也給好氧反硝化過程提供了電子供體，所以它同時影響了好氧反硝化菌的生長和脫氮效率.好氧反硝化菌可利用的主要碳源有葡萄糖、乙酸鈉、丁二酸鈉和檸檬酸鈉等，少數也能利用某些難降解有機物.好氧反硝化菌的碳源利用多樣性有利于其在微生物系統中取得競爭優勢，有利于好氧反硝化菌在實際廢水處理中的應用.從表2可以看出，不同的好氧反硝化菌有著不同的最佳利用碳源，但是大多數利用乙酸鈉、丁二酸鈉、檸檬酸鈉這一類小分子碳源時都有著更好的脫氮效率.Chen等對好氧反硝化菌Agrobacterium sp.LAD9進行了碳源的影響因素實驗，發現和葡萄糖、蔗糖這類大分子碳

18、源相比，丁二酸鈉和檸檬酸鈉為碳源時好氧反硝化菌生長速率更快.由此可以推測可能是小分子碳源的結構簡單，更容易被好氧反硝化菌利用，從而有利于好氧反硝化菌的生長和生命活動.除了少數特例之外，大多數好氧反硝化菌被證明更適應小分子碳源.大多數好氧反硝化菌都是異養菌，通常需要外加碳源提供電子，若碳源不足則會導致電子供體不足，所以碳氮比對好氧反硝化過程影響明顯.如表2所示，好氧反硝化菌可利用的碳氮比范圍較廣，好氧反硝化菌的寬廣碳氮比適應范圍有利于其在實際工程中的應用.有研究表明，對好氧反硝化菌Pseudonocardia ammonioxydans H9T而言，碳氮比在212范圍內，反硝化效果和碳氮比成正比

19、.可以看出，對于好氧反硝化菌而言，低碳氮比會導致碳源不足，電子供體不足，反硝化過程不徹底，所以在一定范圍內隨著碳氮比增高反硝化效果增強，而在高碳氮比條件下，碳氮比成了非限制因素，對反硝化效果影響不明顯.4.4pH值pH值是影響反硝化過程的一個重要因素，對于好氧反硝化過程亦是如此.Guo等發現好氧反硝化菌P.Stutzeri strain T1在中性和堿性環境中有利于好氧反硝化過程.在微生物的反硝化過程中，細胞會產生堿性物質使環境中pH值升高，而pH值升高又可以加速氨氮的氧化去除，所以維持微生物環境中合適的pH值是非常重要的.5好氧反硝化菌在污水處理和環境修復中的應用針對傳統厭氧反硝化的缺點，越

20、來越多的研究者們專注于新型脫氮技術的研究.好氧反硝化作為新型脫氮技術的一種重要處理方法，和傳統反硝化相比擁有很多優勢：脫氮過程中好氧反硝化菌的加入使同步硝化反硝化（sND）變為了現實，極大地節省了反應器的占地面積，降低了設施的建設成本和運營成本;好氧反硝化菌多為異養硝化好氧反硝化菌，相比于傳統脫氮過程中的自養硝化細菌，生長繁殖更迅速，反應器啟動更快，且對外界環境的適應性更強.所以，好氧反硝化具備很高的應用價值和前景，具有廣闊的應用空間.5.1污水生物處理5.1.1生物膜法李佳等利用接種了好氧反硝化菌LJl2的人工快速滲濾系統（cRfI）處理含氮廢水，按照淹水期和落干期比例1：3間歇式布水，水力

21、負荷1.0m/d持續進水，經過7d的適應期之后，化學需氧量（cOD）去除率83%，NH+4-N去除率92%，總氮（TN）去除率71%，達到了較好的脫氮效果.鄧康等利用好氧反硝化菌強化的曝氣生物濾池（BAF）工藝處理含氮廢水，在碳氮比為67、DO濃度為3.5mg/L的條件下，掛膜成功后氮去除率大于90%且幾乎沒有亞硝酸鹽的累積.夏四清等用懸浮載體生物膜反應器（sCBR）處理含氮廢水時實現了同步硝化反硝化（sND），在最佳碳氮比條件下，裝置運行穩定后COD去除率能夠達到90%以上，脫氮效率超過83.3%.生物膜法具有讓好氧反硝化菌更容易掛膜和固定化的優勢，因此在好氧反硝化菌的污水生物處理應用中占了

22、主導地位，且在諸多實驗室小試中，好氧反硝化菌在生物膜裝置中的脫氮效果都達到了良好的預期，目前實驗研究中也出現了越來越多的適合好氧反硝化的生物膜裝置.生物膜法雖然在實驗室小試中取得了良好的效果，不過由于成本高、調料堵塞問題以及耐沖擊負荷不強等因素，也給好氧反硝化菌的應用帶來了一定困難.5.1.2活性污泥法Pai在稻田沉積物中分離得到一株好氧反硝化菌種，并將其接種到活性污泥中強化污水脫氮，實驗室條件下TN去除率可以達到50%491.Bouchez將分離得到的好氧反硝化菌Microvirgula aerodenitrificans采用海藻酸鈉包埋技術固定化并結合連續流反應器（TR）處理城鎮污水，控制

23、DO濃度在5.3mg/L;流量在5L/d的條件下，該菌可以在反應器中大量繁殖，且在7-37d內氮去除率26.8%.劉雪潔用接種了好氧反硝化菌（假單胞菌屬施氏假單胞菌）的膜生物反應器（sBR）處理含氮廢水，控制條件在c/N為10，DO濃度小于2 mg/L，水力停留時間（HRT）為24h下，運行穩定后COD去除率可以達到100%，TN去除率穩定分布在30%40%之間，平均36.83%.Yang等將分離得到的好氧反硝化菌Acinetobacter junii YB接種到SBR池中處理高氮廢水，采用HRT為24 h、污泥保留時間20 d、每12 h循環的控制條件，并與空白對照組對比，發現接種了好氧反硝

24、化菌的實驗組的NH+4-N去除率相比空白組從93.75%提高到99.71%，TN去除率則從75.89%提高到94.29%.可以看出，好氧反硝化菌應用于活性污泥法處理污水取得了一定效果，不過由于固定化等不足，在實驗室小試中，活性污泥法總的來看比生物膜法在脫氮效果方面略顯不足.由于活性污泥法在大型污水處理方面的優勢，好氧反硝化菌在活性污泥法方面的應用有著更廣闊的前景，需要更進一步研究.5.2河湖原位修復好氧反硝化不僅僅可以運用于污水生物處理，同樣可以適用于河湖原位修復.丁煒等用河道型固定化生物膜反應裝置原位修復微污染水體，投加好氧反硝化菌Pseudomonassp.菌劑后，硝氮積累明顯減少，TN去除率提升10%左右.針對貧營養微污染水源地水質脫氮，黃廷林等發明了揚水曝氣一生物膜組合系統，