1、植物淀粉酶活性的測定一、目的：植物中的淀粉酶能將貯藏的淀粉水解成麥芽糖。淀粉酶幾 乎存在于所有植物中，其中以禾谷類種子的淀粉酶活性最強。二、原理：由于淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖，可將 3, 5-二硝基水 楊酸還原成3-氨基-5-硝基水楊酸，在一定范圍內其顏色的深淺與糖 的濃度成正比，故可求出麥芽糖的含量。以單位時間產生麥芽糖的毫 克數表示淀粉酶活性的大小。三、主要實驗材料、儀器和試劑.實驗材料：萌發的小麥（芽長1cm左右）。.試劑：（1） l %淀粉溶液（2） 0.4 M NaOH （3） pH5.6 檸檬 酸緩沖液（4） 3, 5 一二硝基水楊酸（5）麥芽糖標準液四、操作步驟.酶液的提取稱取

2、5g萌發的小麥種子（芽長1cm左右），放入研缽中加1g石 英砂，磨成勻漿倒入50mL容量瓶中，用蒸儲水稀釋至刻度，混合均 勻后在室溫下放置，每隔5min振蕩一次，放置1520min后，3 500 4 000 rpm離心10min,取上清液備用。（注意此處一定留出9mL,用 于酶活性測定!）. （NH4） 2S04分級沉淀粗純化準確計量酶粗提液體積，在攪拌下慢慢加入（NH4） 2S04到30% 飽和度，靜置20min,同上離心。取上清液，量好體積后再加（NH4） 2s04到70%飽和度，靜置20min后同上離心，收集沉淀。將沉淀溶于少量洗脫液中，裝入透析袋透析過夜。2.淀粉酶活性的測定取1步中所

3、提取制備的酶液5mL,放入100mL容量瓶中，用蒸儲 水稀釋到100mL。混合均勻后，取4支試管，2支為對照，2支為測 定管，各加入稀釋之酶液1mL及1mL pH5.6檸檬酸緩沖液。向對照管中加入4mL 0.4M氫氧化鈉，以鈍化酶的活性。將測定管和對照管置40C （0. 5C）恒溫水浴中保溫15min, 再向各管分別加入40c下預熱的淀粉溶液2mL,搖勻，立即放入40c 水浴中準確保溫10min后取出，向各測定管迅速加入4mL 0.4M氫氧 化鈉，以終止酶的活性，然后準備下步糖的測定。3,麥芽糖的測定（1）標準曲線的制作取20mL刻度試管7只，編號，分別加入麥芽糖標準液（1mg/ mL） 0、

4、0,2、0,6、1,0、1,4、1,8、2.0mL,然后用吸管向各管中加蒸 儲水使溶液達2mL,再各加3, 5-二硝基水楊酸試劑2mL,將各管搖 勻，置沸水浴中準確煮沸 5min,取出冷卻至室溫，用蒸儲水定容至 20mL,混合均勻，用分光光度計于 520nm波長下進行比色，記錄光 密度值（OD520）,以光密度值（OD520）為縱坐標，以麥芽糖含量（mg） 為橫坐標繪制標準曲線。表1麥芽糖標準曲線的制作管號1mg/mL麥芽糖標準液 (mL)蒸儲水(mL)DNS (mL)光密度值(OD520nm)00.02.02.010.21.82.020.61.42.031.01.02.041.40.62.0

5、51.80.22.062.00.02.0(2)樣品的測定取以上各管中酶作用后的溶液及對照管中的溶液各2mL,分別放入20mL具塞刻度試管中.再加2mL 3, 5-二硝基水楊酸試劑，將各管搖勻，置沸水浴中準確煮沸 5min,取出冷卻至室溫，再用蒸儲水定容至20mL,混合均勻，用分光光度計在 520nm波長下進行比色， 記錄光密度值(OD520),從表芽糖標準曲線中查出麥芽糖含量 (mg), 然后進行結果計算。4、結果計算淀粉酶總活性(麥芽糖 mg/鮮重g/5min) =(B B.x樣品稀釋總體積(mL)樣品重(g) x CB:在標準曲線上查得的淀粉酶共同水解淀粉生成的麥芽糖量 (mg);B1:在

6、標準曲線上查得的淀粉酶的對照管中麥芽糖量 (mg);C:比色時所用樣品液毫升數。淀粉酶的純化一一凝膠層析一、實驗目的：學習凝膠層析的基本原理，掌握凝膠層析的操作方法。二、實驗原理：凝膠層析也叫分子篩層析或凝膠過濾，它是以多孔性凝膠材料為固定相，按分子大小不同而分離樣品中各個組分的液相層 析方法。分子量大于凝膠孔徑的分子無法進入凝膠顆粒網狀結構內 部，它會從凝膠顆粒的間隙里通過，而分子量小的分子會進入凝膠顆 粒網狀結構內部，因此通過凝膠時比大分子走的路徑要長，受到凝膠 的阻力大，因此小分子流出速度慢，大分子流出速度快，從而將分子 量大小不同的物質分開。葡聚糖凝膠是指由天然高分子葡聚糖與其它交聯劑

7、交聯而成的 凝膠。使用最廣泛的就是由 Pharmacia Biotech生產的Sephadex G系 列。根據交聯度的不同，Sephadex G有一系列產品，具型號主要有 Sephadex G-1Q G-25, G-50, G-75, G-100, G150和 G-200。 三、實驗材料、儀器設備及試劑.實驗材料：透析后的淀粉酶粗酶液.實驗試劑Tris-HCl 緩沖液(pH7.4) (2)固體(NH4) 2s04 (3) Sephadex G-50 四、實驗步驟.凝膠的處理方法：煮沸法.排除氣泡.裝柱(如用G-50,裝柱高度20cm左右)：將層析柱安裝好， 除去柱子底部網膜上的氣泡，關閉下端的

8、止水閥，在柱子中加入 2-3cm高水層，將活化好的凝膠與蒸儲水按照1: 1體積比混成懸浮液，將凝膠懸浮液攪拌均勻后灌入層析柱中，凝膠在重力作用下慢慢沉實，當柱子下端沉實1-2cm左右時，打開止水閥，用玻璃板將柱子 頂部凝膠攪勻，繼續加入凝膠懸浮液，直至凝膠柱沉實到所需高度。 凝膠沉實后，注意保持凝膠頂層要一直有溶液， 在凝膠頂層加一層濾 紙片防止凝膠層破壞。.平衡：在濾紙片上面添加1-2cm高水層，接好層析裝置，調節 流速0.5mL/min ,先用2倍體積蒸儲水平衡洗脫，然后用緩沖液 B平 衡洗滌，直至檢測曲線走平為止。.上樣：平衡過程結束后，將柱子打開，讓凝膠柱面上的溶液自 然流出，當濾紙面

9、水層剛剛沒有時，用滴管吸取透析好的樣品（1-2mL）,加在柱床面上，等樣品進入凝膠后，再加 3-4cm高的緩 沖液，接好洗脫裝置。.洗脫：用緩沖液進行洗脫，控制流速為0.5ml/min,用部分收集器收集洗脫液，紫外檢測器繪制洗脫曲線。.鑒定：對洗脫峰可以進一步進行 SDS電泳鑒定。五、實驗結果與分析：繪制洗脫曲線，分析洗脫峰。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）一、目的：本實驗采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳技術，測定淀 粉酶的相對分子質量。掌握電泳技術的原理、方法、裝置、凝膠配制 等知識，熟悉主要的操作過程。二、原理聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為載體的一種區帶電 泳。這種凝膠是以丙烯酰

10、胺單體（Acr）和交聯劑N, N-甲叉雙丙烯 酰胺（Bis）在催化劑的作用下聚合而成的。Acr和Bis在它們單獨存在或混合在一起時是穩定的， 且具有神經 毒性，操作時應避免接觸皮膚。化學聚合的引發劑是過硫酸鏤（NH4）2S2O3 （Ap）,催化劑是 N, N, N,N-四甲基乙二胺（TEMED）在SDS中，存在三種物理效應，即電荷效應、分子篩效應和濃縮效應。（1）電荷效應：各種酶蛋白按其所帶電荷的種類及數量， 在電場作用下向一定電極，以一定速度泳動。（2）分子篩效應：分子 量小，形狀為球形的分子在電泳過程中受到阻力較小，移動較快；反 之，分子量大、形狀不規則的分子，電泳過程中受到的阻力較大，移

11、 動較慢。（3）濃縮效應：待分離樣品中的各組分在濃縮膠中會被壓縮 成層，而使原來很稀的樣品得到高度濃縮。三、實驗材料、儀器和試劑實驗材料：透析過的淀粉酶粗酶液試劑：貯液配制方法見下表。表1聚丙烯胺凝膠電泳貯液配制方法配制方法分離膠緩沖液，pH8.9（pH8.9 Tris-HCl 緩沖液）濃縮膠緩沖液，pH6.7（pH6.7 Tris-HCl 緩沖液）分離膠丙膠貯液取48 mL 1mol/L HCl , Tris36.8g,用無離子水溶解后 定容至100 mL。取48 mL 1 mol/L HCl , Tris 5.98g,用無離子水溶解后 定容至100 mL。Acr 28.0g, Bis 0.

12、735g,用無離子水溶解后定容至100（Acr-Bis 貯液 R ）mL,過濾除去不溶物，裝入棕色試劑瓶，4c保存。濃縮膠內膠貯液（Acr-Bis 貯液 I ）10%過硫酸俊溶液（Ap）四甲基乙二胺（TEMED）Acr 10g, Bis 2.5g,用無離子水溶解后定容至 100 mL, 過濾除去不溶物，裝入棕色試劑瓶，4 C保存。10g過硫酸俊溶于100 mL無離子水中（當天配制）。原液。7 核黃素溶液核黃素4.0mg,無離子水溶解后定容至100mL。8 電極緩沖液，pH8.3 Tris 6 g,甘氨酸28.8 g,溶于無離子水后定容至1 000 （pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液）mL ,

13、用時稀釋10倍。9 40%蔗糖溶液10 7%乙酸溶液11 樣品提取液，pH8.0（pH8.0 Tris-HCl 緩沖液）12 0.5%澳酚藍溶液蔗糖40 g,溶于100 mL無離子水中。19.4 mL 36%乙酸稀釋至100 mL。Tris 12.1 g,加無離子水1 000 mL,以HCl調節pH 至8.00.5 g澳酚藍溶于100 mL無離子水中。四、操作步驟.貯液配制（1）配好的貯液用棕色瓶盛裝置冰箱內保存，可放 12個月。（2）過硫酸鏤應當天配制。（3）如有不溶物要過濾。（4）顯色液用前再混和。（5）電極緩沖液用時稀釋10倍。.電泳梢的安裝將兩塊玻璃板用去污劑洗凈，再用蒸儲水沖洗，直立

14、干燥（勿用 手指接觸玻璃板面，可用手夾住玻璃板的兩旁操作），然后正確放入 硅膠條中，夾在電泳梢里。（1）按表3比例配制分離膠分離膠緩沖液TEMED無離子水取用量（mL）360.300.0615注：TEMED在灌膠前加。將分離膠沿長玻璃板加入膠室內，小心不要產生氣泡，加至距短 玻璃板頂端3cm處，立即覆蓋2 3mm的水層，靜置待聚合（約 40min）,當膠與水層的界面重新出現時表明膠已聚合。（2）按表4比例配制濃縮膠表4濃縮膠取樣表名稱 濃縮膠緩沖液濃縮內膠TEMED 核黃素溶液 蔗糖取用量（mL）120.0314注：TEMED在灌膠前加。先倒掉分離膠上的水層，立即加入濃縮膠，插入梳子（即樣品梢

15、 模板），待膠凝后，小心取出梳子。將稀釋10倍的電極緩沖液倒入兩 梢中，前梢（短板側）緩沖液要求沒過樣品梢，后梢（長板側）緩沖 液要求沒過電極，備用。.樣品的制備粗酶液以等量40%蔗糖及1/5體積澳酚藍指示劑及SDS混和，加 熱后，留作點樣用。.點樣用微量注射器（50L）吸取少量樣液，在濃縮膠上層點樣，每個 點樣梢1550 wL。點樣時須小心，防止樣品液的擴散。.電泳將電泳梢放入冰箱，接好電源線（前梢為負極）。打開電源開關， 調節電流到20mA左右，樣品進入到分離膠后加大到 30mA,維持恒 流。待指示染料下行到距膠板末端 1cm處，即可停止電泳。把調節 旋扭調至零，關閉電源，電泳約 3h。.

16、剝膠取出電泳膠板，去掉膠套，掀開玻璃，去掉濃縮膠，用玻棒協助 將分離膠放到大培養皿中，用蒸儲水反復沖洗。.染色、記錄結果染色液：考馬斯亮藍 G250染色1小時后，倒掉染色液，重新加 入7%的乙酸溶液脫色，每隔3-4小時更換一次脫色液，觀察記錄酶 譜，繪圖或照相。蛋白質免疫印跡一實驗目的學習蛋白質免疫印跡的基本原理、方法與步驟。二實驗原理Western Blot （蛋白質印跡或免疫印跡）技術，以蛋白質為檢測對 象，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。實驗采用聚丙烯酰胺凝 膠電泳（PAGE）將樣品蛋白質分離，再轉移到固相載體（PVDF尼 龍膜或NC膜）上；固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且保持

17、電 泳分離的多肽類型及其生物學活性不變；然后以固相載體上的蛋白質 或多肽作為抗原，與其對應的抗體（一抗）發生免疫反應，特異性一 抗再與和酶耦聯的第二抗體反應，最后在酶的作用下，導致底物顯色 或化學發光顯影，來檢測電泳分離的特異性目的靶蛋白。蛋白質印跡技術結合了凝膠電泳分辨力高和固相免疫測定特異性 高、敏感等諸多優點，能從復雜混合物中對特定抗原進行鑒別和定量 檢測。三主要試劑. SDS試齊 I。.固相載體：PVDF尼龍膜或NC膜（硝酸纖維素薄膜）。.轉膜緩沖液：甘氨酸 2.9g; Tris 5.8g; SDS 0.37g 甲醇 200ml; 加 ddH2O 定容至 1000ml （48mmol/

18、L Tris HCl, 39mmol/L 甘氨酸， 0.037% SDS）。. PBS-T（pH7.4）: 0.01mol/L PBS-T（NaCl 8.0g;KCl 0.2g;Na2HPO41.44g; KH2PO40.24g）; 1g 吐溫 20,加 ddlO 至 1000m1。.封閉液（5%脫脂奶粉，或者3% BSA,現配）：脫脂奶粉1.0g溶 于20ml的PBS中。.檢測目標蛋白質的一抗，酶聯二抗。.顯色液：二抗上偶聯酶所需要的顯色底物及其緩沖液。四實驗步驟.蛋白質樣品的制備與SDS分離.蛋白質從凝膠轉移到NC膜上（濕潤轉移或者半干式轉移）（1 ）平衡凝膠：用轉膜緩沖液平衡，5minX

19、3次。（2 ）膜處理：將濾紙和NC膜，一同在轉膜緩沖液中浸泡 10min。（3 ）轉膜：a.轉膜裝置從下至上依次按黑色多孔墊板、海綿墊，濾紙、 凝膠、NC膜、濾紙、紅色墊板的順序放好，濾紙、凝膠、 NC膜精 確對齊，每一步去除氣泡，將兩層墊板夾緊。b.將裝備好的夾板置電轉移梢中，NC膜一側靠正極，凝 膠一側靠負極。接通電源，30V過夜，或者80V轉移11.5h。轉移 時間長短依靶蛋白分子量大小來調節。c.轉移結束后，斷開電源將膜取出，割取待測膜條做免疫 印跡。.免疫探測 包括被轉印到膜上的靶抗原與第一抗體（特異抗 體）反應、與酶標第二抗體（抗抗體）反應，以及用酶相應的底物處10 理后進行靶蛋白

20、(抗原)信號檢測。(1)用 PBS-T 洗膜，5minX3 次。(2)加入封閉液(5%脫脂奶粉或3%牛血清白蛋白)，浸泡被 轉印膜，4c過夜，或37 C (平緩搖動)反應13h,以封閉轉印膜 上一些非特異性蛋白質的潛在結合位點，避免非特異性反應。(3)棄封閉液，用PBS-T洗膜，5minX3次，振蕩。(4)將封閉好的轉印膜浸入第一抗體溶液(按合適稀釋比例)中，4c過夜，或者37c反應3h以上，保持平緩搖動。(5)棄一抗，用PBS-T分別洗膜，10minX3次，振蕩。(6)加入辣根過氧化物酶(HP)或者堿性磷酸酯酶(AP)偶 聯的二抗溶液適當稀釋,室溫下反應12h,保持平緩搖動。(7)棄二抗，用

21、PBS-T洗膜，10minX3次，振蕩。.顯色反應利用酶的底物進行顯色，具體操作按照產品說明書進行。 將膜 放入相應顯色劑(DAB)中，避光顯色至出現條帶時放入雙蒸水中終 止反應。五注意事項. 一抗的選擇是影響免疫印跡成敗的主要因素。多克隆抗體結合抗原能力較強、靈敏度高，但易產生非特異性的背景；單克隆抗體識 別抗原特異性較好，但可能不識別在樣品制備時因變性而失去了空間構型的抗原表位，且易發生交叉反應。因此，兼有多克隆抗體和單克 隆抗體優點的混合單克隆抗體近年特別被推薦，它是由一組能與抗原11分子中的不同且不易變性的抗原表位結合并不易出現交叉反應的單 克隆抗體混合構成。.如果反應靈敏度不高，可增

22、加凝膠的厚度到 1.5mm （厚度超過 2.0mm時，凝膠轉移效率受限）；也可在電泳條帶不發生變形的前提 下，盡量提高蛋白樣品的上樣量。.濾紙/凝膠/轉印膜/濾紙夾層組合中不能存在氣泡，可用玻璃棒 在夾層組合上滾動將氣泡趕出，以提高轉膜效率；上下兩層濾紙不能 過大，避免導致直接接觸而引起短路。.如果出現非特異性的高背景，可觀察僅用二抗單獨處理轉印膜 所產生的背景強度，若高背景確由二抗產生，可適當降低二抗濃度或 縮短二抗孵育時間；并考慮延長每一步的清洗時間。. 一抗與二抗的稀釋度、作用時間和溫度對檢測不同的蛋白要求 不同，須經預實驗確定最佳條件。. 一般情況使用0.45區m的NC膜，0.10.2區m的小孔徑膜只 適合于分子量小于20kD的蛋白質。. PVDF尼龍膜較NC膜柔軟、結實、靈敏度高，易于操作且蛋 白質結合能力強（PVDF膜可結合蛋白質480g/cm2,而NC膜只能