1、中國藥品檢驗標準操作規(guī)程2010年版 高效液相色譜法12021/7/20 星期二122021/7/20 星期二1、對儀器的一般要求 所用儀器為高效液相色譜儀，由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器和色譜數據處理系統(tǒng)組成 ，儀器應按現行國家技術監(jiān)督局“液相色譜儀檢定規(guī)程”定期檢定并符合有關規(guī)定。32021/7/20 星期二1.1 色譜柱最常用的色譜柱填充劑為化學鍵合硅膠 。反相色譜系統(tǒng)使用非極性添充劑 ，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠（如氰基鍵合硅烷和氨基鍵合硅烷等）也有使用。正相色譜系統(tǒng)使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜使用離子交換填充劑；分

2、子排阻色譜使用凝膠或高分子多孔微球等填充劑；對映異構體的分離通常使用手性填充劑。 42021/7/20 星期二 填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充，直接影響供試品的保留行為和分離效果。分析分子量小于2000的化合物應選擇孔徑在15nm（1nm=10）以下的填料，分析分子量大于2000的化合物則應選擇孔徑在30nm以上的填料。除另有規(guī)定外，普通分析柱的填充劑粒徑一般在310m之間，粒徑更小（約2m）的填充劑常用于填裝微徑柱（內徑約2mm）。 52021/7/20 星期二 使用微徑柱時，輸液泵的性能、進樣體積、檢測池體積和系統(tǒng)

3、的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也需作適當的調整。當對其測定的結果產生爭議時，應以品種項下規(guī)定的色譜條件的測定結果為準。以硅膠為載體的鍵合固定相的使用溫度通常不超過40，為改善分離效果可適當提高色譜柱的使用溫度，但不宜超過60。 62021/7/20 星期二流動相的PH值應控制在28之間。當pH大于8時，可使載體硅膠溶解；當pH小于2時，與硅膠相連的化學鍵合相易水解脫落。當色譜系統(tǒng)中需使用PH大于8的流動相時，應選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠填充劑、包覆聚合物填充劑、有機-無機雜化填充劑或非硅膠基鍵合填充劑等；當需使用PH小于2的流動相時，應選用耐

4、酸的填充劑，如具有大體積側鏈能產生空間位阻保護作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠填充劑、有機-無機雜化填充劑等。72021/7/20 星期二1.2 檢測器最常用的檢測器為紫外檢測器，包括二極管陣列檢測器，其他常見的檢測器有熒光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、示差折光檢測器、電化學檢測器和質譜檢測器等。82021/7/20 星期二. 紫外、熒光、電化學檢測器為選擇性檢測器，其響應值不僅與待測溶液的濃度有關，還與化合物的結構有關；蒸發(fā)光散射檢測器和示差折光檢測器為通用型檢測器，對所有的化合物均有響應；蒸發(fā)光散色檢測器對結構類似的化合物，其響應值幾乎僅與待測物的質量有關；二極管陣列檢測器可以

5、同時記錄待測物的吸收光譜，故可用于待測物的光譜鑒定和色譜峰的純度檢查。92021/7/20 星期二紫外、熒光、電化學和示差折光檢測器的響應值與待測溶液的濃度在一定范圍內呈線性關系，但蒸發(fā)光散射檢測器響應值與待測溶液的濃度通常呈指數關系，故進行計算時，一般需經對數轉換。102021/7/20 星期二不同的檢測器，對流動相的要求不同。如采用紫外檢測器，所用流動相應符合紫外可見分光光度法（中國藥典2010年版二部附錄 A）項下對溶劑的要求；采用低波長檢測時，還應考慮有機相中有機溶劑的截止使用波長，并選用色譜級有機溶劑。蒸發(fā)光散射檢測器和質譜檢測器通常不允許使用含不揮發(fā)鹽組分的流動相。 112021/

6、7/20 星期二1.3 流動相反相色譜系統(tǒng)的流動相首選甲醇-水系統(tǒng)（采用紫外末端波長檢測時，首選乙腈-水系統(tǒng)），如經試用不合適時，再選用其他溶劑系統(tǒng)。應盡可能少用含有緩沖液的流動相，必須使用時，應盡可能選用含較低濃度緩沖液的流動相。由于C18鏈在水相環(huán)境中不易保持伸展狀態(tài)，故對于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動相中有機溶劑的比例通常應不低于5%，否則C18鏈的隨機卷曲將導致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。 122021/7/20 星期二各品種項下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組成、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱內徑、長度、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組成的比例、柱

7、溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變，以適應供試品并達到系統(tǒng)適用性試驗的要求。其中，調整流動相組分比例時，以組分比例較低者（小于或等于50%）相對于自身的改變量不超過30%且相對于總量的改變量不超過10%為限，如30%相對改變量的數值超過總量的10%時，則改變量以總量的10%為限。 132021/7/20 星期二對于必須使用特定牌號的填充劑方能滿足分離要求的品種，可在該品種項下注明。142021/7/20 星期二2、系統(tǒng)適用性試驗色譜系統(tǒng)的適用性試驗通常包括理論板數、分離度、重復性和拖尾因子等四個參數。其中，分離度和重復性尤為重要。 按各品種項下要求對色譜系統(tǒng)進行適用性試驗，即用規(guī)定的對

8、照品溶液或系統(tǒng)適用性試驗溶液在規(guī)定的色譜系統(tǒng)進行試驗，必要時，可對色譜系統(tǒng)進行調整，以符合要求。152021/7/20 星期二2.1 色譜柱的理論板數(n)。 用于評價色譜柱的分離效能。由于不同物質在同一色譜柱上的色譜行為不同，采用理論板數作為衡量柱效能的指標時，應指明測定物質，一般為待測組分或內標物質的理論板數。在規(guī)定的條件下，注入供試品溶液或各品種項下規(guī)定的內標物質溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分峰或內標物質峰的保留時間t R（以分鐘或長度計，下同，但應取相同單位）和峰寬（W）半峰高寬（Wh/2 ），按n16(t R/W)2或n=5.54(tR/Wh/2)2計算色譜柱的理論板數。1620

9、21/7/20 星期二2.2 分離度（R） 用于評價待測組分與相鄰共存物或難分離物質之間的分離程度，是衡量色譜系統(tǒng)效能的關鍵指標。可以通過測定待測物質與已知雜質的分離度，也可以通過測定待測組分與某一添加的指標性成分（內標物質或其他難分離物質）的分離度，或將供試品或對照品用適當的方法降解，通過測定待測組分與某一降解產物的分離度，對色譜系統(tǒng)進行評價與控制。 無論是定性鑒別還是定量分析，均要求待測峰與其他峰、內標峰或特定的雜質對照峰之間有較好的分離度。除另有規(guī)定外，待測組分與相鄰共存物之間的分離度應大于1.5。 172021/7/20 星期二2.3 重復性 用于評價連續(xù)進樣后，色譜系統(tǒng)響應值的重復性

10、能。采用外標法時，通常取各品種項下的對照品溶液，連續(xù)進樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標準偏差應不大于2.0；采用內標法時，通常配制相當于80、100和120的對照品溶液，加入規(guī)定量的內標溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別至少進樣2次，計算平均校正因子，其相對標準偏差也應不大于2.0。 182021/7/20 星期二2.4 拖尾因子（T） 用于評價色譜峰的對稱性。為保證分離效果和測量精度，應檢查待測峰的拖尾因子是否符合各品種項下的規(guī)定。拖尾因子計算公式為： TW0.05h/2d1式中, W0.05h 為5%峰高處的峰寬；d1為5%峰高出峰頂點至峰前沿之間的距離。除另有規(guī)定外，峰高法定

11、量時T應在0.951.05之間。峰面積法測定時，若拖尾嚴重，將影響峰面積的準確測量。必要時，應在各品種項下對拖尾因子做出規(guī)定。192021/7/20 星期二3、測定法 3.1 內標法 按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和內標物質，分別配成溶液，精密量取各適量，混合配成校正因子測定用的對照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量對照品和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算校正因子 校正因子（）（AS/CS）/(AR/CR) 式中 ,AS 為內標物質的峰面積或峰高；AR為對照品的峰面積或峰高；CS為內標物質的濃度；CR為對照品的濃度。202021/7/20 星期二 再取各品種項下含有內標物質的

12、供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算含量： 含量（CX）AX/(ASCS) 式中,Ax為供試品峰面積或峰高； CX為供試品的 濃度；AS為內標物質的峰面積或峰高；CS為內標物質的濃度；為較正因子。 采用內標法，可避免因樣品前處理及進樣體積誤差對測定結果的影響。 212021/7/20 星期二3.2 外標法按各品種項下的規(guī)定，精密稱(量)取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品溶液和供試品溶液中待測成分的峰面積（或峰高），按下式計算含量： 含量（CX）CR(AX/AR) 式中各符號意義同上。由于微量注射

13、器不易精確控制進樣量，當采用外標法測定供試品中某成分或雜質含量時，以定量環(huán)或自動進樣器進樣為好。222021/7/20 星期二3.3 加校正因子的主成分自身對照法 測定雜質含量時，可采用加校正因子的主成分自身對照法。在建立方法時，按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取雜質對照品和待測成分對照品各適量，配制測定雜質校正因子的溶液，進樣，記錄色譜圖，按上述3.1法計算雜質的校正因子。此校正因子可直接載入各品種項下，用于校正雜質的實測峰面積。這些需作較正計算的雜質，通常以主成分為參照，采用相對保留時間定位，其數值一并載入各品種項下。 232021/7/20 星期二 測定雜質含量時，按各品種項下規(guī)定的雜質

14、限度，將供試品溶液稀釋成與雜質限度相當的溶液作為對照溶液，進樣，調節(jié)儀器靈敏度（以噪音水平可接受為限）或進樣量（以柱子不過載為限），使對照溶液的主成分色譜峰高約達滿量程的1025或其峰面積能準確積分【通常含量低于0.5%的雜質，峰面積的相對標準偏差（RSD）應小于10%；含量在0.5%2%的雜質，峰面積的RSD應小于5%；含量大于2%的雜質，峰面積的RSD應小于2%】。然后，取供試品溶液和對照品溶液適量，分別進樣，供試品溶液的記錄時間，除另有規(guī)定外，應為主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峰面積，分別乘以相應的校正因子后與對照溶液主成分的峰面積比較，依法計算各雜質含量。2

15、42021/7/20 星期二3.4 不加校正因子的主成分自身對照法 測定雜質含量時，若沒有雜質對照品，也可采用不加校正因子的主成分自身對照法。同上述3.3法配制對照溶液并調節(jié)檢測靈敏度后，取供試品溶液和對照溶液適量，分別進樣，前者的記錄時間除另有規(guī)定外，應為主成分保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峰面積并與對照溶液主成分的峰面積比較，計算雜質含量。252021/7/20 星期二若供試品所含的部分雜質未與溶劑峰完全分離，則按規(guī)定先記錄供試品溶液的色譜圖，再記錄等體積純溶劑的色譜圖。色譜圖上雜質峰的總面積（包括溶劑峰），減去色譜圖上的溶劑峰面積，即為總雜質峰的校正面積。然后依法計算。2

16、62021/7/20 星期二3.5 面積歸一法按各品種項下的規(guī)定，配制供試品溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量各峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計算各峰面積占總峰面積的百分率。用于雜質檢查時，由于峰面積歸一化法測定誤差大，因此，通常只用于粗略考察供試品中的雜質含量。除另有規(guī)定外，一般不宜用于微量雜質的檢查。272021/7/20 星期二4、注意事項4.1 流動相的制備與保存用高純度的試劑配制流動相，必要時照紫外-可見分光光度法進行溶劑檢查，應符合要求；水應為新鮮制備的高純水，可用超純水器制得或用重蒸水。凡規(guī)定pH值的流動相，應使用精密pH計進行調節(jié)，除另有規(guī)定外，偏差一般不

17、超過0.2pH單位。配制好的流動相應通過適宜的0.45m（或0.22m)濾膜濾過，以除去雜質微粒。流動相用前必須脫氣，否則容易在系統(tǒng)內逸出氣泡，影響泵的工作、色譜柱的分離效率、檢測器的靈敏度以及基線穩(wěn)定性等。282021/7/20 星期二流動相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯等容器內，不能貯存在塑料容器中。因許多有機溶劑如甲醇、乙腈等可浸出塑料表面的增塑劑，導致流動相受污染。貯存溶劑一定要蓋嚴，以防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相引起pH值變化，對分離或分析結果帶來誤差。磷酸鹽、醋酸鹽緩沖液容易發(fā)霉變質，應盡量新鮮配制使用。如確需貯存，可在冰箱內冷藏，并在3天內使用，用前應重新濾

18、過。292021/7/20 星期二4.2 溶劑的配制與保存除另有規(guī)定外，采用規(guī)定溶劑配制對照品溶液和供試品溶液，定量測定時，對照品溶液和供試品溶液均應分別配制兩份。供試品溶液在注入液相色譜儀前，一般應經適宜的0.45m（或0.22m)濾膜濾過，以減少對色譜系統(tǒng)產生污染或影響色譜分離。應根據試驗要求和供試品的穩(wěn)定性，設置待測溶液的貯存條件（如溫度、遮光等）。302021/7/20 星期二4.3 色譜柱的使用與保存根據實驗要求和流動相的pH值范圍，參照色譜柱說明書，選用適宜的色譜柱。安裝色譜柱時應使流動相流路的方向與色譜柱標簽上箭頭所示方向一致。除另有規(guī)定外，不宜反向使用，否則會導致色譜柱柱效明顯

19、降低，無法恢復。進樣前，色譜柱應用流動相充分沖洗平衡。經色譜系統(tǒng)適用性試驗測試，應符合要求。色譜柱在使用過程中，應避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者機械震動都會影響柱內定相的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內填料，因此在調節(jié)流動相流速時應該緩慢進行。312021/7/20 星期二試驗結束后，可按色譜柱的使用說明書，對色譜柱進行沖洗和保存。一般來講，對于反相色譜柱，如使用緩沖液或含鹽溶液作為流動相，在試驗結束后，應用10倍柱體積（如150mm柱長，約15ml）的低濃度的甲醇/乙腈-水溶液（10%20%）沖洗，使色譜柱內的鹽完全溶解洗脫出，再用較高濃度的甲醇/乙腈-

20、水溶液（50%）沖洗，最后用高濃度的甲醇/乙腈-水溶液（80% 100%）沖洗，使色譜柱中的強吸附物質沖洗出來。如色譜柱需長期保存，反相柱可以貯存于甲醇或乙腈中，正相柱可以貯存于經脫水處理后的正己烷中，離子交換柱可以貯存于含5%甲醇或含0.05%疊氮化納的水中，并將色譜柱兩端密封，以免干燥，室溫保存。322021/7/20 星期二4.4 流動相的調整為滿足色譜柱系統(tǒng)適用性要求，試驗中有時需要調整流動相組分的比例。在調整流動相組分比例時，以組分比例較低者（小于或等于50%）相對改變量不超過30%且絕對改變量不超過10%為限，如30%相對改變量的數值超過10%時，則改變量以10%為限。下面舉例說明

21、。332021/7/20 星期二4.4.1 二元流動相系統(tǒng)例1 兩組分比例為50：50 按上述原則，50%的最大相對該變量為15%，已超過了絕對改變量允許的范圍，故該流動相比例調節(jié)的范圍是10%，即40：60至60:40。例2 兩組分比例為2:98 按上述原則，2%的最大相對改變量為0.6%，故該流動相比例調節(jié)的范圍是1.4:98.6至2.6:97.4。342021/7/20 星期二4.4.2 三元流動相系統(tǒng)例3 三組分比例為60:35:5 按上述原則，可每次調節(jié)流動相系統(tǒng)中比例較低的兩個組分。對于35%的組分，其最大相對改變量為10.5%，已超過了絕對該變量允許的范圍，故該組分比例調節(jié)的范圍

22、是10%，即25% 45%，則流動相系統(tǒng)比例的調節(jié)范圍是50:45:5至70:25:5。對于5%的組分，其最大相對改變量為1.5%，該組分比例調節(jié)的范圍是1.5%，即3.5% 6.5%，則流動相系統(tǒng)比例的調節(jié)范圍是58.5:35:6.5至61.5:35:3.5。352021/7/20 星期二4.5 雜質檢查時色譜參數的設置在進行雜質檢查時，選擇適宜的檢測靈敏度和設定適宜的積分參數非常重要。國內藥品質量標準中，通常制備與雜質限度相當濃度的對照溶液，用以調節(jié)檢測靈敏度，使對照溶液的主成分色譜峰高達滿量程的10% 25%，再進行供試品溶液的測定，以峰面積計算單個雜質量和總雜質量。目前國內色譜數據處理系統(tǒng)大致有積分儀和色譜工作站兩種