1、胡蘿卜愈傷組織懸浮培養體系的建立和胡蘿卜愈傷組織再分化的誘導1學會建立胡蘿卜細胞懸浮培養體系的方法和相關操作。通過胡蘿卜懸浮培養生產胡蘿卜素的整個過程，了解利用植物細胞懸浮（大量）培養技術生產有用次生代謝物這一個技術的主要流程，技術體系和注意事項。學會從愈傷組織誘導細胞再分化的原理和方法。 一、實驗目的2胡蘿卜愈傷組織經過多次繼代，在細胞分裂，細胞形態和分化方面會產生各種變化，合理調節培養基中激素的種類和濃度配比，可以誘導疏松性愈傷組織的產生。利用愈傷組織獲得單細胞或者小細胞團塊，可以建議細胞懸浮（大量）培養的初代培養體系，并在此基礎之上進行培養物的繼代和保持，進行有用次生代謝物的生產。 二、

2、實驗原理植物細胞的懸浮培養3由固體培養轉向液體培養，對細胞而言有什么差別？ 細胞懸浮培養的目的和所需要的條件？一個好的培養體系具備什么樣的特征？4愈傷組織再分化的誘導培養基：MS+2，4-D 0.5mg/L+KT 0.2mg/L 培養條件： ？5三 實驗操作1.懸浮培養體系的建立 愈傷誘導外植體 愈傷繼代單細胞或細胞細胞團塊的獲得液體培養無菌 脫分化細胞分裂、分化調節方法（機械和酶法）細胞活力細胞分裂和生長分化和代謝調節培養基：MS+2，4-D 0.5mg/L+KT 0.5mg/L6做今天實驗之前:前面實驗的觀察和數據收集-胡蘿卜愈傷組織的誘導和生長反應的觀察植物細胞工程實驗部分實驗報告的撰寫

3、7生長反應觀察拍照分析有污染無污染污染源: 細菌,霉菌?現象?原因: 外植體?環境?操作?不生長,發白或死亡愈傷形成不生長,不死亡,也無愈傷形成發生部位顏色質地差異原因?8實驗報告形式內容文字圖片數據分析討論綜合性的一篇論文分開的三次實驗報告不同污染源導致的污染不同生長情況的圖片不同愈傷組織的圖片結構上的完整性術語的正確使用存活率污染率污染原因的分析實驗結果的分析思考和討論9具體操作：8人/組2瓶懸浮培養基/組約1g 細胞/瓶選擇疏松性愈傷組織稱重,計算細胞鮮重的增加(?g )無菌條件下將愈傷組織的細胞輕輕地剝離和分開接種入已預先稱重的液體培養基,接種后再次稱重,獲得細胞的鮮重(1g 左右)單

4、細胞或小細胞團塊懸浮振蕩培養1周或更長收集細胞,分離-提取-純化胡蘿卜素,并測定含量1.懸浮培養102. 再分化誘導8人/組2-3瓶/人建立起來的無菌培養物無菌條件下切割分開接種在分化培養基上適當條件下培養1-3周培養反應的觀察113 胡蘿卜素的分離提取和含量測定懸浮細胞的收集甲醇萃取 -胡蘿卜素乙醚純化 -胡蘿卜素-胡蘿卜素含量的測定12懸浮細胞的收集用紗布/濾紙過濾培養液收集細胞待溶液完全過濾后稱紗布/濾紙和細胞的重量將細胞轉移入圓底燒瓶后再次稱紗布/濾紙重量計算細胞鮮重13甲醇萃取 -胡蘿卜素每克試樣加10ml含10%KOH的甲醇溶液水浴上加熱(64.8度以上)避光回流30min將收集好的細胞放入圓底燒瓶中14乙醚純化去除下層甲醇，保留上層乙醚溶液上清液（約10ml）放入分液漏斗加入150ml乙醚振蕩搖勻，靜止分層倒入蒸餾瓶，蒸去乙醚，殘留物用4-5ml己烷溶解15含量的測定己烷中的-胡蘿卜素在波長452