1、細(xì)胞工程育種之花藥離體培養(yǎng)季定根植保1001一般是離體培養(yǎng)花粉處于單核時(shí)期（小孢子）的花藥。通過培養(yǎng)使它離開正常的發(fā)育 途徑（即形成成熟花粉最后產(chǎn)生精子的途徑）而分化成為單倍體植株，這是目前獲得單倍 體植株的主要方法。大體上要經(jīng)過制備培養(yǎng)基、接種花藥和培養(yǎng)三步驟。途徑：由花粉長成單倍體一般有兩條途徑。一是由花粉脫分化形成愈傷組織（即分化 程序很低的薄壁細(xì)胞團(tuán)），再由愈傷組織再分化出根和芽，最后形成植株。二是由花粉分 裂形成胚狀體（不是由合子發(fā)育成的胚叫胚狀體），再由胚狀體長成植株。當(dāng)瓶中花藥內(nèi) 長出的小苗達(dá)到一定大小時(shí)，應(yīng)調(diào)節(jié)溫度、濕度及光照等條件，使幼苗得到鍛煉并逐步適 應(yīng)自然的環(huán)境條件，然

2、后從試管中移出種植于土壤中，進(jìn)行一般的栽培和管理；或?qū)⑿纬?的胚狀體包裹人工種皮，制成人工種子。與單倍體育種差異：花藥離體培養(yǎng)是一種組織培養(yǎng)技術(shù)，其過程是：把花粉發(fā)育到 一定階段的花藥，通過無菌操作技術(shù)，接種在人工培養(yǎng)基上進(jìn)行離體培養(yǎng)；花粉在培養(yǎng) 基所提供的特定條件下可以發(fā)生多次分裂，形成類似胚胎的構(gòu)造（胚狀體）或愈傷組織； 誘導(dǎo)愈傷組織分化出芽和根，最后長成植株。單倍體育種是一種育種方法，其過程是： 在花藥離體培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，用秋水仙素繼續(xù)處理單倍體幼苗，使染色體數(shù)目加倍，重新恢 復(fù)為二倍數(shù)。因?yàn)樗鼈兊亩稊?shù)染色體是由單倍數(shù)染色體本身加倍而來的，所以都是純系， 自交后代不會發(fā)生性狀分離，因此在

3、育種上有很高的應(yīng)用價(jià)值。由此可知，花藥離體培養(yǎng)與單倍體育種關(guān)系密切花藥離體培養(yǎng)是單倍體育種的首 要環(huán)節(jié)，但兩者的步驟和結(jié)果是不同的。花藥離體培養(yǎng)得到的植株不一定是單倍體，其原因還得從花藥的結(jié)構(gòu)和培育過程談 起。花藥是花的雄性器官，包括體細(xì)胞性質(zhì)的藥壁和藥隔組織，以及雄性性細(xì)胞的花粉粒。 按染色體的倍性來看，前者為二倍體細(xì)胞，后者為單倍體細(xì)胞。在離體培養(yǎng)過程中，由于 花藥愈傷組織的多倍化、核融合、花藥壁和花絲等二倍體體細(xì)胞參與愈傷組織的形成、愈 傷組織染色體的變化等因素，導(dǎo)致培養(yǎng)中有非單倍體植株出現(xiàn)。那些起源于花藥壁、藥隔 或花絲細(xì)胞的植株，其染色體倍數(shù)應(yīng)與提供花藥的植株一樣，完全可能是二倍體。

4、花藥與花粉培養(yǎng)有較大差異。花藥離體培養(yǎng)是把花粉發(fā)育到一定階段的花藥接種到培 養(yǎng)基上，來改變花藥內(nèi)花粉粒的發(fā)育程序，使其分裂形成細(xì)胞團(tuán)，進(jìn)而分化成胚狀體，形 成愈傷組織，由愈傷組織再分化成植株。花粉離體培養(yǎng)是指把花粉從花藥中分離出來，以 單個(gè)花粉粒作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)的技術(shù)，由于花粉已是單倍體細(xì)胞，誘發(fā)它經(jīng)愈傷組 織或胚狀體發(fā)育而成的植株都是單倍體，且不受花藥的藥隔、藥壁、花絲等體細(xì)胞的干擾。 花藥離體培養(yǎng)屬器官培養(yǎng)，花粉離體培養(yǎng)屬細(xì)胞培養(yǎng)，但花藥離體培養(yǎng)和花粉離體培養(yǎng)的 目的一樣，都是要誘導(dǎo)花粉細(xì)胞發(fā)育成單倍體細(xì)胞，最后發(fā)育成單倍體植株。花藥離體培 養(yǎng)相對較容易，技術(shù)比較成熟，但最后需要對培

5、養(yǎng)成的植株進(jìn)行染色體倍數(shù)檢測；花粉離 體培養(yǎng)盡管不受花藥壁、藥隔等二倍體細(xì)胞的干擾，但這種特殊單倍體細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)難 度較大，目前只在少數(shù)植物上獲得成功。花藥離體馀秋水仙素是單倍體實(shí)驗(yàn)的兩步驟。植物組織培養(yǎng)是將離體的植物器官或組 織在一定條件下培養(yǎng)成胚狀體或植株幼苗，所以花藥離體培養(yǎng)屬于植物組織培養(yǎng)。一般的 組織培養(yǎng)是利用體細(xì)胞所以后代與親代之間性狀非常相似，在不考慮細(xì)胞質(zhì)遺傳的情況下 幾乎完全隨親本，是無性生殖，故可看作一種克隆技術(shù)。花藥離體培養(yǎng)中由于培養(yǎng)材料是花藥，其本質(zhì)是培養(yǎng)精細(xì)胞（屬于生殖細(xì)胞，雄配子） 所以新的幼苗細(xì)胞核遺傳物質(zhì)是親本的一半，可看作有性生殖中的特殊類型（單性生殖）。所

6、以從技術(shù)上看兩者有包含關(guān)系從生殖上看，要根據(jù)培養(yǎng)材料確定是有性生殖還是無性生殖。花藥離體培養(yǎng)在育種中的重要應(yīng)用價(jià)值：（1）通過對所獲得的單倍體植株進(jìn)行染色體加倍，便可獲得純合二倍體，可縮短育 種所需年限。（2）利用單倍體及其細(xì)胞進(jìn)行誘變育種，無論是發(fā)生顯性還是隱性突變，均可在當(dāng) 代表現(xiàn)出來，便于鑒定和選擇，然后將發(fā)生有利突變的個(gè)體進(jìn)行染色體加倍，即可獲得遺 傳性穩(wěn)定的純合植株，從而加速育種進(jìn)程。（3）利用單倍體植株的組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體作為外源基因轉(zhuǎn)化的受體，有利于 外源基因的整合表達(dá)。花粉單倍體育種研究成果:玉米花藥離體培養(yǎng)研究離體條件下小孢子的發(fā)育途徑。在離體條件下，由于改變了花粉原來的生

7、活環(huán)境，花粉的正常發(fā)育途徑受到抑制，由一 次分裂形成的花粉粒不再像正常發(fā)育過程中那樣由生殖核再分裂一次形成兩個(gè)精子核，花 粉萌發(fā)形成花粉管進(jìn)行正常的受精。在玉米的花藥和小孢子培養(yǎng)過程中，離體的小孢子沿 著不同的途徑進(jìn)行發(fā)育，大體上可以概括如下：小孢子核不進(jìn)行第一次不均等分裂，也不 分化成一個(gè)營養(yǎng)核和一個(gè)生殖核。而是第一次分裂形成兩個(gè)相同的核，并且都繼續(xù)分裂， 最后發(fā)育成多核結(jié)構(gòu)。小孢子核進(jìn)行第一次不均等分裂，并分化成一個(gè)較大的營養(yǎng)核和一 個(gè)較小的生殖核。營養(yǎng)核開始進(jìn)行對稱的分裂，并發(fā)育成一個(gè)多核的胚狀體。在花藥培養(yǎng) 過程中，這是一條最主要的途徑等。營養(yǎng)核也能進(jìn)行不對稱的分裂，但這樣形成的多核體

8、 沒有細(xì)胞壁的形成，也沒有進(jìn)一步的發(fā)育。胚狀體由生殖核發(fā)育而成。通過這種途徑產(chǎn) 生的多細(xì)胞胚狀結(jié)構(gòu)所含細(xì)胞較小，而且與由營養(yǎng)核發(fā)育而成的結(jié)構(gòu)相比，其細(xì)胞核的染 色更深。在離體的小孢子培養(yǎng)過程中，這是一條主要途徑等。營養(yǎng)核和生殖核互相融合并 形成一個(gè)大的小孢子，這個(gè)小孢子有一個(gè)較大的核，沒有液泡。根據(jù)調(diào)查，在玉米花藥培 養(yǎng)過程中，大約89%被誘導(dǎo)的小孢子屬于這種模式。但這種結(jié)構(gòu)不再繼續(xù)發(fā)育成多核體或 多細(xì)胞體$營養(yǎng)核和生殖核都開始分裂，并且各自獨(dú)立發(fā)育，最后形成含有兩種不同類型 細(xì)胞的胚狀體，即含有核染色較淺的大細(xì)胞和核染色較深的小細(xì)胞。這種情況不經(jīng)常發(fā)生。花藥培養(yǎng)的一般程序當(dāng)玉米尚處于孕穗期時(shí)

9、，將未成熟的雄穗取下，一般需經(jīng)過一段 時(shí)期的冷處理。花藥接種前預(yù)先用醋酸洋紅溶液等染液壓片鏡檢，以確定花粉發(fā)育時(shí)期， 并找出花粉時(shí)期與幼穗大小、顏色等特征之間的相應(yīng)關(guān)系。將小孢子發(fā)育單核中晚期和雙 核早期的花藥取下，放入誘導(dǎo)培養(yǎng)基。約二十一至二十八天后，可觀察到胚狀體。胚狀體 轉(zhuǎn)入再生培養(yǎng)基，產(chǎn)生小植株。經(jīng)過染色體加倍，產(chǎn)生雙單倍體。然后經(jīng)自交產(chǎn)生雙單倍 體種子。此外，還有另一條途徑，即用胚狀體來誘導(dǎo)可再生的愈傷組織。培養(yǎng)基一般要含 較高濃度的脯氨酸。把愈傷組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上便可產(chǎn)生再生植株，與經(jīng)胚狀體直接 再生的相同。這種途徑的優(yōu)點(diǎn)有：同一塊愈傷組織可產(chǎn)生幾棵植株，如果自交不能進(jìn)行， 可以采用近親授粉。染色體加倍方便。但由于增加了愈傷組織階段，使離體培養(yǎng)