1、人參皂甙Rg1對腦缺血再灌注大鼠pJNK表達的影響【摘要】 目的 探討人參皂甙Rg1對腦缺血再灌注大鼠腦組織c-jun N-末端激酶（pJNK）表達的影響及其意義。方法將大鼠隨機分為假手術組、單純缺血再灌注組、人參皂甙Rg1 10、20、40 mg/kg組、尼莫地平1 mg/kg組，采用大腦中動脈閉塞法建立腦缺血再灌注模型,應用免疫組織化學方法檢測腦組織缺血再灌注4h后pJNK的表達。 結果 人參皂甙Rg1各劑量組大鼠腦組織pJNK表達陽性率分別為(23.896.77), (15.194.59), (9.154.77)，均低于單純缺血再灌注組 (27.158.46)。結論 人參皂甙Rg1防治大

2、鼠腦缺血再灌注損傷的機制可能與抑制腦組織pJNK表達有關，且以高劑量效果較好。 【關鍵詞】 人參皂甙Rg1 腦缺血再灌注 pJNK 大鼠Abstract: Objective To discuss the effects of Ginsenoside Rg1 on the expressions of JNK in the rats brain tissue after focal cerebral ischemia-reperfusion and its significance. Methods Rats were divided into the sham-operative group

3、, Model group, Ginsenoside Rg1 groups of 10 mg/kg, 20 mg/kg, 40mg/kg, and Nimodipine group of 1 mg/kg at random. The method of middle cerebral artery occlusion (MCAO) in rats was adopted to establish the model of cerebral ischemia-reperfusion, and then the expressions of JNK after cerebral ischemia-

4、reperfusion 6 h was tested based on the chemical method in immunity tissue. Results The positive rate of expression of rats brain tissue in each of the Ginsenoside Rg1 groups is (23.896.77), (15.194.59), (9.154.77) respectively. Conclusions The results showed that the mechanism of Ginsenoside Rg1 to

5、 protect the brain cells from damage after cerebral ischemia-reperfusion injury may be associated with JNK expression to inhibit brain tissue, and it was more effective when Ginsenoside Rg1 was in high-dose Key words:Ginsenoside Rg1; cerebral ischemia-reperfusion; JNK；rat研究表明，人參皂甙Rg1能通過抑制細胞凋亡對腦缺血再灌注

6、損傷發揮保護作用，但其抗凋亡的機制還不十分清楚1。絲裂原蛋白激酶信號通路(mitogen activated protein kinases，MAPKs)是腦缺血再灌注損傷中主要的信號通路，它包括5個亞家族，其中c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNKs)亞家族主要參與細胞凋亡的調控。本實驗擬采用免疫組織化學方法檢測腦缺血再灌注后大鼠海馬CA1區神經元pJNK的表達，并觀察人參皂甙Rg1對pJNK蛋白表達的影響，以明確人參皂甙Rg1是否通過JNK信號通路來抑制腦缺血再灌注后的神經元凋亡。 1 材料與方法1.1 實驗動物分組與給藥方法 Sprage-Daw

7、l大鼠，雄性（以排除雌激素影響），體重為250300 g，隨機分為6組：假手術組；單純缺血再灌注組；人參皂甙Rg1給藥組（10、20、40 mg/kg）；尼莫地平藥物對照組（1 mg/kg）；每組5只大鼠。組分別于術前5 d至取材當日腹腔注射人參皂甙Rg1、尼莫地平，其余各組分別注射等量等滲生理鹽水，1 次/d。1.2 藥品及試劑 人參皂甙Rg1(純度95%)購自吉林大學有機化學教研室；尼莫地平注射液(批號為071001)，購自山西亞寶藥業；其它藥品均為國產分析純，由遼寧醫學院科學實驗中心提供。1.3 大鼠右側局灶性腦缺血(MCAO)模型的制備 10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉，采

8、用改良線栓法2制備大鼠局灶性腦缺血模型。線栓采用頭端光滑燙圓的直徑0.23 mm魚線，長度由右側頸外動脈分叉部計約（18.50.5）mm。栓塞2 h后，將魚線輕輕拔出并縫合皮下筋膜及皮膚，即為再灌注模型，再灌注時間為4 h。1.4 免疫組織化學染色及圖像分析 MCAO術后6 h，將各組大鼠麻醉，4% 多聚甲醛灌流固定，斷頭取腦，梯度酒精脫水，定向石蠟包埋切片，厚5 m。切片常規脫蠟至水，免疫組化Envision法染色：3% 過氧化氫溶液處理15 min以去除內源性過氧化物酶；然后采用pH6.0 枸椽酸緩沖液高壓修復抗原，自然冷卻至室溫后；滴加1200 稀釋的pJNK單克隆抗體4 孵育過夜；然后

9、滴加辣根酶標記羊抗兔多聚體（PV6001）37 孵育30 min。每步驟之間用0.01 M PBS洗3 次，每次5 min。DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。陰性對照用PBS替代一抗2。pJNK蛋白陽性定位于神經元的細胞核，呈棕黃色。 采用CIAS-1000 型細胞圖像分析系統進行陽性細胞計數。每例標本等間隔選取切片3 張，每張切片隨機選取右側海馬CA1區2 個不重疊高倍視野(400 倍)，計數每個視野下細胞總數及陽性細胞數量，計算表達陽性率=（陽性細胞數/細胞總數）%3。1.5 統計學分析 應用SPSS10.0軟件分析，所有數據均用s表示。多組間差異顯著性檢

10、驗采用單因素方差分析及兩兩比較的q檢驗。 2 結果2.1 pJNK蛋白免疫組織化學定性、定位表達 假手術組大鼠大腦右側海馬CA1區偶見神經元胞核染色；單純缺血再灌注組可見大量陽性細胞，與假手術組比較有顯著差異(P0.05)；人參皂甙各組和陽性對照藥尼莫地平組能顯著降低MCAO大鼠海馬CA1區的pJNK陽性細胞數，與單純缺血再灌注組比較有顯著性差異(P0.05)；人參皂甙Rg1 10、40 mg/kg組與陽性對照藥尼莫地平1 mg/kg組比較均有顯著性差異(P0.05)，見表1，圖1。表1 各組大鼠MCAO術后6h右側海馬CA1區pJNK表達陽性率比較（略）注：與假手術組比較，aP0.05；與單

11、純缺血再灌注組比較，bP0.05；與尼莫地平1 mg/kg組比較，cP0.05；與人參皂甙Rg1 10 mg/kg組比較，dP0.05；與人參皂甙Rg1 20 mg/kg組比較，eP0.05 3 討論 研究表明，腦缺血時組織低氧可使細胞發生壞死或凋亡。JNK家族是MAPK家族成員之一，與細胞凋亡有密切聯系4。不論是短暫性還是永久性缺血損傷，JNK信號轉導通路在神經元中都被激活，從而發揮重要的作用5-6。Wang ZQ等利用大腦中動脈永久栓塞(MCAO)模型，證實腦缺血或缺血再灌注后損傷中心腦區JNK的激活主要在損傷后30 min6 h，以神經元為主，在損傷中心區和半暗帶區磷酸化的JNK顯著增多

12、7-8。 JNK主要表達于胞質內，核內也有少量表達。JNK一旦被激活，稱為pJNK，立即從細胞質移位至細胞核，并可引起級聯反應，導致其一些作用底物相應激活。首先，pJNK通過對c-Jun氨基末端63與73位的絲氨酸進行有效的磷酸化而激活c-Jun?；罨腸-Jun可以聚合成二聚體而形成可以活化的蛋白-1(AP-1)復合物，這種復合物通過與其靶DNA結合相結合激活下級基因而發揮其抗凋亡作用9。 本實驗結果顯示：假手術組有少量pJNK陽性細胞；與假手術組比較，單純缺血再灌組大鼠海馬CA1區神經元可見大量pJNK陽性細胞，差異有統計學意義(P0.05)，這一實驗結果與以往文獻報道基本一致；人參皂甙R

13、g1三個劑量組與單純缺血再灌注組比較，pJNK的表達明顯減少，提示人參皂甙Rg1具有抑制腦缺血再灌注大鼠pJNK的作用。人參皂甙Rg1 各組分別與陽性對照藥尼莫地平組比較，人參皂甙Rg1 10 mg/kg組雖能抑制神經元pJNK的表達，但與陽性對照藥尼莫地平組比較仍顯著性差異(P0.05)，此結果提示人參皂甙Rg1中、高劑量組的效果在抑制pJNK蛋白表達方面具有與尼莫地平相似的效果。本結果提示人參皂甙Rg1具有抑制pJNK蛋白表達的作用，但其能否通過抑制JNK信號通路減少腦缺血再灌注損傷引起的神經元凋亡，以發揮其對缺血性腦損傷的保護作用尚需進一步證實?！緟⒖嘉墨I】 1 王海波，李源莉. 人參皂

14、甙Rg1神經保護作用的研究進展J. 白求恩軍醫學院學報，2008，6（5）：291-293.2 張銘,司少艷,韓瑞剛，等.免疫組化SP法與PicTureTM兩步法的比較J. 診斷病理學雜志，2004,11(1):58-59.3 王鳳巖,夏潮涌. 組織原位腫瘤細胞DNA含量與倍體分析的某些方法學問題J.中華病理學雜志，2000,29(5):381-382.4 Farrokhnia N, Roos MW, Ternt A，et al. Differential early mitogen-activated protein kinase activation in hyperglycemic is

15、chemic brain injury in the ratJ. Eur J Clin InvestJ. 2005，35(7):457-463.5 Ginet V, Puyal J, Magnin G, et al. Limited role of the c-Jun N-terminal kinase pathway in a neonatal rat model of cerebral hypoxia-ischemiaJ. J Neurochem，2009,108(3):552-562.6 Borsello T, Clarke PG, Hirt L，et al.A peptide inhi

16、bitor of c-Jun N-terminal kinase protects against excitotoxicity and cerebral ischemiaJ.Nat Med，2003，9(9)：1180-1186.7 Repici M, Centeno C, Tomasi S, et al. Time-course of c-Jun N-terminal kinase activation after cerebral ischemia and effect of D-JNKI1 on c-Jun and caspase-3 activationJ. Neuroscience，2007,150(1):40-49.8 Ferrer I, Friguls B, Dlafo E, et al.Early modifications in the expression of mitogen-activated protein kinase(MAPK/ERK),sterss-activated kinases SAPK/JNK and p38,and their phosphorylated substrates following focal cerebra